CN105031206B - 一种抗血小板聚集的川麦冬皂苷组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的川麦冬皂苷组合物的制备方法包括如下：取川麦冬，加水浸泡6‑18h，打碎，再加水煎煮0.5‑6h，两次，提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D‑101树脂柱吸附，重复上样一次，静置6‑18h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得川麦冬皂苷组合物。本发明涉及的川麦冬皂苷组合物具备抗血栓、抗凝血、缩短凝血时间、抗血小板聚集、抗肺血栓、保护缺氧复氧损伤细胞的活性。

Description

一种抗血小板聚集的川麦冬皂苷组合物

技术领域：

本发明属于中药领域，具体涉及一种川麦冬皂苷组合物及其制备方法，以及该组合物在抗血栓、抗血小板聚集、延长凝血时间上的应用。

背景技术：

血栓性疾病(thrombotic disease)是由各种原因导致的血液在血管内或心脏中，从流动状态变为凝固状态，从而造成血管不同程度的栓塞(embolism)而形成的一系列综合征。故血栓性疾病又称为血栓栓塞性疾病。大量的研究资料表明，血栓栓塞性疾病已成为危害人群健康的重要因素。血栓栓塞可遍及大小动脉、静脉、甚或毛细血管，由此导致的心肌梗死、脑梗死、肺梗死等，死亡率与致残率极高，为各种病因之首。血栓形成的基本条件：1、血管壁损伤(主要为血管内皮损伤)2、血流变化(血流瘀滞与涡旋)3、血液成分的改变(凝血因子改变与血小板数量增多或功能亢进)，而血管内皮受损是最重要和最常见的。

目前所用的抗血栓药物主要分为三类：一是抗血小板药物，二是抗凝药物，三是溶栓药物。

血小板是一种多功能细胞，是由骨髓中成熟的巨核细胞的细胞质脱落而成，平均分布在血液中，具有粘附、聚集、释放和分泌颗粒内容物(如5-羟色胺，ADP)的功能。在血栓形成的过程中，血小板的粘附起着重要的始动作用，随之又激发了内源性与外源性的凝血过程。血流缓慢、涡流形成、血液凝固性增高及心血管内膜受损等诸多因素出现时，或以某种因素为主时，靠边的血小板则黏附在裸露的胶原纤维上，并释放ADP和血栓素A2，促使更多的血小板黏附，但当凝血过程启动后，血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，后者使血小板牢固地凝集于受损内膜表面。上述过程反复进行，血小板黏集堆不断增大、增多，构成多个血小板小丘，阻塞血流，从而引起血栓。因此血小板聚集性是预示血栓形成趋势的重要参数，血小板活化聚集可导致或促进这些疾病的发生和发展，所以，对于抗血小板药物的研究具有很重要的意义。

临床上，阿司匹林、氯吡格雷和GP IIb/IIIa拮抗剂是当前抗血小板药物的主体，前两者可口服，后者只能静脉注射，且仅适用于疾病急性期。但前两者也常引起不良反应，如阿司匹林常引起紫斑、龈血、消化道出血或术后出血等。氯吡格雷常引起中性粒细胞减少，血栓性血小板减少性紫癜及消化道症状等。

抗凝药物，目前常用的有肝素类、水蛭素及其基因重组制剂与维生素K拮抗剂等。前两者均为静脉注射给药，后者为口服抗凝药物。肝素类药物的主要不良反应为出血，也可导致骨质疏松、过敏等。重组水蛭素的不良反应远远低于其他抗凝剂，但由于其作用的不可逆性而使医者慎用。常用的维生素K拮抗剂有华法令(warfarin)和新抗凝(acencoumarol，商品名sintrom)两种。华法令可导致不同程度的出血，且其在临床使用过程中影响因素较多。

溶栓药物，主要有尿激酶、链激酶等，可使血栓完全溶解，但多需注射应用，具有一定抗原性，大剂量使用可导致全身出血、出现变态反应等。

针对此等现象，研究与开发安全、有效的抗血栓药物显得尤为重要。麦冬为百合科植物麦冬的干燥块根，其味甘、微苦，微寒，归心、肺、胃经，具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦之功效，临床用于治疗支气管炎、肺炎等炎症性疾病以及心律失常及心肌缺血等心血管疾病。麦冬含有甾体皂苷、高异黄酮、多糖、氨基酸等活性类成分，现代药理实验证明麦冬中所含的单体成分具有明确的药理活性，如麦冬皂苷D具有抗氧化活性，短葶山麦冬皂苷C具有明确的抗肿瘤细胞转移的作用和麦冬皂苷B可以抑制肺癌细胞的生长等。但单体类成分制备过程较繁琐，得率很低，且成本较高。所以我们选用含有各个单体的提取物作为出发点，优化其分离及制备提纯方法，目的是可以得到具有治疗效果明确的麦冬提取物，使其可以直接用于医疗领域，并被制作成各种制剂，使其原料得到充分的利用。

201310710650.0公开了一种具有抗血小板聚集活性的提取物的制备方法，该方法包括：以麦冬药材为原料，用有机溶剂提取，提取液离心，大孔树脂分离，以乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，干燥即得提取物。

201310710650.0实施例1公开了一种具有抗血小板聚集活性的提取物的制备方法，该方法包括：取麦冬药材，加麦冬原料重量大约15倍量水回流提取。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D101型大孔树脂柱分离，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，干燥即得麦冬不同洗脱部位。实验数据显示，麦冬的抗血小板聚集作用的主要活性部位为85％乙醇洗脱部位，与阳性药持平。

麦冬各洗脱部位对ADP诱导的家兔血小板聚集率的影响

结论：实验数据显示，麦冬的抗血小板聚集作用的主要活性部位为85％乙醇洗脱部位，与阳性药持平。所以根据实验优选出麦冬活性部位，即麦冬提取物，并对其提取制备工艺进行进一步的优化。

由此可知麦冬具有良好的抗血栓活性，而麦冬的副作用或者不良反应从未见有报道，提示麦冬可以作为安全、有效的抗血栓药物进行研究，具有重大意义。但是究竟哪个产地的麦冬及哪个成分群是其主要的活性部位呢？

针对这个疑问，本发明采用整体动物模型与体外抗凝血、抗血小板聚集以及细胞实验，筛选麦冬抗血栓活性部位；并对活性部位的制备工艺进行优化，建立稳定可靠的质量控制标准。

技术方案

本发明涉及的麦冬的有效部位及其制药用途包括如下：

本发明涉及一种抗血栓的川麦冬皂苷组合物。

本发明涉及一种抗凝血的川麦冬皂苷组合物。

本发明涉及一种缩短凝血时间活性的川麦冬皂苷组合物。

本发明涉及一种抗血小板聚集的川麦冬皂苷组合物。

本发明涉及一种保护缺氧复氧损伤细胞的川麦冬皂苷组合物。

本发明涉及一种抗肺血栓的川麦冬皂苷组合物。

本发明涉及的麦冬的种类包括：川麦冬、短葶山麦冬、湖北麦冬；

本发明涉及的麦冬的药材部位包括：麦冬的块根、麦冬的须根；

本发明涉及的麦冬的有效部位包括如下：麦冬皂苷组合物；麦冬皂苷组合物的正丁醇的提取物；麦冬皂苷组合物的水解物；

本发明涉及的麦冬的有效部位包括如下：川麦冬皂苷组合物；

本发明涉及的麦冬的有效部位包括如下：川麦冬须根皂苷组合物；

本发明涉及的麦冬的有效部位包括如下：短葶山麦冬皂苷组合物；短葶山麦冬皂苷组合物的正丁醇的提取物；短葶山麦冬皂苷组合物的水解物；

本发明涉及的麦冬的有效部位包括如下：短葶山麦冬须根皂苷组合物；短葶山麦冬须根皂苷组合物的正丁醇的提取物；短葶山麦冬须根皂苷组合物的水解物；

本发明涉及的麦冬的有效部位包括如下：湖北麦冬皂苷组合物；

本发明涉及的麦冬皂苷组合物的制备方法包括如下：取麦冬的药材部位，加水浸泡6-18h，打碎，再加水煎煮0.5-6h，两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置6-18h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得麦冬皂苷组合物。

本发明涉及的麦冬皂苷组合物的正丁醇萃取部位的制备方法包括如下：麦冬皂苷组合物，采用水饱和正丁醇多次萃取，分别收集正丁醇层和水层，回收正丁醇，正丁醇层、水层分别冷冻干燥。记录冻干粉的重量，并计算得率，得到麦冬皂苷组合物的正丁醇萃取部位。

本发明涉及的麦冬皂苷组合物的水解物的制备方法包括如下：麦冬皂苷组合物，加入酸水溶液置于沸水浴中水解，取出，放至室温后，调pH至中性，抽滤，将残渣烘至恒重。经石油醚索氏提取，提取液回收溶剂，残渣用水混悬，冷冻干燥即得麦冬皂苷组合物的水解物。

分析鉴定方法

本发明涉及一种麦冬皂苷的薄层色谱定性鉴别，

取相同量1、2、3、4、5号样品，1ml甲醇溶解，Supelclean^TMLC-C₁₈SPE固相萃取小柱吸附，分别用水、40％、75％、85％甲醇溶液各8ml洗脱，收集75％洗脱部位，挥干溶剂，用少量甲醇溶解，备用。

为了比较5种样品皂苷类成分之间的差异，选用三个展开系统进行比较。

展开系统如下：

(1)氯仿-甲醇-水(17∶6∶2)

(2)丙酮-乙酸乙酯-水-乙酸(5∶5∶1∶0.2)

(3)水饱和正丁醇系统。

本发明涉及一种HPLC-ELSD法对麦冬皂苷C进行定量分析

为了进一步比较不同产地麦冬总皂苷成分之间的差异，选用HPLC-ELSD进行成分定性测定。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；

色谱条件：甲醇-水梯度洗脱。洗脱条件见下

总皂苷HPLC-ELSD色谱条件

本发明涉及一种比色法对麦冬皂苷进行含量测定

本发明的技术方案的优选过程如下：

本发明涉及的试验动物包括如下：ICR小鼠，体重18～22g，雌雄兼用，由扬州大学比较医学中心提供：Wistar大鼠，体重180-220g，雄性，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SUXR(苏)2012～0004；大耳白兔，雄性，体重2.5～3kg，由青龙山动物中心提供。

本发明涉及的试验细胞包括如下：人内皮细胞株EA.hy926细胞，购自中科院上海细胞库。

本发明技术方案的优选是围绕活性而展开的：

本发明寡糖部位的制备方法：

称取川麦冬100g，分别加入5倍量水浸泡12h，打碎，再加入5倍量水25℃温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，回收溶剂至小体积后冷冻干燥即得川麦冬须根寡糖。

称取短葶山麦冬100g，分别加入5倍量水浸泡12h，打碎，再加入5倍量水25℃温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，回收溶剂至小体积后冷冻干燥即得短葶山麦冬寡糖。

本发明糖苷的制备

称取短葶山麦冬须根100g，分别加入10倍量、5倍量水浸泡12h，打碎，再分别加入10倍量、5倍量水60℃温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，回收溶剂至小体积后冷冻干燥即得短葶山麦冬须根糖苷。

称取川麦冬100g，分别加入10倍量、5倍量水浸泡12h，打碎，再分别加入10倍量、5倍量水60℃温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，回收溶剂至小体积后冷冻干燥即得川麦冬须根糖苷。

麦冬水提物的制备

川麦冬100g，5倍量水浸泡4h，再加5倍量水煎煮两次，每次1.5h，滤液合并，浓缩至2g/ml，备用。

在本发明中，麦冬水提物能明显抑制小鼠尾血栓的形成，其作用与阿司匹林相当。麦冬水提物可以显著性的延长小鼠的凝血时间，且抗凝效果强于阿司匹林，所以此结果提示麦冬水提物的抗血栓形成活性可能通过影响凝血系统实现。

麦冬皂苷组合物的制备流程如附图：

本发明公开了一种具有抗血小板聚集活性的提取物的制备方法，该方法包括：取麦冬药材，加麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，30％乙醇部位冻干，得麦冬皂苷30％乙醇部位。

本发明公开了一种具有抗血小板聚集活性的提取物的制备方法，该方法包括：取麦冬药材，加麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液回收溶剂，85％乙醇部位冻干，得麦冬皂苷85％乙醇部位。

本发明公开了一种具有抗血小板聚集活性的提取物的制备方法，该方法包括：取麦冬药材，加麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得麦冬皂苷组合物。

麦冬皂苷组合物编号对应表

麦冬皂苷组合物的得率

制备的麦冬皂苷组合物等9个冻干样品，并记录冻干粉的重量，分别计算样品得率，结果如下1-9号样品冻干粉得率

麦冬糖苷编号：OJ-oc：川麦冬糖苷、LM-oc：短葶山麦冬糖苷

麦冬水提物编号：川麦冬水提物OJ-ae

本发明的麦冬皂苷组合物与201310710650.0实施例1、2、5的特殊在于：

1.本发明麦冬皂苷组合物的制备工艺取麦冬药材，加麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h......。这种属于用水温浸泡的方式，主要得到寡糖部位。

2.本发明的麦冬皂苷组合物是30％乙醇部位和85％乙醇部位的混合物的冻干粉。

本发明的麦冬皂苷组合物的特殊效果是基于以上特殊的制备工艺。以下是具体分析：

麦冬皂苷组合物的正丁醇萃取部位的制备方法：

将4号样品进一步纯化，取得4号样品100mg，采用水饱和正丁醇6次萃取，分别收集正丁醇层和水层，回收正丁醇，正丁醇层、水层分别冷冻干燥。记录冻干粉的重量，并计算得率，结果为：正丁醇层89.49％，水层7.04％。

ICR小鼠40只，随机分为对照组、4号样品组(50mg/kg)、正丁醇萃取部位组(44.75mg/kg)和水部位组(3.52mg/kg)。实验结果与空白组相比，正丁醇萃取部位与4号样品均显著延长了小鼠的凝血时间，且随着皂苷含量的增加，抗凝血活性也进一步增加，所以说明总皂苷的含量对麦冬的抗凝血活性有着至关重要的影响。水部位与空白组比较，影响不大，与正丁醇萃取部位相比较，有显著性的差异(P＜0.05)。

麦冬皂苷组合物的水解物的制备方法：

称取4号样品1.11g，加入130ml 2％硫酸水溶液置于沸水浴中水解5h，取出，放至室温后，用16％氢氧化钠溶液调pH至中性，抽滤，将残渣与滤纸一起75℃下烘至恒重。经石油醚索氏提取5h，提取液回收溶剂，残渣用水混悬，冷冻干燥即得麦冬皂苷组合物的水解物，计算得率为25.72％。

ICR小鼠40只，随机分为对照组、麦冬皂苷组合物的水解物高、中和低剂量组(22mg/kg、11mg/kg、5.5mg/kg)。实验结果表明，11mg/kg时(从皂苷组合物换算而来)对小鼠凝血时间虽有延长作用，但与空白组相比无差异。5.5mg/kg与22mg/kg给药剂量均可极显著的延长小鼠的凝血时间，所以，选用低剂量给药。

ICR小鼠，50只，随机分为对照组、Aspirin组、麦冬皂苷组合物的水解物组(5.5mg/kg)、OJ-oc(5.31g/kg)和LM-oc(5.31g/kg)组。实验结果表明：麦冬皂苷组合物的水解物部位在5.5mg/kg给药剂量时，与空白组相比可极显著的延长小鼠凝血时间(P＜0.01)。寡糖组的实验结果与预试相同，在5.31g/kg的给药剂量下，寡糖部位可以缩短小鼠的凝血时间，OJ-oc与空白组比较有显著性差异，而LM-oc无差异。两个不同来源的寡糖部位相比较，OJ-oc的促凝作用较LM-oc较强。

本发明的药理试验包括如下：

麦冬水提物的抗血栓、延长凝血时间的药理试验

麦冬水提物对角叉菜胶致小鼠尾血栓的影响

ICR雄性小鼠50只，18-22g，随机分为5组，即空白对照组、阿司匹林组(33.6mg/kg)、川麦冬水提物高、中、低剂量组(1g/kg、2g/kg、4g/kg)。小鼠背部皮下注射1％角叉菜胶(50mg/kg)，观察24h、36h、48h、72h小鼠尾部血栓形成情况。

皮下注射角叉菜胶刺激24h后，模型组尾部前端已全部出现暗红色血栓区，但给药组只有少部分出现。刺激36h后，模型组血栓区逐渐变长，给药组也基本出现血栓区。48h时模型组与给药组血栓区均达到最大值，72h后开始慢慢变硬、变干，有些开始脱落。由以上结果可知，麦冬水提物与阿司匹林能够明显抑制小鼠尾血栓的形成。

麦冬水提物对角叉菜胶所致尾血栓的影响

统计学分析：实验结果用mean±SD表示，采用t检验分析各组间差异的显著性。

麦冬水提物对小鼠凝血时间的影响

ICR雄性小鼠50只，18-22g，随机分为5组，即空白对照组、阿司匹林组(33.6mg/kg)、麦冬水提物高、中、低剂量组(1g/kg、2g/kg、4g/kg)。每天给药一次，连续给药三天，末次给药前禁食(不禁水)12h，第三天给药后1h，用内径0.5mm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，自血液冲入管内开始计时，注满后取出，每隔30s折断毛细管约0.5cm，并向左右缓慢拉开，观察折断处是否有血凝丝，直至血凝丝出现为止，所经历的时间即为凝血时间(CT)。

连续给药3天后，麦冬水提物在1g/kg、2g/kg给药剂量下，可以极显著的延长小鼠的凝血时间，在4g/kg给药剂量下可以明显延长小鼠的凝血时间的，但是与中、低剂量相比较，作用较弱。

麦冬水提物对小鼠凝血时间的影响

麦冬水提物能明显抑制小鼠尾血栓的形成，其作用与阿司匹林相当。麦冬水提物可以显著性的延长小鼠的凝血时间，且抗凝效果强于阿司匹林，此结果提示麦冬水提物的抗血栓形成活性可能通过影响凝血系统实现。

麦冬皂苷组合物、麦冬皂苷组合物的水解物、麦冬糖苷、对家兔体外血小板聚集的影响

大耳白兔，雄性，2～2.5Kg，乙醚麻醉，仰面固定，颈动脉插管取血，血液以3.8％的枸橼酸钠1∶9抗凝，1000r/min离心18min，制备富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，剩余部分则以3000r/min离心15min，制备贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)。聚集诱导剂用二磷酸腺苷(ADP)(终浓度5μM/ml)。每管275μl PRP中加入不同浓度的药物15μl，对照组PRP中加入生理盐水15μl，PRP与药物共孵育3min后加入10μl ADP，测定6min内血小板的最大聚集率，根据公式计算抑制率，公式如下：

麦冬皂苷组合物、麦冬皂苷组合物的水解物、麦冬糖苷对家兔体外血小板聚集率的影响

麦冬皂苷组合物、麦冬皂苷组合物的水解物、麦冬糖苷对家兔体外血小板聚集率的影响

对小鼠凝血时间的影响

麦冬皂苷组合物对小鼠凝血时间的影响

麦冬皂苷组合物给药剂量的选择

随意取4号样品作为麦麦冬皂苷组合物给药剂量摸索的样品。

ICR小鼠32只，随机分为对照组、4号样品高、中、低剂量组(100、50、25mg/kg)，由实验结果显示，麦冬皂苷组合物给药剂量在50mg/kg、100mg/kg时明显延长小鼠的凝血时间，与空白组比较有显著性差异。为了比较不同来源麦冬皂苷组合物的抗凝血活性，我们选择50mg/kg作为药效筛选的剂量。

麦冬皂苷组合物给药剂量的选择

注：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

麦冬皂苷组合物对小鼠凝血时间的影响

玻管法：ICR小鼠，雌雄各半，随机分组。每天给药一次，连续给药三天，末次给药前禁食(不禁水)12h，第三天给药后1h，用内径0.5mm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，从血液开始流入管内开始计时，注满后立即取出毛细管，间隔30s从两端折断毛细管约0.5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝出现，血凝丝出现所经历的时间即为凝血时间(CT)。

麦冬皂苷组合物对小鼠凝血时间的影响

为了比较不同来源麦冬皂苷组合物的抗血栓活性，我们选择单一剂量进行药效学比较研究。ICR小鼠70只，随机分为对照组、1、2、3、4、5号样品组(50mg/kg)与Aspirin组(33.6mg/kg)。实验结果表明：不同产地与药用部位的麦冬皂苷组合物在50mg/kg的给药剂量下可以显著延长小鼠的凝血时间(P＜0.01)，提示麦冬皂苷组合物具有抗凝血活性。进一步对各样品的抗凝血活性进行比较发现，2号和4号样品的抗凝活性明显高于其他各组，与1号、3号样品相比较，抗凝血活性有显著性差异(P＜0.05)。2号、4号样品与Aspirin相比抗凝血作用稍弱，但无显著性差异。

麦冬皂苷组合物对小鼠凝血时间的影响

注：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

麦冬皂苷组合物正丁醇萃取部位对小鼠凝血时间的影响

将4号样品进一步纯化，取得4号样品100mg，采用水饱和正丁醇6次萃取，分别收集正丁醇层和水层，回收正丁醇，正丁醇层、水层分别冷冻干燥。记录冻干粉的重量，并计算得率，结果为：正丁醇层89.49％，水层7.04％。

ICR小鼠，雌雄各半，随机分组。每天给药一次，连续给药三天，末次给药前禁食(不禁水)12h，第三天给药后1h，用内径0.5mm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，从血液开始流入管内开始计时，注满后立即取出毛细管，间隔30s从两断折断毛细管约0.5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝出现，血凝丝出现所经历的时间即为凝血时间(CT)。

实验结果如下：

ICR小鼠40只，随机分为对照组、4号样品组(50mg/kg)、正丁醇萃取部位组(44.75mg/kg)和水部位组(3.52mg/kg)。实验结果如表2.2.3所示，与空白组相比，正丁醇萃取部位与4号样品均显著延长了小鼠的凝血时间，且随着皂苷含量的增加，抗凝血活性也进一步增加，所以说明总皂苷的含量对麦冬的抗凝血活性有着至关重要的影响。水部位与空白组比较，影响不大，与正丁醇萃取部位相比较，有显著性的差异(P＜0.05)。

麦冬皂苷组合物正丁醇萃取部位与麦冬皂苷组合物的比较

麦冬糖苷与麦冬皂苷组合物的水解物对小鼠凝血时间的影响

ICR小鼠40只，雌雄各半，随机分组。每天给药一次，连续给药三天，末次给药前禁食(不禁水)12h，第三天给药后1h，用内径0.5mm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦球后静脉丛，从血液开始流入管内开始计时，注满后立即取出毛细管，间隔30s从两断折断毛细管约0.5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处是否有血凝丝出现，血凝丝出现所经历的时间即为凝血时间(CT)。

麦冬糖苷给药剂量的选择

麦冬水提物部分除了甾体皂苷外，其他大部分物质主要为多糖类。随意取OJ-oc作为糖苷给药剂量选择的样品。ICR小鼠40只，随机分为川麦冬糖苷低、中、高1和高2剂量组(0.4g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg、5.31g/kg)。由实验结果可以看出，麦冬糖苷在0.4-2.4g/kg时，虽延长了小鼠的凝血时间，但与空白组相比较，并没有显著性差异(P＞0.05)，而当给药剂量为5.31g/kg时，麦冬糖苷的作用完全逆转，极显著的缩短了小鼠的凝血时间。既然糖苷对小鼠的凝血时间并无影响，所以本实验选择5.31g/kg的给药剂量来比较。

麦冬糖苷给药剂量的选择

注：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

麦冬皂苷组合物的水解物给药剂量的选择

ICR小鼠40只，随机分为对照组、麦冬皂苷组合物的水解物高、中和低剂量组(22mg/kg、11mg/kg、5.5mg/kg)。实验结果表明，11mg/kg时(从麦冬皂苷组合物换算而来)对小鼠凝血时间虽有延长作用，但与空白组相比无差异。5.5mg/kg与22mg/kg给药剂量均可极显著的延长小鼠的凝血时间，所以，选用低剂量给药。

麦冬皂苷组合物的水解物给药剂量的选择

注：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

麦冬糖苷与麦冬皂苷组合物的水解物对小鼠凝血时间的影响

ICR小鼠，50只，随机分为对照组、Aspirin组、麦冬皂苷组合物的水解物组(5.5mg/kg)、OJ-oc(5.31g/kg)和LM-oc(5.31g/kg)组。实验结果表明：麦冬皂苷组合物的水解物部位在5.5mg/kg给药剂量时，与空白组相比可极显著的延长小鼠凝血时间(P＜0.01)，糖苷组的实验结果与预试相同，在5.31g/kg的给药剂量下，糖苷部位可以缩短小鼠的凝血时间，OJ-oc与空白组比较有显著性差异，而LM-oc无差异。两个不同来源的寡糖部位相比较，OJ-oc的促凝作用较LM-oc较强。

糖苷及麦冬皂苷组合物的水解物对小鼠凝血时间的影响

注：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05

麦冬各部位对缺氧复氧损伤人内皮细胞的影响

细胞：人内皮细胞株EA.hy926细胞，购自中科院上海细胞库。

ECV304细胞缺氧复氧模型的保护作用

DMEM 12800培养液：培养基干粉(克数)用Milli-Q水300mL溶解，磁力搅拌30min，充分溶解后加入1.5g NaHCO₃、0.06g青霉素(100U/mL)和0.10g链霉素(100U/mL)，再加入Milli-Q水至1000mL，磁力搅拌至少4h使其充分溶解、混匀。然后经预先灭菌的装有两层0.22μm微孔滤膜的抽滤装置过滤除菌，并分装至5个经高压灭菌的250mL的玻璃瓶中，4℃冷藏。使用时，加如10％维森特胎牛血清，即为10％DMEM12800培养基。

0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)：分别称取8g NaCl、2.08g Na₂HPO₄、0.2g KCl和0.2gKH₂PO₄至1000ml三角瓶中，加入1000mL Milli-Q水，磁力搅拌下使之完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后，分装。再经高压蒸汽灭菌30min，放置室温后4℃冷藏。

0.25％胰蛋白酶溶液：称取250mg胰蛋白酶，溶解于100mL灭菌后的0.1M PBS缓冲液中，磁力搅拌至完全溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤，4℃冷藏。

MTT储存液：用PBS配制5mg/ml MTT，0.22μm滤膜过滤除菌后，4℃避光保存。

MTT工作液：用无血清培养基按照1∶10稀释MTT储存液后使用。

药物对内皮细胞株缺氧复氧损伤的保护作用

内皮细胞用10％DMEM12800培养液悬浮，以1×10⁵cell/mL的细胞密度接种于96孔培养板(100μL/孔)上，37℃、5％CO₂培养24h。在内皮细胞株的对数生长期，加入不同药物，37℃、5％CO₂与细胞共培养12h。12h后将培养基换成无糖培养基，37℃，5％CO₂，1％O₂条件下的缺氧箱中缺氧4h，取出换成含0.2％血清的培养基，37℃、5％CO₂复氧2h，最后采用MTT法测定细胞活力。

本实验采用人内皮细胞EA.hy926细胞株缺氧复氧模型进行研究发现，2号与4号样品对EA.hy926细胞缺氧复氧损伤的保护率可达到50％以上。提示2号与4号样品的抗血栓活性更强。

缺氧复氧条件下，人内皮细胞株EA.hy926细胞活力明显下降，缺氧处理前加入各样品溶液，皂苷、糖苷、麦冬皂苷组合物的水解物的终浓度为依次1μg/ml、的各皂苷和作用12h，复氧12h，样品组可显著升高受损细胞活力，计算各样品对人内皮细胞株EA.hy926细胞缺氧复氧的保护的作用，2、4和5号样品对缺氧复氧损伤细胞的保护作用较好，可达到55.16％、51.18％和48.36％。

肾上腺素加寒冷刺激大鼠致肺血栓模型

造模方法：参照文献方法造模，并加以改进。Wistar雄性大鼠80只，随机分为10组，即模型对照组，空白对照组，1号样品组，2号样品组，3号样品组，4号样品组，5号样品组，OJ-oc组，GY组及Aspirin组。每组分别按70mg/kg、70mg/kg、70mg/kg、70mg/kg、70mg/kg、36.8g/kg、15.4mg/kg和23.1mg/kg的剂量灌胃给药。各组药物均用双蒸水配成混悬溶液，每天灌胃给药1次，连续给药7d。模型对照组、空白对照组则用蒸馏水按体重给药。除空白对照组外，各组均在第6天给药后1h，皮下注射1％盐酸肾上腺素溶液0.08ml/100g，4h后再次皮下注射1％盐酸肾上腺素0.08ml/100g，两次注射均间隔两小时，将大鼠置于0～5℃冰水中游泳5min，取出后禁食，自由饮水。空白组0.1ml/100g皮下注射生理盐水，但不冰浴。第7天给药30min后，用10％水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，4ml血液采用肝素抗凝，备用。剩余血液均采用3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝。

检测方法：从加有肝素的4mL全血中取出2mL加入LBY-N6B旋转式血液黏度计，分别测定低切(10/s)、中切(40/s)及高切(120/s)3个切变率下全血黏度，剩余肝素抗凝血液采用微量毛细管法测定红细胞比容。加有枸橼酸钠的血液，在4℃条件下，3000r/min离心10min，取血浆，按试剂盒要求测定PT、APTT和FIB。取部分肺组织，用电动匀浆器匀浆，得10％匀浆液，按照试剂盒要求测定蛋白含量、NO含量及MPO活力。

对小鼠肺血栓的保护作用

ICR小鼠，雄性，50只，18～22g，随机分为5组，分别为对照组、阿司匹林组(93.4mg/kg)、麦冬皂苷组合物的高、中、低剂量组(400，200，100mg/kg)，每组10只，连续灌胃给药5天，末次给药后1h，小鼠尾静脉注射100μl胶原蛋白(22μg)-肾上腺素(5μg)混合液，观察3min内小鼠的存活数。

肾上腺素加寒冷刺激大鼠致肺血栓模型

对血液流变学的影响

由实验结果可知，模型组的全血粘度明显高于空白组(P＜0.01，P＜0.05)，说明模型制作成功。给药组与模型组相比较，4号样品对大鼠的血液粘度有降低作用，但与模型组比较并无明显差异(P＞0.05)，其他组别的血液粘度均较模型组高，提示其对于血液粘度基本上无影响。造模与给药对红细胞比容基本上没有影响，与空白组比较均没有差异。

麦冬各部位对寒冷刺激大鼠血液流变学的影响

注：与空白组比较：##表示P＜0.01，#表示P＜0.05；与模型组比较：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。

对血浆PT、APTT、FIB的影响

实验结果表明：与空白组比较，模型组的凝血酶原时间(PT)与活化部分凝血活酶时间(APTT)极显著的缩短(P＜0.01)，纤维蛋白原(FIB)含量极显著的增加(P＜0.01)，说明模型制作成功。对于PT这个指标，麦冬皂苷组合物的水解物组基本无影响(P＞0.05)，其他各样品均能显著延长PT时间(P＜0.01或P＜0.05)；对于APTT这个指标，除4号样品外(P＞0.05)，其他各样品均能显著延长血瘀大鼠的APTT时间(P＜0.01或P＜0.05)；总皂苷组均能显著降低FIB的含量(P＜0.01或P＜0.05)，麦冬皂苷组合物的水解物与川麦冬糖苷部位对此指标没有影响(P＞0.05)。接下来对各样品组间进行比较，4号样品对于PT的影响极为常显著，与其他各组相比较差异极显著(P＜0.01)，对于FIB的影响，除与1、2号样品无差异外(P＞0.05)，与其他组相比有显著性差异(P＜0.05)，说明4号样品对凝血指标PT、FIB的影响非常大。

但是其对APTT基本上无影响。麦冬各部位对寒冷刺激大鼠PT、APTT、FIB的影响

注：与空白组比较：##表示P＜0.01，#表示P＜0.05；与模型组比较：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。

对肺组织NO、MPO的影响

取部分肺组织，称重后，用生理盐水制备成10％组织匀浆液，根据试剂盒要求进行测定。

实验结果显示：与空白组比较，模型组NO含量显著降低，MPO活力显著升高(P＜0.05)，提示模型制作成功。对于NO，各给药组均可显著降低NO含量，与模型组比较有差异(P＜0.05.P＜0.01)；对于MPO，1、2、3、4号样品组可显著升高肺组织中MPO活力。

麦冬各部位对寒冷刺激大鼠肺组织中NO、MPO的影响

注：与空白组比较：##表示P＜0.01，#表示P＜0.05；与模型组比较：**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。

对小鼠肺血栓的保护作用

实验结果显示：麦冬皂苷组合物对胶原与肾上腺素诱导的肺血栓小鼠有一定的保护作用，高剂量是存活率可以达到60％。

短葶山麦冬须根皂苷组合物对小鼠肺血栓的保护作用

麦冬各部位的抗凝活性研究小结

麦冬水提物在1～4g/kg(生药量)剂量范围内明显抑制角叉菜胶诱导的小鼠尾血栓形成，延长小鼠凝血时间，本章对其水提物部位的两大主要成分抗血栓活性进行了考察。首先考察了麦冬各部位对正常小鼠凝血时间的影响。

本实验研究发现，麦冬总皂苷50mg/kg可以极显著延长小鼠的凝血时间，且与块根相比，须根对凝血时间延长作用更强。麦冬皂苷组合物的水解物5.5mg/kg也可以极显著的延长小鼠的凝血时间，而糖苷对凝血却有促进作用。提示，麦冬的抗凝血活性部位为皂苷与麦冬皂苷组合物的水解物。70mg/kg给药剂量下，麦冬皂苷可以显著延长血瘀大鼠血浆APTT与PT时间，降低纤维蛋白原(FIB)含量，糖苷也可显著延长APTT和PT时间，但对FIB含量无影响。所以可知，麦冬皂苷对凝血系统影响最大。提示麦冬总皂苷可能同时调控内源性与外源性凝血系统而发挥抗凝血活性。通过数据比较可以得出，短葶山麦冬须根总皂苷的抗凝血活性最好，其抗凝作用与Aspirin相当。

麦冬各部位的抗血小板聚集活性研究。

血小板是机体内正常凝血机制中的关键成分，具有粘附、聚集、释放、促凝血的功能。而聚集功能是血小板的一个重要生理特性，是指血小板与血小板之间的黏附，显示活化的血小板相互作用成团的特征，是血小板参与止血和血拴形成过程的重要因素之一。二磷酸腺苷(ADP)是目前抗血小板药物研究中常用的诱导剂之一。本实验继凝血实验后，进一步研究麦冬各部位的抗血小板聚集活性，发现，麦冬总皂苷27μg/ml可以显著抑制家兔体外血小板的聚集，与阳性药Aspirin作用相当。低剂量时，糖苷与麦冬皂苷组合物的水解物都未表现出抗血小板聚集活性，当剂量提高一倍时，麦冬皂苷组合物的凝血活性也是提升了很多倍，糖苷与麦冬皂苷组合物的水解物在高剂量时也表现出了显著的抗血小板聚集活性，但作用不及总皂苷。在所有皂苷中，来源于须根的总皂苷活性强于块根的，说明皂苷含量越高，抗血小板聚集活性越强。前面研究发现麦冬皂苷组合物可以明显延长小鼠的凝血时间，所以，提示麦冬皂苷组合物可能是通过抑制血小板的聚集从而发挥抗凝血的活性。也进一步为麦冬总皂苷的抗血栓活性提供了依据。

麦冬各部位对缺氧复氧损伤人内皮细胞的影响

缺氧复氧模型是体外细胞培养常见的造模方式，广泛地用于组织器官缺血/再灌注损伤及缺血预适应/后适应在细胞分子水平上的研究。对于缺血性疾病，尽快恢复血流、缩短缺血时间是最好的治疗方法，但是恢复血流的同时，组织器官的损伤往往会进一步加重，这就是缺血/再灌注损伤，缺氧复氧模型是机体缺血/再灌注及缺血预适应/后适应的分子水平上的研究，有着重要意义。本实验采用人内皮细胞EA.hy926细胞株缺氧复氧模型进行研究发现，2号与4号样品对EA.hy926细胞缺氧复氧损伤的保护率可达到50％以上。提示2号与4号样品的抗血栓活性更强。

麦冬各部位对肺血栓的影响

前面研究表明，麦冬水提物与麦冬皂苷组合物能显著延长小鼠凝血时间，抑制ADP诱导的血小板聚集，为了进一步比较麦冬不同部位的抗血栓，选用肺血栓作为研究指标。

本实验通过给大鼠皮下注射大剂量肾上腺素使其激动血管α受体占优，而与β受体结合扩血管效应相对降低，结果使血管收缩。再施以冰水浸泡模拟寒气侵袭，血因寒而凝。两者合用，可使血液流变学呈现黏、浓、凝、聚的共性，影响微循环的血液灌流，从而引起微循环障碍，导致局部或全身性疾病。本实验结果显示，4号样品不仅可降低全血粘度，抑制红细胞聚集，并能降低血浆FIB含量。总皂苷类成分可以显著延长血瘀大鼠血浆APTT和PT时间，降低肺组织NO含量，提高MPO活力。提示麦冬总皂苷中4号样品为主要的抗血栓活性成分。

为了进一步验证上述结论，本实验又选用了胶原-肾上腺素尾静脉注射诱导的肺血栓模型，验证4号样品对肺组织的保护作用。发现，4号样品可以降低由于肺栓塞呼吸衰竭而导致的死亡率。

综上所述，可以得出一个结论，麦冬须根的抗血栓活性强于麦冬块根，与其皂苷含量高有直接关系。川麦冬须根总皂苷与短葶山麦冬须根总皂苷作用相比较，短葶山麦冬皂苷的总皂苷含量与抗血栓活性都比较突出。

本发明涉及一种比色法对短葶山麦的总皂苷进行含量测定和HPLC-ELSD法对主要成分短葶山麦冬皂苷C进行定量分析，实验结果为总皂苷含量为71.1％和短葶山麦冬皂苷C的含量为5.49％。

本发明涉及一种短葶山麦冬须根总皂苷的薄层色谱定性鉴别，

取相同量1、2、3、4、5号样品，1ml甲醇溶解，Supelclean^TMLC-C₁₈SPE固相萃取小柱吸附，分别用水、40％、75％、85％甲醇溶液各8ml洗脱，收集75％洗脱部位，挥干溶剂，用少量甲醇溶解，备用。

为了比较5种样品皂苷类成分之间的差异，选用三个展开系统进行比较。薄层色谱图见图1、2和3。

展开系统如下；

(4)氯仿-甲醇-水(17∶6∶2)

(5)丙酮-乙酸乙酯-水-乙酸(5∶5∶1∶0.2)

(6)水饱和正丁醇系统

通过薄层色谱的比较可知，相同产地不同入药部位的总皂苷成分种类上基本没有变化，但同种成分的含量有一定的差异。不同产地总皂苷，不论从种类还是同成分的含量上来看差异都较大。

1.1HPLC-ELSD色谱比较

为了进一步比较不同产地麦冬总皂苷成分之间的差异，选用HPLC-ELSD进行成分定性测定。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；

色谱条件：甲醇-水梯度洗脱。洗脱条件见下表。结果见图4；

总皂苷HPLC-ELSD色谱条件

HPLC-ELSD图谱更清晰明了地展现出了各产地麦冬的成分差异，各谱图有一个共有峰，切含量较高。1号与2号样品来源于川麦冬，3号、4号样品来源于短葶山麦冬，两两之间成分种类上基本没有变化，但不同来源的样品，种类上差距较大。5号样品来源于湖北麦冬，与前两者相比，成分种类上差别较大。

1.2皂苷的含量测定

1.2.1标准品与供试品的制备

标准品溶液的制备：精密称取鲁斯可皂苷元的水解物3.40mg，置25ml容量瓶中，甲醇溶解，并定容，摇匀即得浓度为0.136mg/ml的标准品溶液，备用。

供试品溶液的制备：精密称取1、2、3、4、5号样品适量，置10ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，备用。

1.2.2最大吸收波长的选择

精密量取标准品溶液、4号供试品溶液和甲醇各0.5ml至10ml具塞试管中，水浴中挥干溶剂。取出放至室温，依次加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.4mL，高氯酸0.6ml，摇匀，放至80℃水浴中反应30min，取出，冰水浴3min，然后加冰醋酸8ml，震荡均匀，冷却至室温，于400～760nm波长处进行扫描，选取最大吸收波长533nm为测定波长。结果见图5。

1.2.3标准曲线的制备

分别精密量取0.136mg/ml标准品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0ml至10ml具塞试管中，挥干溶剂。放至室温后，按照2.4.2项下方法进行显色，在533nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线。所得结果见图6。

实验结果所测得的标准曲线方程为：Y＝5.726X-0.110，r＝0.9998(n＝3)，其中Y坐标轴为吸光度(A)，X坐标轴为浓度(mg/ml)。线性范围为40.8μg/ml～136.0μg/ml。标准曲线见图6。

样品测定

精密量取各个供试品溶液1ml至10ml具塞试管中，挥干溶剂，放至室温后，按照2.4.2项下方法进行显色，在533nm波长下测定吸光度，并计算各样品皂苷含量。所得结果如下表：

不同来源的麦冬药材，分别按照2.1.1项下的方法制备两批。由实验结果可知，不同制备批次间总皂苷含量差异较小，说明2.1.1项下的制备方法稳定、可靠。每批样品总皂苷含量均能达到50％以上。

表2.1.3 各麦冬总皂苷冻干粉中总皂苷含量

2.4多糖含量测定

2.5.1标准品与供试品的制备

标准品的制备：精密称取80℃烘至恒重的果糖8.30mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容，得0.083mg/ml标准溶液，摇匀，备用。

供试品的制备：精密称取1、2、3、4、5号样品适量，放至10ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，备用。

2.5.2最大吸收波长的选择

精密量取标准品溶液7ml，用甲醇稀释并定容至10ml。取供试品溶液2.5ml至10ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容。分别精密量取甲醇，标准品稀释后溶液，供试品稀释后溶液2ml至具塞试管中，各加入5％苯酚溶液1ml，再迅速沿管壁加入5ml浓硫酸，40℃水浴反应15min，冰水浴3min终止反应，放至室温，在波长400～760nm处扫描，选择最大吸收波长为490nm。结果见图7。

2.5.3标准曲线的制备

精密量取果糖标准品溶液1、2、3、5、7ml至10ml容量瓶中，甲醇稀释并定容，制成0.0083mg/ml、0.0166mg/ml、0.0249mg/ml、0.0415mg/ml、0.0581mg/ml的一系列浓度的标准品溶液。分别从各标准品溶液中精密量取2ml至具塞试管中，按照2.5.2项下的方法显色，以随行空白溶液为参比溶液，在波长490nm下测定吸光度。以浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线为：Y＝13.38x-0.002，r＝0.9998(n＝3)，果糖在8.3μg/ml～58.1μg/ml范围内线性良好。结果见图8。

2.5.4样品测定

精密量取1、2、3、4、5号供试品溶液2.5ml至10ml容量瓶中，甲醇稀释并定容。精密量取2ml稀释后供试品溶液至10ml具塞试管中，按照2.5.2项下的方法显色，以随行空白溶液为参比溶液，在波长490nm下测定吸光度，按照标准曲线计算各个样品的多糖含量，结果见表。

各个麦冬总皂苷冻干粉中多糖含量

经过苯酚-硫酸法测定样品中的多糖含量，3号与4号分别为短葶山麦冬的块根与须根总皂苷，实验数据表明，须根的多糖含量要低于块根。

附图说明

图1氯仿-甲醇系统薄层色谱图

图2丙酮-乙酸乙酯系统薄层色谱图

图3水饱和正丁醇系统薄层色谱图

图4麦冬皂苷组合物HPLC-ELSD谱图的比较

图5麦冬皂苷组合物最大吸收波长的选择

图6鲁斯可皂苷元标准曲线

图7多糖最大吸收波长的选择

图8果糖标准曲线

图9麦冬皂苷组合物的制备流程

具体实施例

实施例1

称取短葶山麦冬须根54.1g，分别加入10倍量、5倍量水浸泡12h，打碎，再分别加入10倍量、5倍量水60℃温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，回收溶剂至小体积后冷冻干燥即得短葶山麦冬须根糖苷。

实施例2

称取川麦冬54.1g，分别加入10倍量、5倍量水浸泡12h，打碎，再分别加入10倍量、5倍量水60温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，回收溶剂至小体积后冷冻干燥即得川麦冬须根糖苷。

实施例3

短葶山麦冬100g，5倍量水浸泡4h，再加5倍量水煎煮两次，每次1.5h，滤液合并，浓缩至2g/ml，备用，得到短葶山麦冬水提物。

实施例4

川麦冬100g，5倍量水浸泡4h，再加5倍量水煎煮两次，每次1.5h，滤液合并，浓缩至2g/ml，备用，得到川麦冬水提物。

实施例5

取短葶山麦冬100克，加短葶山麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得短葶山麦冬皂苷组合物。

实施例6

取短葶山麦冬须根100克，加短葶山麦冬须根原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得短葶山麦冬须根皂苷组合物。

实施例7

取川麦冬100克，加川麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得川麦冬皂苷组合物。

实施例8

取川麦冬须根100克，加川麦冬须根原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得川麦冬须根皂苷组合物。

实施例9

取湖北麦冬100克，加湖北麦冬原料重量大约5倍量水浸泡12h，打碎，次日再加5倍量水煎煮2h，8倍量1.5h两次。提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置12h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得湖北皂苷组合物。

Claims (1)

1.一种抗血小板聚集的川麦冬皂苷组合物的分析鉴定方法，其特征在于：

川麦冬皂苷组合物的制备方法如下：

取川麦冬，加水浸泡6-18h，打碎，再加水煎煮0.5-6h，两次，提取液过滤，静置放凉后，离心，弃去不溶物，上清液、过D-101树脂柱吸附，重复上样一次，静置6-18h，先以水洗脱至洗脱液molish反应呈阴性，再以30％的乙醇溶液洗脱，最后用85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液分别回收溶剂，将30％乙醇部位和85％乙醇部位混合，冻干，得川麦冬皂苷组合物；

川麦冬皂苷组合物的薄层色谱定性鉴别

取川麦冬组合物，1ml甲醇溶解，LC-C18SPE固相萃取小柱吸附，分别用水、40％、75％、85％甲醇溶液各8ml洗脱，收集75％洗脱部位，挥干溶剂，用少量甲醇溶解，备用；

展开系统如下：

丙酮-乙酸乙酯-水-乙酸，5∶5∶1∶0.2；

川麦冬皂苷组合物的HPLC-ELSD色谱，

用HPLC-ELSD进行成分定性测定；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm；

色谱条件：甲醇-水梯度洗脱，洗脱条件；

总皂苷HPLC-ELSD色谱条件

川麦冬多糖含量测定方法，

标准品与供试品的制备

标准品的制备：精密称取80℃烘至恒重的果糖8.30mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容，得0.083mg/ml标准溶液，摇匀，备用；

供试品的制备：精密称取川麦冬皂苷组合物样品适量，放至10ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，备用；

最大吸收波长的选择

精密量取标准品溶液7ml，用甲醇稀释并定容至10ml；取供试品溶液2.5ml至10ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容；分别精密量取甲醇，标准品稀释后溶液，供试品稀释后溶液2ml至具塞试管中，各加入5％苯酚溶液1ml，再迅速沿管壁加入5ml浓硫酸，40℃水浴反应15min，冰水浴3min终止反应，放至室温，在波长400～760nm处扫描，选择最大吸收波长为490nm；

标准曲线的制备

精密量取果糖标准品溶液1、2、3、5、7ml至10ml容量瓶中，甲醇稀释并定容，制成0.0083mg/ml、0.0166mg/ml、0.0249mg/ml、0.0415mg/ml、0.0581mg/ml的一系列浓度的标准品溶液，分别从各标准品溶液中精密量取2ml至具塞试管中，按照上述“最大吸收波长的选择”项下的方法显色，以随行空白溶液为参比溶液，在波长490nm下测定吸光度，以浓度mg/ml为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线为：Y＝13.38x-0.002，r＝0.9998，n＝3，果糖在8.3μg/ml～58.1μg/ml范围内线性良好；

样品测定

精密量取川麦冬皂苷组合物供试品溶液2.5ml至10ml容量瓶中，甲醇稀释并定容；精密量取2ml稀释后供试品溶液至10ml具塞试管中，显色，以随行空白溶液为参比溶液，在波长490nm下测定吸光度，按照标准曲线计算各个样品的多糖含量。