CN103638295A - 一种具有抗血小板聚集活性的提取物 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药技术领域，本发明涉及一种具有抗血小板聚集活性提取物及其制备方法。其制备方法为以麦冬药材为原料，用有机溶剂提取，大孔树脂分离，乙醇洗脱，干燥而得。本发明的提取方法简单、易行，适于工业化生产。得到的提取物具有较好的抗血小板聚集作用。

Description

一种具有抗血小板聚集活性的提取物

技术领域：

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种提取物及其制备方法，以及该提取物在抗血小板聚集作用方面的应用。

背景技术：

血小板是一种多功能细胞，是由骨髓中成熟的巨核细胞的细胞质脱落而成，平均分布在血液中，具有粘附、聚集、释放和分泌颗粒内容物(如5-羟色胺，ADP)的功能。在血栓形成的过程中，血小板的粘附起着重要的始动作用，随之又激发了内源性与外源性的凝血过程。当血流缓慢、涡流形成、血液凝固性增高及心血管内膜受损等诸多因素出现时，或以某种因素为主时，靠近血管内皮的血小板则黏附在裸露的胶原纤维上，并释放ADP和血栓素A2，促使更多的血小板黏附，但当凝血过程启动后，血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，后者使血小板牢固地凝集于受损内膜表面。上述过程反复进行，血小板黏集堆不断增大、增多，构成多个血小板小丘，阻塞血流，从而引起血栓。因此血小板聚集性是预示血栓形成趋势的重要参数，血小板活化聚集可导致或促进某些疾病的发生和发展，所以，对于抗血小板药物的研究具有很重要的意义。

麦冬为百合科植物麦冬的干燥块根，其味甘、微苦，微寒，归心、肺、胃经，具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦之功效，临床用于治疗支气管炎、肺炎等炎症性疾病以及心律失常及心肌缺血等心血管疾病。药理研究表明麦冬正丁醇萃取部位能加强心肌收缩力、改善血液流态及增强冠脉血流量，并对心血管内皮细胞有一定的保护作用，从而具有一定的抗心肌缺血、抗心律失常以及抗血栓作用。现代药理实验证明麦冬中所含的单体成分具有明确的药理活性，如麦冬皂苷D具有抗氧化活性，短葶山麦冬皂苷C具有明确的抗肿瘤细胞转移的作用和麦冬皂苷B可以抑制肺癌细胞的生长等。但单体类成分制备过程较繁琐，得率很低，且成本较高。所以我们选用该提取物作为出发点，优化其分离及制备提纯方法，目的是可以得到具有治疗效果明确的、可以直接用于医疗领域、并被制作成各种制剂的新活性成分，使其原料得到充分的利用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种抗血小板聚集的提取物。

本发明的目的还在于提供上述提取物在抗血小板聚集方面的应用。

本发明经过大量实验筛选，优选出提取物及其制备方法，制备方法包括：以麦冬药材为原料，以相对于麦冬原料重量至少2倍量的有机溶剂提取，提取液离心，通过大孔树脂柱，先以水洗脱至糖反应为阴性，再以<50％乙醇除杂，最后以≥50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥即得。

上述以有机溶剂提取过程中，选用的溶剂为水、甲醇、乙醇、丙酮、丁醇，本发明通过多个实施例更优选为乙醇提取。

上述提取过程中，提取方法可以为回流、超声、浸渍等，本发明优选采用回流法提取。

上述提取过程中所用的乙醇为一定浓度的乙醇水溶液，更优选为50％-95％的乙醇溶液提取。

上述提取过程中，以麦冬药材重量至少2倍量的溶剂提取，经过大量实验优化，本发明更优选为5-30倍量的乙醇溶液提取。

上述分离过程所选用的树脂包括D101、AB-8、HPD100、D4020、NK-9，本发明经过大量实验更优选为D101型大孔树脂分离。

上述分离过程中，麦冬药材与大孔树脂的料液比为1∶0.8～5，更优选为1∶1～2。

由于麦冬含糖量较高，过滤较不方便，容易受温度的影响，所以提取液在上柱之前直接采用离心技术，弃去不溶物，取上清液，过大孔树脂柱分离。洗脱的步骤主要为，先用水洗脱至α-萘酚反应为阴性，再以<50％乙醇除杂，最后用≥50％乙醇溶液洗脱，洗脱时收集洗脱液一般为至少1倍柱体积。本发明通过优选实施例，更优选为1-19倍柱体积，即可达到本发明的目的和效果。上述柱体积是指大孔树脂填料的体积。

本发明提供的提取物，尽可能除去糖类和小分子及低极性化合物等杂质，具有显著的抗血小板聚集活性。

本发明还提供了该提取物在抗血小板聚集方面的应用，为抗凝血药物的研究提供依据。以下是试验方法与结果：

麦冬提取物抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的家兔血小板聚集活性

实验动物：家兔

诱导剂：二磷酸腺苷(ADP)

方法和结果：

选用符合实验要求的家兔，乙醚麻醉，固定，颈动脉插管取血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以1000r／min离心18min，取富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，剩余部分以3000r／min离心15min，取贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)。聚集诱导剂用ADP(终浓度5μM／ml)。采用比浊法测定，每管275μl PRP中加入不同浓度的药物15μl，对照组PRP中加入生理盐水15μl，37℃温育3min，加入诱导剂ADP10ul，检测5min内血小板最大聚集率，然后计算抑制率，公式如下：

表1提取物不同剂量组对ADP诱导的家兔血小板聚集率的影响

与空白对照组比较：**P<0.01，*P<0.05

结论：以阿司匹林作为阳性药，通过实验证明，麦冬提取物能明显抑制血小板聚集，甚至优于阳性药，可以用来作为抗血小板聚集药物。

麦冬提取物抑制胶原及凝血酶诱导的大鼠血小板聚集活性

实验动物：Wistar大鼠

诱导剂：胶原蛋白凝血酶

方法和结果：

Wistar大鼠，10％水合氯醛麻醉，固定，腹主动脉取血，3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，以1000r／min离心18min，取富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，剩余部分以3000r／min离心15min，取贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)。聚集诱导剂用胶原(终浓度100mg／L)和凝血酶(终浓度3KU／L)。采用比浊法测定，每管275μl PRP中加入不同浓度的药物15μl，对照组PRP中加入生理盐水15μl，37℃温育3min，加入诱导剂胶原或凝血酶10ul，检测5min内血小板最大聚集率，然后计算抑制率，公式如下：

表2提取物不同剂量组对胶原与凝血酶诱导的大鼠血小板聚集率的影响

与空白对照组比较：**P<0.01，*P<0.05

结论：以阿司匹林作为阳性药，通过实验证明，麦冬提取物能明显抑制血小板聚集，甚至优于阳性药，可以用来作为抗血小板聚集药物。

具体实施方式

实施例1

不同洗脱部位活性筛选

取麦冬药材，加麦冬原料重量大约15倍量水煎煮，每次1.5h，共三次。合并提取液，过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，取上清液，过D101型大孔树脂柱分离，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，干燥即得麦冬不同洗脱部位。对于不同的洗脱部位进行抗血小板活性筛选，结果如下表3：

表3麦冬各洗脱部位对ADP诱导的家兔血小板聚集率的影响

与空白对照组比较：**P<0.01，*P<0.05

结论：实验数据显示，麦冬的抗血小板聚集作用的主要活性部位为85％乙醇洗脱部位，与阳性药持平。所以根据实验优选出麦冬活性部位，即麦冬提取物，并对其提取制备工艺进行进一步的优化。

实施例2

提取溶剂的选择

取麦冬药材，加麦冬原料重量大约30倍量的水、甲醇、乙醇、丁醇超声提取，提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液浓缩至小体积，干燥，计算得率。取相同量的各个样品进行抗血小板活性测定，采用比浊法测定，方法如上，计算抑制率。结果如下表4：

表4麦冬不同提取溶剂组对ADP诱导的家兔血小板聚集率的影响

与空白对照组比较：**P<0.01，*P<0.05

结论：实验数据显示，乙醇与丁醇提组的抗血小板聚集活性最好，甲醇提组和乙醇提组、丁醇提组相比较，没有显著性差异。水提组虽得率较高，但所含糖类成分较多，不易处理。乙醇为常用工业溶剂，安全，价廉，适用于工业化生产，所以综合各因素考虑，本发明优选乙醇作为提取溶剂。

实施例3

树脂的优选

1、静态吸附实验

精密称取已处理好的AB-8、D101、HPD100、D4020及NK-9型树脂各5g，置于锥形瓶中，加入药液20ml(0.3g／ml)，置恒温振荡器中振摇24小时(25℃，160r／min)，使其达到饱和吸附。然后抽滤出吸附后液，用等体积水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇部位萃取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇定容至10ml。精密量取吸附后液适量，采用紫外分光光度法进行测定，并计算含量，公式及结果如下表5：

表55种大孔树脂性能的比较(n=3)

2、静态解吸附试验

饱和吸附后的各类型树脂用50ml水洗。抽滤除去水分，放入锥形瓶，加50ml70％乙醇溶液振摇24h(25℃，160r／min)，使其充分解吸附。抽滤出药液，等体积水饱和正丁醇萃取4次，回收溶剂至干，残渣加甲醇定容至10ml。精密量取适量，采用紫外分光光度法进行测定，并计算含量。公式及结果如下表6：

表6解吸附实验结果(n=3)

结论：由吸附与解吸附实验数据可知，D101的吸附率和解吸率较高，且D101为常用的医用树脂，价格便宜，经济安全，所以最终选择D101型大孔吸附树脂。

实施例4

料液比的选择

量取D101型树脂10ml三份，装柱。取药液50ml，分别以1.5BV柱体积上样，单个柱体积收集，挥干溶剂，甲醇定容，采用紫外分光光度法进行测定，并计算含量，结果如下表7：

表7洗脱柱体积的选择

结论：一般选用泄漏率10％为界限，当泄漏率超过10％时，树脂已达到饱和。从以上数据可看出，4BV时泄漏率明显提高，且已经超过10％的泄露点，所以上样量优选为3.5BV以内即料液比为1∶2之内最好，优选为1∶1～1∶2。

Claims (7)

1.一种具有抗血小板聚集活性的提取物的制备方法，该方法包括：以麦冬药材为原料，用有机溶剂提取，提取液离心，大孔树脂分离，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，干燥即得提取物。

2.权利要求1所述的制备方法，其中提取过程如下：以麦冬药材为原料，以相对于麦冬原料重量的至少2倍量的有机溶剂提取。

3.权利要求2所述的提取过程，其中提取溶剂包括水、甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。

4.权利要求1所述的制备方法中，大孔树脂包括D101、AB-8、HPD100、D4020、NK-9。

5.权利要求1所述的制备方法，其中麦冬药材与大孔树脂的料液比为1∶0.8～5。

6.权利要求1所述制备方法得到的提取物。

7.权利要求6所述的提取物在抗血小板聚集作用方面的应用。