CN103642903B - 摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用 - Google Patents

摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTP mixture和引物的混合制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液；本发明试剂盒仅一步PCR便可准确、快速地鉴定摩氏摩根菌；与传统分离鉴定方法相比，该方法操作简便，省时省力，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU/mL，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的检测操作。

Description

摩氏摩根菌快速检测试剂盒及应用
（一）技术领域
本发明涉及人兽鱼共患病原菌的鉴别诊断，基于PCR方法，建立摩氏摩根菌的快速检测技术，即摩氏摩根菌快速检测试剂盒及检测方法。
（二）背景技术
摩氏摩根菌（Morganella morganii）属于肠杆菌科摩根菌属，广泛分布于土壤、污水、人和动物的肠道等。摩氏摩根菌为条件致病菌，主要感染呼吸道、尿道及伤口，引起人的脓毒症、肺炎、中枢神经症状、心包炎、绒毛膜羊膜炎、腹膜炎等，甚至引起人的大范围溶血而导致急性死亡，是重要的医院继发性感染致病菌。摩氏摩根菌还可感染多种养殖动物，如海狸鼠、袋鼠、猪、鸡以及锦鲤、蛇、鳖、龟、鼋等水生动物，引起皮肤溃烂、肌肉出血、肺淤血、肺脓肿、肾出血、炎症等病变，并具有致死性。随着摩氏摩根菌感染的不断上升趋势，给人类健康、养殖业发展与公共卫生均造成了巨大的威胁，摩氏摩根菌已成为一种重要的人兽鱼共患病原菌，日益受到各有关方面的关注。因此。亟需建立可准确、快速鉴定该菌的方法。
目前，国内外对摩氏摩根菌的检测技术研究较少，仍主要依赖于传统分离鉴定方法（如生化反应等），不仅操作繁琐、费时、费力，而且存在灵敏度不高和试验结果差异大等弊端。PCR技术因其具有特异与灵敏的特点，在病原检测领域具有越来越重要的地位。基于PCR反应的摩氏摩根菌鉴定方法虽有少量探索，但离实际应用于大批量样本的日常检测仍有较大距离，迄今尚无可用的快速检测方法。本发明将通过对引物的选择、检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、简便、快速的多重PCR检测试剂盒，以期填补上述的空白。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种准确、灵敏、简便、快速的摩氏摩根菌检测试剂盒及方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液，所述稀释液为高压灭菌双蒸水；所述引物序列为：
M1-F：CTCGCACCATCAGATGAACCCATA
M1-R：CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。
进一步，所述冻存管A内冻干粉是将混合液先在-80℃超低温冰箱预冻10h，再放入冻干机（干燥箱压力0.03MPa)，温度设为-40℃（升华干燥阶段）持续冻干30h，除去90%以上水分；之后温度升至25℃进行解析干燥2h（升温速率为1.5℃/min），使水分含量达到5%（质量浓度）以下，获得冻干粉；所述每4.4μL混合液组成为：Taq DNA聚合酶0.3μL，10×buffer2.5μL，dNTP mixture0.6μL，浓度均为50μM的引物M1-F、M1-R各0.5μL，所述dNTP mixture由终浓度均为10mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。
进一步，所述裂解液终浓度组成为：体积浓度4%Triton-X100，5mg/mLNaN3，1mol/L Tris，pH值8.0，溶剂为蒸馏水，配制方法：Triton-X1004mL，NaN3（终浓度5mg/mL）500mg，Tris（终浓度1mol/L）12.114g，用10M氢氧化钠水溶液调pH至8.0，蒸馏水定容至100mL。
进一步，所述阳性对照液为摩氏摩根菌阳性对照液（溶剂是双蒸水，pH是7），所述阳性对照缓冲液为摩氏摩根菌参考株ATCC25830接种在BHI培养基中，37℃培养过夜后，取菌液100℃煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成阳性对照液。
进一步，所述PCR反应管根据待检样品量定，通常试剂盒内所述PCR反应管为100～300个。
进一步，优选所述试剂盒有100个PCR反应管（满足100次PCR反应的用量），所述冻存管A内冻干粉的用量以冻干前混合液体积计为440μL，所述冻存管B内装有1mL裂解液，所述冻存管C内装有0.5mL阳性对照液，所述冻存管D内装有1mL稀释液（通常冻存管D内的稀释液是一次性加入冻存管A，供100次PCR反应用）各个冻存管内装样量根据PCR反应管个数定，每次PCR反应需要25μL反应液，即冻存管D内稀释液与冻存管A内冻干粉混悬制备的混悬液10μL、裂解液10μL、对照液或待检样品5μL，稀释液与冻干粉冻干前的混合液体积比为25:11。
本发明还提供一种利用所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒检测摩式摩根菌的方法，所述方法按如下步骤进行：
（1）将冻存管D中稀释液加至冻存管A中，重悬、混匀，获得混悬液，存放于-20℃备用（PCR反应前先在室温解冻）；所述冻存管A内冻干粉用量以冻干前混合液体积计，所述冻存管D中稀释液与混合液体积比25:11；
（2）将冻存管B中的裂解液分别加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照液加入对照PCR反应管，将待检样品加入待检PCR反应管，混合均匀，然后将步骤（1）冻存管A中的混悬液加入各个PCR反应管，立即进行PCR扩增；所述待检样品为待检菌株接种于BHI培养基，37℃振荡培养过夜，取菌液100℃煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用高压灭菌双蒸水重悬，制成待检样品；所述冻存管B中裂解液与冻存管A中混悬液体积比为1:1，所述冻存管B中裂解液与冻存管C中阳性对照液体积比为2:1，所述冻存管B中裂解液与待检样品体积比为2:1；所述BHI培养基按BHI培养基标准配法，即3.7gBHI粉溶于100mL蒸馏水，高压灭菌）；
（3）将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃预热3min；94℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环；72℃保持5min；
（4）将扩增后的产物在质量浓度1%琼脂糖凝胶与0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取数据并记录；
（5）结果判定：检测后，待检样品与阳性对照液同时扩增出809bp条带的为摩氏摩根菌阳性；阳性对照液出现条带而待检样品无条带的为摩氏摩根菌阴性；待检样品与阳性对照液均无条带或待检样品出现条带而阳性对照液无条带的需重新检测并判定。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明提供一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，该试剂盒仅一步PCR便可准确、快速地鉴定摩氏摩根菌；与传统分离鉴定方法相比，该方法操作简便，省时省力，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU/mL，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的检测操作。
（四）附图说明
图1为凝胶电泳图，其中：
A中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker，泳道1为摩氏摩根菌阳性对照品，泳道2为待检样品（阳性）。
B中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker，泳道1为摩氏摩根菌阳性对照品，泳道2为待检样品（阴性）。
C中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker，泳道1为摩氏摩根菌阳性对照品（未见条带），泳道2为待检样品（阴性）。
D中泳道M为2000bp DNA Ladder Marker，泳道1为摩氏摩根菌阳性对照品（未见条带），泳道2为待检样品（阳性）。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1摩式摩根菌快速检测试剂盒
一、试剂盒组成
A管为冻干粉，冻干粉含量以冻干前混合液体积计，供100次PCR反应的混合液为440μL，将混合液先在-80℃超低温冰箱预冻10h，再放入冻干机（干燥箱压力0.03mPa)，温度设为-40℃（升华干燥阶段）持续冻干30h，除去90%以上水分，之后温度升至25℃进行解析干燥2h（升温速率为1.5℃/min），使水分含量达到5%以下，获得冻干粉；每4.4μL混合液含有Taq DNA polymerase（市购）0.3μL，10×buffer（市购）2.5μL，dNTP mixture（市购）0.6μL（由终浓度均为10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的构成），浓度均为50μM的引物（上海英骏生物技术有限公司合成）M1-F、M1-R各0.5μL。保存于-20℃。
B管含有1mL溶液，为裂解液，配制方法：Triton-X1004mL，NaN3（终浓度5mg/mL）500mg，Tris（终浓度1mol/L）12.114g，用10M氢氧化钠水溶液调pH至8.0，蒸馏水定容至100mL，保存于-20℃。
C管含有0.5mL溶液，为摩氏摩根菌阳性对照液，溶剂为水，pH为7，保存于-20℃。
D管含有1mL溶液，为稀释液（即高压灭菌双蒸水），保存于4℃。
所述引物序列为：
M1-F：CTCGCACCATCAGATGAACCCATA
M1-R：CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。
PCR反应管100个。
二、加样及检测步骤说明
（1）将冻存管D中1mL稀释液加至冻存管A（冻存管A内混合液冻干前体积为440μL），重悬、混匀制成混悬液，存放于-20℃备用；
（2）分别将冻存管B中的裂解液10μL加入PCR反应管（每管10μL裂解液），分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照溶液5μL加入对照PCR反应管，将待检样品5μL加入待检PCR反应管，混合均匀，将步骤（1）冻存管A中的混悬液10μL加入上述各个PCR反应管，立即进行PCR扩增；所述待检样品为待检菌株接种于BHI培养基，37℃振荡培养过夜，取菌液离心弃去上清液，取沉淀用高压灭菌双蒸水重悬，制成待检样品液；
（3）将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪（Life Technologies，Veriti）上进行扩增：95℃3min；94℃1min，62℃45s，72℃50s，30个循环；72℃5min；
（4）将扩增后的产物在质量浓度1%琼脂糖凝胶与0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色（市购）后用凝胶成像系统（上海天能4500SF）读取、分析结果。
实施例2摩式摩根菌快速检测试剂盒的应用
下面通过试验对本发明的使用效果进行论证和描述。
1材料与方法
1.1菌株及培养
以摩氏摩根菌ATCC25830（购自美国典型微生物保藏中心（ATCC））为参考株，分离出的30株摩氏摩根菌（表1，编号是为了便于表述，编号本身没有含义）经Vitek方法与16S rRNA序列分析进行菌种鉴定，由本实验室保存。其他67种细菌（参考株购自ATCC菌株库，分离株编号是为了便于表述，编号本身没有含义）作为阴性对照菌，亦由本实验室保存（详见表1）。各菌株接种于5mL BHI(DIFCO)培养基（Oxoid,Hampshire,England），37℃振荡培养过夜，备用。
1.2PCR体系建立
1.2.1引物筛选
采用比较基因组学方法，并参照相关文献，对细菌16S rRNA基因区域内保守区和可变区进行比对分析，设计1对引物M1-F、M1-R。引物序列详见表2。
1.2.2PCR反应体系及条件
通过PCR体系及条件的优化，确定多重PCR反应体系为：10×TaqBuffer(含Mg2＋)2.5μL，dNTP mixture0.6μL（由终浓度均为10mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP的构成），终浓度均为50μM的引物M1-F、M1-R各0.5μL，Taq DNA polymerase0.3μL，阳性对照液5μL或待检样品5μL，裂解液10μL，加ddH2O补足体积至25μL；反应条件为：95℃3min；94℃1min，62℃45s，72℃50s，30个循环；72℃5min。产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
1.2.3PCR产物测序鉴定
将PCR产物割胶回收，克隆到pMD18-T载体，转化入DH5α，提取质粒后鉴定，阳性克隆子送至上海英骏生物技术有限公司测序。序列经NCBI BLAST对比，以确证片段为目的条带。
1.2.4特异性试验
以其他67种细菌（表1）作为阴性对照，以双蒸水作为空白对照，用建立的PCR方法进行扩增。
表1摩氏摩根菌及阴性对照菌株
表2引物序列及产物长度
1.2.5灵敏性试验
摩氏摩根菌代表菌株ATCC25830在BHI（Oxoid,Hampshire,England）中37℃过夜培养后，取1mL菌液离心并用PBS（0.01M,pH7.2）重悬，调整菌液浓度至108CFU/mL(OD600约为0.2)，作10倍连续梯度稀释。选取10-5、10-6、10-7、10-8稀释度进行平板计数，并取各稀释度的菌液进行PCR检测。
1.3水产品相关分离株鉴定
对来自华东地区的300份水生动物样品进行细菌分离、纯化。分离株均用本试剂盒进行菌种鉴定，并同时进行16S rRNA序列分析。当上述两种方法出现结果分歧时，加做vitek（法国梅里埃）测定。
1.4加样及检测步骤
1.4.1将冻存管D中1mL稀释液加至冻存管A，重悬、混匀，获得混悬液，存放于-20℃备用；
1.4.2分别将冻存管B中的裂解液10μL加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照溶液5μL加入对照PCR反应管，将待检样品5μL加入待检PCR反应管，混合均匀，将步骤（1.4.1）冻存管A中的混悬液10μL加入上述各个PCR反应管，立即进行PCR扩增；
1.4.3将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃3min；94℃1min，62℃45s，72℃50s，30个循环；72℃5min；
1.4.4将扩增后的产物在1%琼脂糖凝胶与0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取、分析结果。
2结果
2.1试剂盒检测结果
利用本试剂盒对摩氏摩根菌进行扩增，可得到809bp的清晰条带（图1中A）。
2.2PCR产物的测序鉴定
PCR扩增产物经测序与BLAST比对后，结果显示，扩增条带序列与目的基因区域序列的同源性大于99%，表明该PCR方法具有较高的准确性。
2.3特异性试验
利用本试剂盒分别对67种其他细菌进行扩增，结果显示无任何条带，表明该方法具有良好的特异性。
2.4灵敏性试验
利用本试剂盒对各稀释度的摩氏摩根菌菌液进行检测，当含有102CFU/mL数量级以上细菌时，均可扩增得到相应的目的条带，表明该方法扩增摩氏摩根菌的灵敏性可达102CFU/mL。
2.5水产品相关分离株鉴定及种别确证
在300株水产品相关分离株中，通过本试剂盒的鉴定，25株为摩氏摩根菌（8.33%）；16S rRNA序列分析与本试剂盒检测结果的符合率为88%（22/25），分歧出现在：3株16S rRNA序列分析结果为变形杆菌的菌株在试剂盒测定中为摩氏摩根菌。通过vitek确证试验，结果均支持试剂盒结果。以上结果证实基于PCR技术的快速检测试剂盒具有较高的稳定性。

Claims (7)

1.一种摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C和冻存管D，所述冻存管A内装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10×buffer、dNTPmixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C装有阳性对照液，冻存管D装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述引物序列为：
M1-F：CTCGCACCATCAGATGAACCCATA
M1-R：CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG。
2.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述冻存管A内冻干粉的制备方法为：将混合液在-80℃预冻10h，再在-40℃冻干30h，然后以1.5℃/min的速率升温至25℃干燥2h使水分含量达到5％以下，获得冻干粉；所述每4.4μL混合液组成为：Taq DNA聚合酶0.3μL，10×buffer2.5μL，dNTP mixture 0.6μL，浓度均为50μM的引物M1-F、M1-R各0.5μL，所述dNTP mixture由终浓度均为10mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。
3.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述裂解液终浓度组成为：体积浓度4％Triton-X100，5mg/mL NaN3，1mol/L Tris，pH值8.0，溶剂为蒸馏水。
4.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照液为摩氏摩根菌阳性对照液。
5.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述PCR反应管为100～300个。
6.如权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒有100个PCR反应管，所述冻存管A内冻干粉的用量以冻干前混合液体积计为440μL，所述冻存管B内装有1mL裂解液，所述冻存管C内装有0.5mL阳性对照液，所述冻存管D内装有1mL稀释液。
7.一种非疾病诊断与治疗用途的利用权利要求1所述摩氏摩根菌快速检测试剂盒检测摩式摩根菌的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：
(1)将冻存管D中稀释液加至冻存管A中，重悬、混匀，获得混悬液，存放于-20℃备用；所述冻存管A内冻干粉用量以制备冻干粉前的混合液体积计，所述冻存管D中稀释液与混合液体积比25:11；
(2)分别将冻存管B中的裂解液加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待测PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照液加入对照PCR反应管，将待检样品加入待测PCR反应管，混合均匀，然后将步骤(1)冻存管A中的混悬液加入各个PCR反应管，立即进行PCR扩增；所述待测样品是将待测菌株接种于BHI培养基，37℃振荡培养过夜，取菌液100℃煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬制备而成；所述冻存管B中裂解液与冻存管A中混悬液体积比为1:1，所述冻存管B中裂解液与冻存管C中阳性对照液体积比为2:1，所述冻存管B中裂解液与待测样品体积比为2:1；
(3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增：95℃预热3min；94℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸50s，30个循环；72℃保持5min；
(4)将扩增后的产物在质量浓度1％琼脂糖凝胶与0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统读取数据并记录；
(5)结果判定：检测后，待检样品与阳性对照液同时扩增出809bp条带的为摩氏摩根菌阳性；阳性对照液出现条带而待检样品无条带的为摩氏摩根菌阴性；待检样品与阳性对照液均无条带或待检样品出现条带而阳性对照液无条带的需重新检测并判定。
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