CN103642767B - 一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用 - Google Patents

一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103642767B
CN103642767B CN201310473741.7A CN201310473741A CN103642767B CN 103642767 B CN103642767 B CN 103642767B CN 201310473741 A CN201310473741 A CN 201310473741A CN 103642767 B CN103642767 B CN 103642767B
Authority
CN
China
Prior art keywords
methylerythritol
phosphate acyltransferase
isoprene
cytidine phosphate
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310473741.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103642767A (zh
Inventor
咸漠
曹玉锦
刘炜
王纪明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Original Assignee
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS filed Critical Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority to CN201310473741.7A priority Critical patent/CN103642767B/zh
Publication of CN103642767A publication Critical patent/CN103642767A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103642767B publication Critical patent/CN103642767B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/0706—2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase (2.7.7.60)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和/或第20位由Arg突变为Lys，将突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶与大肠杆菌原有的MEP途径结合，构建了高效合成异戊二烯的工程菌株，利用该菌株进行发酵生产异戊二烯。重组菌异戊二烯合成能力较原始菌株提高1.5倍以上。

Description

一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，以及利用该突变体构建重组菌发酵生产异戊二烯的方法。
背景技术
异戊二烯又名2-甲基-1,3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，易自身聚合，也易与其它不饱和化合物共聚合，因此，异戊二烯是一种重要的合成橡胶单体。在工业上，可被齐格勒-纳塔催化剂催化聚合合成聚异戊橡胶，即天然橡胶；异戊二烯还可以用作合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能。此外，异戊二烯在农药、医药、香料及粘结剂等领域也有广泛的应用。
目前，异戊二烯的主要来源是石油裂解精馏，是碳五馏分的重要组分。碳五馏分组成复杂，直接精馏难以得到纯度较高的异戊二烯产品，通常采取萃取精馏及共沸精馏法由裂解碳五馏分中分离高纯度异戊二烯，增加了异戊二烯的生产成本。除碳五馏分分离得到异戊二烯外，工业上还采用合成法生产；例如采用碳五以下的有机原料，如丙烯、异丁烯、甲醛、丙酮和乙炔来合成。随着石化资源的枯竭，研究者们开始寻找新的异戊二烯生产方法，利用微生物转化可再生的生物质资源生成异戊二烯，因其可再生型和对环境友好型，是一条具有潜在应用前景的途径。
生物体内有两条途径合成异戊二烯，MVA途径和MEP途径。MVA途径存在于真核生物及古细菌中，而MEP途径主要存在于植物质体、真菌和各种细菌中。到目前为止，采用生物法合成异戊二烯的最有产量是通过MVA途径实现的，美国的Genercor公司在工程大肠杆菌中利用MVA途径进行异戊二烯合成，最高产量可以达到60g/L以上（美国发明专利：2009/0203102）；通过MEP途径合成异戊二烯的报道产量目前都还比较低（Zhaoetal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2011,90(6):1915-22）。然而，与MVA途径相比，MEP途径具有更高的理论产量，其产量较低推测是由于该途径中的关键酶活性不高的原因造成的。
2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化MEP生成2-甲基-4-二磷酸胞苷赤藓糖醇（CDP-ME）（图1），是MEP途径中的关键反应。在大肠杆菌中，该酶是一个同源二聚体，由ispD基因编码，其结构已经得到了解析（Kempetal.,ActaCrystallographicaSectionD,2003,59:607）。本发明通过采用易错PCR技术对该酶进行定点突变，获得了改性的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶，并整合到完整的MEP途径中，在发酵水平提高了异戊二烯的产量。
发明内容
本发明提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala。
本发明提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第20位由Arg突变为Lys。
本发明提供了一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，是2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala，第20位由Arg突变为Lys。
本发明采用易错PCR的手段对大肠杆菌的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶进行突变，并结合下游合成β-胡萝卜素的途径进行筛选，获取了较之大肠杆菌（EscherichiacoliK-12MG1655）原始2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化活性明显提高的酶。
所述2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明专利还提供了采用2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体增强大肠杆菌合成异戊二烯能力的方法。
利用突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶提高异戊二烯合成能力的方法还包括：（a）将突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体连接原核表达载体；（b）将该表达载体导入大肠杆菌感受态细胞与大肠杆菌已有的MEP途径相整合；（c）利用导入该2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶的重组大肠杆菌发酵合成异戊二烯。
本发明所提供的利用突变后的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶提高异戊二烯合成能力的宿主细胞，优选大肠杆菌（EscherichiacoliBL21(DE3)）。
有益效果：
1）本发明所制备的提供的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，导入大肠杆菌中后，所获得的工程菌株其异戊二烯合成能力较原始菌株提高1.5倍以上，该结果有望推动生物法制备异戊二烯工业化的进程。
2）本发明是针对异戊二烯合成途径单一关键酶进行的改造，可以与合成途径中其它酶进行整合，并对其它酶的改造提供指导作用，从而有望进一步提高异戊二烯的合成能力。
3）本发明所提供的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，其作用不仅仅限于提高异戊二烯的合成能力。该突变体对于异戊二烯合成途径下游的各种萜类化合物的合成理论上同样具有促进作用，有可能应用于其它高附加值产品的合成。
附图说明
图12-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶催化的反应
图2pEASY-ispD载体图谱
图3ispD基因突变子与原始基因序列的比对
图4异戊二烯气相色谱检测
具体实施方式
实施例1：
大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因（ispD）的克隆，具体过程如下：
以寡核苷酸5’-CATGCCATGGCAACCACTCATTTGGATG-‘3和5’-CCGGAA TTCTTATGTATTCTCCTGATGGATGG-‘3为引物，以大肠杆菌的总DNA为模版，采用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增出2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因，PCR体系和条件如下所示：
采用凝胶回收试剂盒（购自OmegaBio-tek）对扩增片段进行电泳回收，然后连接到pEASY-Blunt载体（购自北京全式金生物技术有限公司）上：
在微量离心管中配制下列溶液：
25℃反应30min，全量加入至50μl大肠杆菌感受态细胞中，冰中放置30min。42℃热击90s后，再在冰中放置1分钟，加入890μl的SOC培养基，37℃振荡培养60min，在含有Amp抗性的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；采用PCR扩增法鉴定阳性克隆，得到重组质粒pEASY-ispD（图2）。
实施例2：
大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因（ispD）的随机突变，具体过程如下：
以实施例1中构建得到的重组质粒pEASY-ispD为模板，进行易错PCR扩增，扩增引物与实施例1中相同，PCR体系和条件如下所示：
PCR体系：
对扩增后的片段进行电泳回收，然后用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别对PCR产物和pET30a空质粒（购自Novagen公司）进行酶切，酶切条件如下：
将上述PCR产物及载体酶切后的产物进行电泳回收，然后进行连接反应，连接体系及反应条件如下：
连接体系：
连接条件：16℃连接反应过夜。
连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自Invitrogen）感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性的平板上筛选阳性克隆，得到ispD基因的突变文库。
实施例3：
大肠杆菌2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因ispD突变体催化活性的筛选，具体步骤如下：
从实施例2中的ispD基因突变文库中提取pET-ispD重组质粒，并转化携带有pAC-BETA质粒（表达β-胡萝卜素合成酶，由本实验室保藏，参见刘敏等,武汉科技大学学报,2013,36(3):214-218）的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组工程菌BL21/pET-ispD&pAC-BETA。对不同突变子的上述工程菌采用LB培养基进行液体培养至菌液OD600达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导重组蛋白的表达和β-胡萝卜素的合成，诱导24h后，离心收集细胞，并用去离子水洗涤。菌体细胞用1ml丙酮重悬后，置于黑暗条件下55℃孵育15min。再次离心收集含有β-胡萝卜素的丙酮上清液。提取液中的β-胡萝卜素含量通过其在480nm的吸光度测定，比较不同ispD基因突变子的β-胡萝卜素产量，对其中β-胡萝卜素含量明显增加（分别提高2.1倍和2.7倍）的两个突变子的序列进行分析，经鉴定分别在Pro13位和Arg20位发生了突变（图3）。
实施例4
利用突变的2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因工程大肠杆菌提高异戊二烯的合成能力：
采用碱裂解法分别提取表达两个ispD突变子以及表达原始ispD基因的重组质粒，转化携带有pYJM8（表达异戊二烯合成酶，由本实验室保藏，参见Yangetal.,BioresourceTechnology,2012,104:642-647）的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组工程菌BL21/pET-ispD&pYJM8。采用LB培养基对上述工程菌在厌氧瓶中进行液体培养至OD600达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导重组蛋白的表达和异戊二烯的合成，诱导24h后，取发酵液上层空气进行气相色谱检测，结果如图4所示，A为对照表达未突变的ispD基因的工程菌；B为表达Pro13→Ala突变子的工程菌；C为表达Arg20→Lys突变子的工程菌。异戊二烯的保留时间约为1.8min。采用外标法计算不同菌株的异戊二烯产量，表达Pro13→Ala突变子的菌株异戊二烯产量达到了27.3μg/L，表达Arg20→Lys突变子的菌株异戊二烯产量达到了32.5μg/L，而表达原始ispD基因的对照菌株异戊二烯产量仅为10.8μg/L，这表明这两个位点的突变对于异戊二烯合成均有较好的促进作用。
为了考察Pro13→Ala和Arg20→Lys同时突变的突变体对异戊二烯合成的影响，我们进一步采用EasyMutagenesisSystem试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）将Pro13→Ala突变子的20位Arg突变成Lys，然后将双突变子导入到合成异戊二烯的工程菌中，结果表明，异戊二烯的产量可进一步提高到37.2μg/L。

Claims (3)

1.一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为将2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala，所述2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为将2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala和第20位由Arg突变为Lys，所述2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.一种发酵生产异戊二烯的方法，其特征在于，步骤如下：
1)将2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体连接原核表达载体，所述突变体为SEQIDNO.1所示氨基酸序列第13位由Pro突变为Ala或第13位由Pro突变为Ala同时第20位由Arg突变为Lys，所述原核表达载体，为质粒pET30a；
2)将步骤1)得到的表达载体转化携带有pYJM8质粒的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，与大肠杆菌BL21(DE3)已有的MEP途径相整合；
3)利用导入该2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体的重组大肠杆菌发酵合成异戊二烯。
CN201310473741.7A 2013-10-12 2013-10-12 一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用 Active CN103642767B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310473741.7A CN103642767B (zh) 2013-10-12 2013-10-12 一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310473741.7A CN103642767B (zh) 2013-10-12 2013-10-12 一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103642767A CN103642767A (zh) 2014-03-19
CN103642767B true CN103642767B (zh) 2016-04-13

Family

ID=50248054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310473741.7A Active CN103642767B (zh) 2013-10-12 2013-10-12 一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103642767B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN85102250A (zh) * 1985-04-01 1987-01-17 中国科学院长春应用化学研究所 异戊二烯在稀土催化剂作用下的本体聚合
CN87101272A (zh) * 1986-12-24 1988-07-27 联合碳化公司 生产二烯烃的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN85102250A (zh) * 1985-04-01 1987-01-17 中国科学院长春应用化学研究所 异戊二烯在稀土催化剂作用下的本体聚合
CN87101272A (zh) * 1986-12-24 1988-07-27 联合碳化公司 生产二烯烃的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kinetic analysis of Escherichia coli 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate Cytidyltransferase,wild type and mutants,reveals roles of active site amino acids;Stephane B. Richard等;《Biochemistry》;20040928;第43卷(第38期);12189-12197 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103642767A (zh) 2014-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jiang et al. Manipulation of GES and ERG20 for geraniol overproduction in Saccharomyces cerevisiae
CN103243065B (zh) 一种生产法尼烯的菌株及其应用
US8715962B2 (en) Production of geranyl diphosphate
CN103215315B (zh) 利用蓝藻生产异戊二烯
CN103243066B (zh) 一种生产番茄红素的菌株及其应用
CN104031872A (zh) 一种产异戊二烯基因工程菌及其应用
CN103232986B (zh) 一种异戊二烯生产方法
CN101748069B (zh) 一种重组蓝藻
JP5405030B2 (ja) 組換え大腸菌及びそれを用いたイソプレノイドの製造方法
CN105647845B (zh) 一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌及应用
CN113388560B (zh) 合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法
CN104789512B (zh) 异戊二烯的生产菌以及生产异戊二烯的方法
CN104726435A (zh) 一种β-葡萄糖苷酶突变体、其重组表达质粒及转化的工程菌株
CN103642767B (zh) 一种2-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶突变体及其应用
CN105296513B (zh) 一种海洋酯酶及其编码基因e22与应用
CN111607546B (zh) 一种高产法尼烯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN107849586B (zh) 芳香化合物的生产
CN104372031A (zh) 一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用
KR20160045001A (ko) D-갈락토오스로부터 아이소프렌을 생산하는 능력을 가지는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 아이소프렌을 생산하는 방법
CN115704038A (zh) 一种基因、重组载体、工程菌及其应用
CN109486835B (zh) 一种源于蓝藻的产烷烃关键基因突变子及其应用
CN112941003A (zh) 一种双酶偶联全细胞催化马来酸合成l-丙氨酸的方法
CN103898149B (zh) 一种利用蛋白支架提高大肠杆菌中异戊二烯合成的方法
KR20210047992A (ko) 알파-휴물렌 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도
CN104164457A (zh) 一种利用新mva途径合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant