CN103642711B

CN103642711B - 一种产高光学纯度l-乳酸的干酪乳杆菌及其发酵方法

Info

Publication number: CN103642711B
Application number: CN201310474231.1A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 邹慧斌; 刘炜; 程涛
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2013-10-12
Filing date: 2013-10-12
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2033-10-12
Also published as: CN103642711A

Abstract

本发明公开了一种产高光学纯度L-乳酸的干酪乳杆菌及其发酵方法，是以野生型干酪乳杆菌ZW-63A为出发菌株，采用紫外诱变和硫酸二乙酯（DES）诱变,通过诱变手段获得了一株产高光学纯度L-乳酸的干酪乳杆菌突变菌株。所述的该突变菌株在摇瓶水平上，经过96h的乳酸发酵后，L-乳酸产量为140g/L，L-乳酸光学纯度为98.83%。

Description

一种产高光学纯度L-乳酸的干酪乳杆菌及其发酵方法

技术领域

本发明涉及一种产高光学纯度L-乳酸的干酪乳杆菌及其发酵方法。

背景技术

干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）属于乳杆菌属，是革兰氏阳性菌，不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，最适生长温度为37℃，G+C含量为45.6%～47.2%，菌体长短不一，两端成方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。

由于发酵法生产L-乳酸，虽然产量大，但是L-乳酸的光学纯度低，所以通过紫外诱变和DES诱变来提高L-乳酸的光学纯度是一个经济可行的方法。如何培育出一株高光学纯L-乳酸的突变菌株，能够解决用发酵法L-乳酸光学纯度低的缺点，以此来弥补上述缺陷。

发明内容：

本发明提供一种干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCCNo.8029，分类命名为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述干酪乳杆菌生产L-乳酸的光学纯度高达98.83。

本发明还提供了一种所述干酪乳杆菌的应用，是用CGMCCNo.8029发酵生产L-乳酸。

所述发酵生产L-乳酸的优选培养基组成如下：葡萄糖、酵母粉、乙酸钠、磷酸盐、甜菜碱和微量元素液。

更进一步，优选培养基组成为(g/100mL)：葡萄糖16，酵母粉1，乙酸钠0.2，KH₂PO₄0.1，甜菜碱0.2，MgSo₄·7H₂O0.02，MnSO₄·H₂O0.005，CaCO₃10。

上述干酪乳杆菌的接种量优选为10%。

上述发酵温度优选为37℃，摇床培养时间优选为72h。

本发明的优点在于：

1、通过诱变方法对干酪乳杆菌进行改造，方法简单、诱变成本低，L-乳酸光学纯度高达98.83%。

2、诱变后所获得菌株使得运用发酵法生产高光学纯度的L-乳酸成为可能，有利于降低发酵成本。

3、发酵稳定性较好，经过多次发酵生产，其L-乳酸的产酸能力和纯度比较稳定，不发生较大程度的下降。

附图说明

图1CGMCCNo.8029发酵生产L-乳酸光学纯度色谱图。

具体实施方式

本发明采用MRS培养基组成（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二胺2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，吐温-801.0，pH值5.7±0.2，于118℃灭菌25min。YE培养基：15g酵母粉，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，酵母粉和葡萄糖分别灭菌，冷却后混合，固体YE培养基中加入1.5%琼脂，2%CaCO₃(CaCO₃与培养基分开灭菌)。

L-乳酸光学纯度测定条件：采用SumichiralOA-50004.6mm×150mm手性分离柱，流动相为2mmol/LCuSO₄5%异丙醇，流速为1mL/min,柱温35℃，紫外检测波长236nm。

L-乳酸含量的测定：先将发酵结束后的发酵液混匀，移取发酵液100uL稀释到500倍，10000/min离心1min，用生物传感分析仪测定，将三个平行的摇瓶实验测定后取其平均值。

菌体浓度的测定：先将发酵过后的发酵液室温静置30min，移取上清液100uL稀释50倍，利用分光光度计在波长600nm处测定菌体OD值，将三个平行的摇瓶实验测样后取其平均值作为OD值的测定结果，发酵液中总的OD值为OD₆₀₀×稀释倍数。

实施例1：野生型干酪乳杆菌的生长曲线的绘制

将野生型干酪乳杆菌ZW-63A为出发菌株从-80℃取出，用灭过菌的牙签挑取之后划线到YE平板上，37℃恒温培养2d，用牙签挑取单克隆接种到3mL的液体无菌MRS培养基中过夜培养，以1%的接种量转接到100mL的灭过菌的液体MRS培养基中，菌种采用先静置12h再振荡培养的方式进行培养，菌种培养期间每隔2h测定一次OD值，将菌液稀释到一定浓度后，稀释过后控制OD值在0.1～0.9之间，用紫外分光光度计在600nm处测定菌体OD值，设定三个平行重复实验，以保证结果的可信度。由野生型干酪乳杆菌的生长曲线图可以看出当菌种生长至20h时菌体OD值达到最大，随后进入稳定期，菌体培养至18h时菌种处于对数生长期的旺盛时期，一次选取菌种培养至18h时停止培养，对其开始下一步的诱变。

实施例2：紫外诱变选育L-乳酸高光学纯度菌株

首先紫外诱变时的菌液稀释浓度，先将培养至18h的菌种放置冰上10min，然后在4℃的条件下5000r/min离心5min，弃上清，用灭过菌的0.9%的生理盐水洗涤，在4℃的条件下5000r/min离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次。最后用100mL灭过菌的超纯水溶解菌体，充分使菌体混匀。移取100uL的菌液依次稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍，每个稀释倍数设置两个平行重复的平板，每个稀释的梯度都取100uL涂布到YE平板上，放在37℃恒温培养2d，然后计算单菌落个数。

挑取菌落数在200～300之间的浓度稀释倍数作为紫外诱变稀释的倍数，通过对结果计算得菌液稀释至10^-5的平板上菌落数在200～300之间，确定菌体稀释浓度之后，再确定紫外诱变时间，诱变的时间梯度设置为：0、10、20、30、40、50、60s，每个梯度设置两个平行，计算每个诱变时间的存活率，当诱变时间为60s时，存活率为34.23%，接近于30%的存活率，此时诱变正突变率高，所以最后诱变时间选取60s作为最适诱变时间。

确定好紫外诱变稀释浓度和诱变时间之后，在菌液稀释10^-5倍和紫外线照射60s的条件下进行诱变，上述所有的紫外诱变操作都是先将菌液涂布到平板上然后再进行紫外灯照射。

紫外诱变后，在37℃恒温培养2d之后，长出单克隆，每批用牙签挑12个单克隆接入到装有3mL灭过菌的液体MRS培养基试管中，以1/100的的比例转接到100mL灭过菌的液体MRS培养基中，37℃先静置12h再150r/min摇床培养至20h，以10%的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养基装液量为100mL，37℃、150r/min摇床培养72h，发酵结束后测定L-乳酸的产量和光学纯度，与出发菌株的L-乳酸的光学纯度和产量作对比，筛选出L-乳酸光学纯度和产量都提高的最高的突变菌株作为下一步硫酸二乙酯（DES）诱变的出发菌株。

实施例3：用硫酸二乙酯（DES）对紫外诱变获得的突变菌株进行诱变选育和稳定性试验

将紫外诱变筛选到的L-乳酸高光学纯度的突变菌株划到YE平板上，在37℃恒温培养箱中培养2d，长出单克隆之后，用灭过菌的牙签条单克隆菌落接到3mL灭过菌的液体MRS培养基中，37℃、150r/min过夜摇床培养,以1/100的比例转接到100mL灭过菌的液体MRS培养基中，37℃先静置培养12h再150r/min振荡培养到20h，然后放置到冰上30min，在无菌操作台中将菌液依次转移到灭过菌的50mL的离心管中，5000r/min离心5min，收集菌体沉淀，用灭过菌的0.9%生理盐水洗涤2次，最后用20mL的0.9%的生理盐水溶解并定容至20mL，加入一定体积分数的DES溶液（DES溶液配比：50%体积分数的无水乙醇和50%体积分数的DES），处理一定时间，按照加入DES体积的10倍来加入5%的Na₂S₂O₃溶液终止反应，通过改变DES的体积分数和诱变处理时间来来控制存活率，依次确定诱变的最适DES体积分数和处理时间。

1、DES体积分数对存活率的影响

设定DES体积分数为0.5%、0.75%、1%、1.25%和1.5%，每个DES体积分数做两个平行重复试验，分别测定存活率，当DES体积分数为1%时，存活率为23.5%，此时诱变的正突变率高，当DES小于1%时，存活率迅速增加，这是因为相同时间内小剂量的DES不足以作用于所有的菌，所以会随着DES体积分数的降低存活率会迅速增加，当DES体积分数为1.5%时，存活率为1.5%,近似几乎所有菌体都已致死，综合考虑，所以选择1%的DES体积分数作为最适的诱变体积分数。

2、诱变时间对存活率的影响

DES诱变处理时间设置为15min、20min、25min、30min、35min和40min。刚开始随着诱变时间的增加，存活率降低速度较快，当达到30min时，存活率降低的速度开始变缓，分析原因可能是诱变时间较少时，DES一直作用于菌体致使菌体不断死亡，当达到40min时菌体几乎全部致死，综合考虑，选择诱变处理时间为30min为最适。

确定DES诱变的体积分数和诱变处理时间之后，进行如下操作：将诱变之后的菌液用2mL的5%的Na₂S₂O₃终止反应，用0.9%的生理盐水洗涤三次，最后用20mL的灭过菌的超纯水溶解菌体并定容至20mL，取100uL的菌悬液，稀释至10^-5倍，将其涂布到YE平板上，37℃恒温培养2d，用牙签挑取12个单克隆到3mL的灭过菌的液体MRS培养基中，以1/100的比例转接到100mL的灭过菌的液体MRS培养基中，37℃静置12h然后150r/min摇床培养至20h，以10%的接种量接种到发酵培养基中，装液量为100mL，37℃、150r/min培养72h，分别测定L-乳酸的光学纯度和产量。通过DES诱变最终筛选出一株L-乳酸光学纯度为98.83%，摇瓶上L-乳酸产量为140g/L的突变菌株，并将其命名为ZW-63B。

将DES诱变获得突变菌株ZW-63B接种到灭过菌的液体MRS培养基中，培养20h后以10%的接种量接种到发酵培养基中，发酵72h之后测定L-乳酸的光学纯度和产量，然后将培养20h的种子培养基以1%的比例转接到100mL的灭过菌的液体MRS培养基中，再次培养20h，以10%的接种量接种到发酵培养基中，重复此步骤5次。最后终极突变株的L-乳酸光学纯度色谱图见图1，传代实验中，第五代和第一代的L-乳酸产量和光学纯度见表1。诱变前后，L-乳酸产量和L-乳酸光学纯度变化如表2所示。

表1稳定性实验，第一代出发菌株与第五代的L-乳酸产量和光学纯度

菌株	L-乳酸产量	L-乳酸光学纯度（%）
			第一代	140	98.83
第五代	137	98.57

表2出发菌株与突变菌株的L-乳酸产量和光学纯度的比较

菌株	L-乳酸产量(g/L)	L-乳酸光学纯度(%)
			ZW-63A	133	96.21
ZW-63B	140	98.83

Claims

1.一种干酪乳杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.8029。

2.权利要求1所述的干酪乳杆菌在发酵生产L-乳酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以保藏编号为CGMCCNo.8029的干酪乳杆菌接入培养基，发酵生产L-乳酸。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵生产L-乳酸的培养基包括：葡萄糖、酵母粉、乙酸钠、磷酸盐、甜菜碱和微量元素液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵生产L-乳酸的培养基，组成为：葡萄糖16g/100mL，酵母粉1g/100mL，乙酸钠0.2g/100mL，KH₂PO₄0.1g/100mL，甜菜碱0.2g/100mL，MgSO₄·7H₂O0.02g/100mL，MnSO₄·H₂O0.005g/100mL，CaCO₃10g/100mL。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述干酪乳杆菌的接种量为10％。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养温度为37℃。