CN103630694A - 一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法 - Google Patents

一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法，其特征在于：用已检测的罗非鱼BMP4抗体对罗非鱼的这2种肌肉部位的BMP4蛋白进行检测，用GAPDH做目标蛋白的对照，如果仅能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼的背部肌肉。

Description

一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法
技术领域
本发明涉及一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法。
背景技术
目前，消费者一致认为罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中，背部肌肉鲜嫩，得到消费者的青睐。这样，在罗非鱼生产和育种过程中，背部肌肉的选育和形成机理成为必须解决的首要问题。因此，如何从分子水平上区分罗非鱼的背部肌肉显得尤为重要。
可从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中开发出鉴别背部肌肉的分子标记，可为背部肌肉区别与其它肌肉提供研究的突破口，同时可根据这个分子标记探寻用于罗非鱼背部肌肉进行选育的路径和方法。但是能够用蛋白检测的方法解决这个问题的研究还未见报道。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供可从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别背部肌肉，该处理方法可以从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别出背部肌肉。
本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：
一种可从罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别背部肌肉的方法，其特征在于：首先获得高质量的罗非鱼BMP4抗体，其次，成功提取罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉蛋白；然后用已检测的罗非鱼BMP4抗体对目标罗非鱼的这些肌肉组织中的BMP4蛋白进行检测，用GAPDH做目标蛋白的对照，如果能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼背部肌肉，如果检测不到，则为罗非鱼尾部肌肉。
具体方法如下：
1、一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法，其特征在于按如下步骤实现：
（1）根据罗非鱼Coptodon rendalli BMP4基因氨基酸序列，其Genbank登录号为BAC02605，依据此序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得罗非鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGE SNHASLIPEE GKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联；
（2）用罗非鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；
（3）用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000；
（4）用罗非鱼BMP4多克隆抗体，以western技术检测罗非鱼背部和尾部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示如果仅能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼的背部肌肉，而检测到55KD和72KD2条带为罗非鱼的尾部肌肉。
有益效果：我们在做BMP4在罗非鱼不同肌肉部位分布时发现罗非鱼背部肌肉能够检测到BMP4蛋白表达，而罗非鱼尾部肌肉则可检测出另外一条72KD的条带，因此，我们认为可以从BMP4蛋白水平上区分罗非鱼的2种不同部位的肌肉，可为背部肌肉与尾部肌肉提供研究的突破口，同时可根据这个分子标记探寻用于罗非鱼背部肌肉进行选育的路径和方法。
附图说明：图1为通过本方法进行罗非鱼背部肌肉、尾部肌肉中鉴别背部肌肉的结果，其中1为罗非鱼背部肌肉，2为罗非鱼尾部肌肉。
具体实施方式
材料：GAPDH蛋白抗体，鼠二抗，兔二抗购自吉尔生化（上海）有限公司；
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
（1）根据罗非鱼Coptodon rendalli BMP4基因氨基酸序列（Genbank登录号：BAC02605）：MIPGNRMLMV ILICQVLLGE SNHASLIPEE GKKKVPGLQG
RSAAQSHELL RDFEATLLHMFGLKRRPRPS RSATVPRYLL DLYRLQSGEA
EEAGAHDIAF EYPERSASRA NTVRGFHHEEHMEQLHELDD GGPMPIRFMF
NVSSIPEDEL LSSAELRLYR HQIDEAIADA ISDDQALHRINVYEVLKAPR
PGQLITQLLD TRLVRHNASR WESFDVSPAV LRWTHERLPN
YGLAVEVLHLNQTPRHQGRH VRISRSLHQE PGEDWEQLRP LLVTFGHDGK
GHPLTRRTKR SPRQRGRKRNRNCRRHALYV DFSDVGWNDW IVAPPGYQAY
YCHGECPFPL ADHLNSTNHA IVQTLVNSVNNNIPKACCVP TELSAISMLY
LDEHDKVVLK NYQEMVVEGC GCR，由上述氨基酸序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得罗非鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGESNHASLIPEE GKc（其中c为增加的cys，用于多肽偶联）；
（2）在（1）的基础上，上述的罗非鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，5次加强免疫，制备兔抗BMP4血清；
（3）在（2）基础上，用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000；
（4）5尾罗非鱼取自中国水产科学研究院无锡淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，取背部肌肉和尾部肌肉组织，液氮速冻后放置于-80℃冰箱冻存，以便于总蛋白的提取（美国Millipore公司蛋白抽提试剂盒:Millipore Y8-2140TotalProtein Extraction Kit1kit）。
用步骤（3）获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，以western技术检测罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉组织中BMP4基因的表达，结果显示罗非鱼背部肌肉中有BMP4蛋白的表达，而在尾部肌肉中可检测到除BMP4蛋白的表达外的72KD的一条带。
其中罗非鱼BMP4多克隆抗体western技术检测方法如下：
1.总蛋白抽提
1)每个样分别取约50㎎罗非鱼组织，放入细胞裂解液中（碧云天-western及IP细胞裂解液）；
2)用剪刀剪碎组织，然后用匀浆器匀浆；
3)匀浆均匀后12，000rpm离心10min；
4)将上清液转移到一新离心管中，加6×Loading Buffer；
5)100℃加热煮沸，冰上放置5min，如此重复3次，然后-20℃储存。
2.SDS-PAGE电泳
1）SDS-PAGE胶制备：
根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如下：
分离胶（8mL体系）
8% 9% 10% 12% 13% 15%
H2O 3.7 3.4 3.1 2.6 2.3 1.8
30%PAGE 2.1 2.4 2.7 3.2 3.5 4
1.5mol/L Tris(pH8.8) 2 2 2 2 2 2
10%SDS 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
10%APS 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08
TEMED 0.005 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004
分离胶（10mL体系）
8% 9% 10% 12% 13% 15%
H2O 4.6 4.3 4 3.3 2.9 2.3
30%PAGE 2.7 3 3.3 4 4.4 5
1.5mol/L Tris(pH8.8) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
10%APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
TEMED 0.006 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004
浓缩胶（5%）
3mL 4mL 5mL
H2O 2.1 2.7 3.4
30%PAGE 0.5 0.67 0.83
1.0mol/L Tris(pH6.8) 0.38 0.5 0.63
10%SDS 0.03 0.04 0.05
10%APS 0.03 0.04 0.05
TEMED 0.003 0.004 0.005
选择分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%。
2）上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。
3）电泳：恒压80V，45min之后恒压120V，1h。
3.免疫印迹
电泳结束后，将PAGE胶从玻板上卸下，装配转膜三明治，恒流300mA条件下湿转90min，将蛋白转移到NC膜上。
4.免疫发光
1)封闭：用封闭液（含5%奶粉的PBST溶液）室温封闭1h；
2)孵育一抗：用新配制的封闭液稀释一抗
GAPDH蛋白抗体稀释比1:5000。
罗非鱼BMP4多克隆抗体稀释比1:50。
3)4℃孵育膜过夜；
4)洗膜：用PBST洗膜30min：第一次洗15min，第二，三，四次各洗5min；
5)孵育二抗：用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗（鼠二抗1:2000，兔二抗1:5000）。
6)室温下孵育膜1h。
7)洗膜：用PBST洗膜30min：第一次洗15min，第二，三，四次各洗5min；
8)X光显影：在暗室中将膜置于平铺好的保鲜膜上，按1：1比例混合A液和B液（Thermo，supersignal west pico），将混合液均匀滴加于膜上，反应60s。
9)将膜在吸水纸上沥干多余的ECL底物反应液，置于平板上，铺上保鲜膜，用保鲜膜包裹NC膜（避免产生气泡），放入暗盒，再放上适当大小的X光片，关闭暗盒，曝光。
10)取出X光片，放入显影液中，待条带显好后取出，在清水中漂洗一下，放入定影液中定影。
11)取出X光片，晾干，拍照记录。
综合以上步骤，我们可以得到，以罗非鱼BMP4基因氨基酸序列为模版设计多肽，成功获得了罗非鱼BMP4基因的多克隆抗体，通过western技术检测发现：罗非鱼背部肌肉中有BMP4蛋白的表达，而尾部肌肉中可检测到包含BMP4蛋白的两条带，这样通过BMP4基因表达的检测可将罗非鱼背部肌肉从背部肌肉和尾部肌肉组织鉴别开来，这也就为罗非鱼的特异性部位肌肉鉴别提供了检测技术。
 
 
 
 SEQUENCE LISTING
 <110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
 <120>  一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法
<130> 
<160>  5    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
gatacccgag      gaagggaaga                                                  20
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
ggggtgtggc      tgccgctaaa                                                  20
<210>  3
<211>  1216
<212>  DNA
<213>  鲤鱼的BMP4基因
<400>  3
ctgtcgagac atcatgattc  ctggtaatcg aatgctgatg gtcattttat     tatgccaagt     60
cctactggga gagagcagct  atgctagtct aatacccgag gaagggaaga     agaaagcgtc    120
ggctcagcac ctgggtcaga  gtcatgaact gctgcgggac tttgaagcca     cgctgctgca    180
catgtttggg ctgcagaggc  gaccgcgacc cagctactcg gctgtggtgc cccagtatct        240
gctggacctg tatcgcctgc  agtcagggga ggccgaagag gccggggccc     acgacgtgag    300
cttcgattat cccgaaaggt  ccacgagtcg agcaaacact gtgagaggat     tccatcacga    360
agagcacatg gaagagctgc  agtcagacgg ctcaccggag actcctctgc     gcttcgtctt    420
caatctcagc agcatcccag  aggaggaact catttctact gcagagcttc     gtatctacag    480
gcaacagata gatgatgcaa  tctcagatcc ccaacccacg ggagacgacg     gtctacaccg    540
aataaacata tacgaggtgc  tgaagccccc gcgggccggg cagctcatca     cgcagctgct    600
ggacactcga ctggtgcgcc  acaacacgac ccaatgggag agctttgacg     tgagctcagc    660
cgtactgcgc tggacccgtg  acaagagctc caatcacggc ctggctgtgg     aggtggtgcc    720
cctgaaccga acctcgcatc  accagggacg ccacgtacgc gtaagtcgct     ccttgcatcc    780
gcttccagat gcagactgga  gccagcttcg ccccctgctg gtcacgttcg     ggcatgacgg    840
caaaagtcac ccactgacgc  ggcgagcgaa acgcagcccg aagcaaagag     gtcgcaagcg    900
caaccgaaac tgtcggcggc  acgcgcttta tgtggacttc agcgacgtgg     gctggaacga    960
ctggatcgtg gcgccgcccg  gatatcaggc gtactactgt cacgggagtg     tccctttcca   1020
ttagccgatc atctcaactc  caccaatcac gctatcgtac agacactggt     gaactcggtg   1080
aacaccaata tccccaaagc  ctgctgcgtg cccactgagc tcagcgcaat     ctccatgctt   1140
 tacctggacg aaacggacag ggtggtgctg     aaaaactatc  aggagatggt     ggtcgagggg   1200
tgtggctgcc      gctaaa                                                    1216
<210>  4
<211>  203
<212>  PRT
<213>  BMP4基因的氨基酸序列
<400>  4
Met Asp Asp Tyr His Leu Phe Cys Ala Ser Cys     Arg Lys Thr Gly Lys
1                    5                        10                   15     
Lys Gln Thr Thr Met Arg Ser Leu Ile His Ser     Phe Phe Ile Leu Ser
                 20                   25                       30         
Leu Phe Met Val Ala Ser Pro Val Arg Thr Gly     Glu Thr Leu Cys Gly
             35                   40                       45             
Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys     Gly Ala Asp Gly Phe
         50                   55                      60                 
Tyr Ile Ser Arg Pro Asn Arg Ser Asn Ser Arg     Arg Pro Gln Lys Gly
65                       70                       75                   80 
Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Glu     Leu Arg Leu Leu Gln
                 85                       90                   95     
Gln Tyr Cys Ala Lys Pro Val Lys Ser Glu Arg     Asp Val Ser Ser Ser
                 100                  105                      110        
Leu Leu Gln Ala Phe Pro Val Ser Gln Ala Leu     His Lys Asp Ile Thr
             115                      120                      125            
Gly Gly Pro Pro Gly Val Lys Tyr Ser Lys Tyr     Glu Val Trp Gln Arg
         130                      135                      140                
Lys Pro Ala Gln Arg Leu Arg Arg Gly Val Pro     Ser Ile Leu Leu Ala
145                      150                      155                  160
Arg Lys Phe Arg Arg Gln Val Glu Lys Ile Gln     Asp Glu Glu Gln Val
                     165                      170                  175    
Ser Phe His Arg Pro Leu Met Thr Leu Pro Asn     Gly His Pro Ala Ile
                 180                  185                      190        
Leu Pro His Ile Gln Ile Asn Val Ser His Lys
             195                  200            
<210>  5
<211>  19
<212>  PRT
<213>  鲤鱼BMP4多肽
<400>  5
 Gln Val Leu Leu Gly Glu Ser Ser Tyr Ala     Ser Leu Ile Pro Glu Glu
1                    5                        10                   15     
Gly Lys Cys
     
 
 
 
 

Claims (1)

1.   一种可区分罗非鱼背部肌肉和尾部肌肉的方法，其特征在于按如下步骤实现： （1）根据罗非鱼CoptodonrendalliBMP4基因氨基酸序列，其Genbank登录号为BAC02605，依据此序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得罗非鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGE SNHASLIPEE GKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联； （2）用罗非鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；（3）用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得罗非鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000；（4）用罗非鱼BMP4多克隆抗体，以western技术检测罗非鱼背部和尾部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示如果仅能检测到55KD的蛋白，则为罗非鱼的背部肌肉，而检测到55KD和72KD 2条带为罗非鱼的尾部肌肉。
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