CN103623424B - 一种基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域,涉及一种基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统及其制备方法。该基因递释系统的载体由阳离子链段聚甲基丙烯酸酯、电中性链段和脑靶向功能基TGN三部分共价连接构成,载体进而与阴离子质粒DNA通过静电作用自组装形成纳米胶束。本发明能够传递基因药物穿过血脑屏障,进入脑内发挥作用。本发明通过无创伤的静脉注射方式给药试验后显著提高基因递释系统的脑部靶向性和基因在脑部的表达;其粒径、表面电荷、靶向功能基的修饰程度均可控,便于基因递释系统的优化。本发明所构建的基因递释系统,具有细胞毒性低,脑靶向效率高的优点。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及药物递释系统,具体涉及一种基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统及其制备方法。
技术背景
随着人口老龄化进程的加剧,许多脑部疾病如帕金森病、老年痴呆病,越来越困扰着人类,严重影响了人们的健康和生活质量。基因治疗已渐成为针对上述疾病极具潜力的治疗手段,但由于血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)的存在,治疗基因尚无法自主进入脑部病灶,发挥治疗作用。有研究采用高渗休克、颈动脉注射和直接脑室注射给药的侵袭性给药途径,虽然效果较好,却易造成脑部感染和BBB损伤。因此,如何增加非侵袭性给药(如静脉注射)后基因在脑部的分布进而表达是脑内基因递释系统研究的关键。
所谓脑靶向基因递释系统,即利用脑毛细血管内皮细胞上存在着多种特异性受体和转运体,选择其相应的配体作为靶向功能基,修饰到载基因药物递释系统的表面,介导其跨BBB转运。研究显示,此法可有效克服BBB的屏障,且基因药物被包载到递药系统中有利于提高药物体内稳定性,延长血中半衰期。此法是目前最为成熟的脑靶向策略之一,受到广泛关注。
研究报道合适的脑靶向功能基是提高基因递释系统脑靶向效率的关键。目前较多的介导入脑的靶向功能基有:转铁蛋白、胰岛素、OX26、Angiopep-2等,它们均能介导递释系统跨越BBB,但尚存在着脑靶向效率偏低或组织选择性不理想,以及免疫原性等问题。
噬菌体展示技术作为一种筛选功能性短肽的生物技术,它是将随机肽段插入到噬菌体衣壳蛋白上,以融合蛋白形式展示在噬菌体的表面,继而通过多轮的“亲和-洗脱-扩增-亲和”的循环步骤,实现高通量筛选。多轮的亲和筛选可以使特异性结合的噬菌体在靶部位富集,而非特异性结合的噬菌体以及不能结合的噬菌体则在多轮的筛选中被淘汰,因此,可保证最终筛选得到的噬菌体展示肽对靶部位具有高度的亲和性,从而有望提高递药系统的靶向效率和组织选择性。此外,经噬菌体展示筛选得到的短肽还具有生物相容性好、易于修饰等优点。如有研究通过噬菌体展示技术筛选出可与肿瘤血管内皮细胞特异结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列,RGD修饰的长循环脂质体或纳米粒等载体系统均表现出较好的肿瘤靶向性。本申请的发明人在前期研究中,选用噬菌体展示随机十二肽库(Ph.D-12TMPhageDisplayPeptideLibraryKit),通过小鼠体内四轮筛选,获得了新的高效脑靶向功能肽-TGN。
现有技术公开了基因药物常用的载体有病毒载体和非病毒载体,其中,阳离子非病毒载体由于其在安全性、可重复性、巨大的基因包载能力和设计灵活性等方面的优势,在递送基因药物方面备受关注。据报道,目前基因递送领域最重要的阳离子材料聚N,N-二甲氨基-2-甲基丙烯酸乙酯(poly[2-(dimethylamino)ethylmethacrylate],简称PDMAEMA)与非病毒载体的金标准聚乙烯亚胺(PEI)相比,PDMAEMA具有相似的转染效率但更低的细胞毒性,此外它还是pH和温度双重响应型聚合物,能够通过原子转移自由基聚合法合成,很好地控制分子量和分子结构。但是,其尚存在单独采用PDMAEMA仍具有一定的溶血性的缺陷,因此影响了基因递送应用的潜力。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷,提供一种新的脑靶向基因递释系统,具体涉及一种基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统及其制备方法。该基因递释系统能够传递基因药物穿过血脑屏障,进入脑内发挥作用,具有细胞毒性低,脑靶向效率高的优点。
本发明的基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统,其特征在于,该脑靶向基因递释系统为包含质粒DNA、阳离子载体材料和靶向功能基TGN的纳米胶束,所述阳离子载体材料为嵌段共聚物,其包含阳离子链段和电中性链段;所述的阳离子载体材料和靶向功能基TGN组成基因递释载体。
本发明中,所述阳离子链段为聚甲基丙烯酸酯,其分子量为5,000-30,000。
其结构如下示:
n为10-200
本发明中,电中性链段选自聚乙二醇、聚氧乙烯、聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺(pHPMA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(PLGA-PEG)、聚丙交酯-聚乙二醇(PLA-PEG)或聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)。其中,
聚乙二醇包括甲氧基-聚乙二醇(Me-PEG)和马来酰亚胺基-聚乙二醇(Maleimide-PEG),二者的分子量选自1,000-6,000,优选为2,000-5,000;
聚氧乙烯的分子量选自2,000-10,000,优选为3,000-6,000;
聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺的分子量选自2,000-10,000,优选为5,000-8,000;
聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇的分子量选自2,000-30,000,优选为10,000-20,000;
聚丙交酯-聚乙二醇和聚己内酯-聚乙二醇的分子量选自2,000-35,000,优选为20,000-25,000。
本发明所述的电中性链段在基因递释系统中不仅起到桥连作用,而且能够明显降低聚甲基丙烯酸酯的体内毒性,延长递释系统的血中循环时间。
本发明所述质粒DNA选自任何可在真核稀薄表达的质粒DNA。
本发明的脑靶向基因递释系统,采用噬菌体展示肽TGN作为脑靶向功能基,阳离子链段PDMAEMA为基础载体,通过电中性链段连接TGN构建基因递释载体,获得基因递释载体与质粒DNA复合形成的纳米级基因递释系统。
本发明中,阳离子链段PDMAEMA、电中性链段和脑靶向功能基TGN三者以共价方式连接制备TGN修饰的基因递释载体,其中,电中性链段与阳离子链段的分子比是1-20:1,TGN与阳离子载体材料的分子比为1-10:1。
本发明中,阳离子载体材料由阳离子链段PDMAEMA和电中性链段以1:1-20的分子比通过原子转移自由基聚合法连接制成。
本发明中,所述基因递释载体与质粒DNA形成纳米级基因传释系统,其中阳离子链段PDMAEMA与质粒DNA的氮磷比为0.5-20:1。
本发明通过下述方法制备基因递释系统:将制备的PDMAEMA-电中性链段-脑靶向功能基TGN基因递释载体溶解于pH值7.0-7.5磷酸盐缓冲液中配制成所需浓度的溶液,将质粒DNA溶于10mMTris溶液(pH8.0)中配制成所需浓度的溶液,室温下两者等体积涡旋30s,静置30min制成基因递释系统。
本发明所制得的基因递释系统转染脑毛细血管内皮细胞,荧光显微镜观察以及荧光素酶定量,结果显示,TGN修饰的PDMAEMA基因递释系统有显著高的转染效率,其值是未修饰PDMAEMA基因递释系统的2-4倍。
本发明所制备的基因递释系统包载荧光标记的DNA后,通过Balb/c小鼠尾静脉注射方式考察体内靶向性,小动物活体成像结果显示,经TGN修饰后的基因递释系统在脑部的分布明显增加,而在肝和肾的蓄积明显减少。
本发明所制备的基因递释系统通过Balb/c小鼠尾静脉注射方式考察脑部转染效果,冰冻切片后荧光显微镜观察,结果表明,经TGN修饰后基因递释系统在小鼠脑部不同区域的表达量均显著提高。
本发明所制备的脑靶向基因递释系统,与非病毒载体金标准聚乙烯亚胺(PEI)构建的基因递释系统相比,细胞毒性明显降低,具有更好的应用可行性。
本发明的突出优点在于,采用噬菌体展示技术筛选的脑靶向功能基-TGN修饰基于聚甲基丙烯酸酯的阳离子载体材料,增加了外源性基因在脑毛细血管内皮细胞的转染效率和表达水平,特别是通过无创伤的静脉注射方式给药后显著提高基因递释系统的脑靶向性和基因在脑部区域的表达,且与PEI构建的基因递释系统相比,细胞毒性明显降低。此外,该基因递释系统还具有粒径、表面电荷、靶向头基的修饰程度均可控的优点,显示出良好的应用前景。
附图说明
图1PDMAEMA衍生物核磁共振图谱
其中,A:MePEG-PDMAEMA,
B:Maleimide-PEG-PDMAEMA,
C:TGN-PEG-PDMAEMA。
图2琼脂糖凝胶电泳考察不同基因递释系统的稳定性
其中,1:DNAMarker,
2:单纯DNA溶液,
3:MePEG-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10,
4:TGN-PEG-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10,
5:pHPMA-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10,
6:TGN-pHPMA-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10,
7:TGN-PEG-PLGA-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10,
8:TGN-PEG-PLA-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10,
9:TGN-PEG-PCL-PDMAEMA包载DNA,氮磷比为10。
图3基因递释系统体外转染脑毛细血管内皮细胞
A:荧光显微镜观察脑毛细血管内皮细胞中绿色荧光蛋白的表达情况
a:DNA溶液的转染效果,
b:TGN-PEG-PDMAEMA/DNA的转染效果,
c:TGN-PEG-PLGA-PDMAEMA/DNA的转染效果,
d:市售转染试剂Lipofectamine2000包载DNA后转染效果;
B:定量测定脑毛细血管内皮细胞表达虫荧光素酶。
图4荧光显微镜观察其他基因递释系统的基因转染情况
A:TGN-PEG-PLGA-PDMAEMA/DNA的转染效果
B:TGN-PEG-PLA-PDMAEMA/DNA的转染效果
C:TGN-PEG-PCL-PDMAEMA/DNA的转染效果
D:市售转染试剂Lipofectamine2000包载DNA后转染效果。
图5静脉注射荧光标记的基因递释释系统后,小动物活体成像仪观察纳米粒的体内分布情况,
A:整体动物水平观察。左边为pHPMA-PDMAEMA/DNA,右边为TGN-pHPMA-PDMAEMA/DNA;
B:离体器官观察。上面为TGN-pHPMA-PDMAEMA/DNA,下面为pHPMA-PDMAEMA/DNA。
图6荧光显微镜观察小鼠脑部的基因表达,
A-G:Balb/c小鼠尾静脉给予单纯DNA溶液
H-N:Balb/c小鼠尾静脉给予MPEG-PDMAEMA/DNA纳米胶束
O-U:Balb/c小鼠尾静脉给予TGN-PEG-PDMAEMA/DNA纳米胶束
A、H、O:第三脑室
B、I、P:侧脑室
C、J、Q:海马
D、K、R:黑质
E、L、S:三角隔核
F、M、T:下丘脑
G、N、U:皮质层
图7显示了采用MTT法评价MePEG-PDMAEMA和TGN-PEG-PDMAEMA对BCECs的细胞毒性结果。
具体实施方式
实施例1.
在100ml四口瓶中依次加入甲氧基-聚乙二醇(Me-PEG)2mmol,20mlCH2Cl2,1mlTEA,冰水浴冷却,将2-溴乙丁酰溴8.37mol与20mlCH2Cl2混合后缓慢滴加到四口瓶中,30min加完,室温反应48h,生成MPEG-Br。
在真空反应器A中加入配位剂二联吡啶,抽真空,在N2保护下加入催化剂溴化铜(CuBr)、DMAEMA,磁力搅拌,液氮冷却、抽真空-通N2,反复三次。在真空反应器B中加入引发剂(MPEG-Br),溶剂异丙醇和水,液氮冷却,抽真空-通N2,反复三次。然后将A、B两反应器中的物质在室温下融化,用取样器将B中引发剂溶液转移到A中,液氮冷却、抽真空-通N2,反复三次。完成除氧密封过程。
A中混合物融化后得到红棕色/黑褐色悬浊液,将其置于25℃水浴中加热,反应3-6h。液氮骤冷并通空气使反应停止,再加入10mlTHF搅拌,得到绿色MePEG-PDMAEMA悬浮液。
通过将Me-PEG替换成马来酰亚胺基-聚乙二醇(Maleimide-PEG),其余条件不变,采用上述方法则可以合成Maleimide-PEG-PDMAEMA。
利用开环聚合法,首先合成MePEG-PLGA、MePEG-PLA、MePEG-PCL、Maleimide-PEG-PLGA、Maleimide-PEG-PLA和Maleimide-PEG-PCL,再将上述中性聚合物分子制备成大分子引发剂,通过原子转移自由基聚合法与PDMAEMA相连接制备得到相应的PDMAEMA衍生物。
实施例2.
分别将制备的MePEG-PDMAEMA和Maleimide-PEG-PDMAEMA2.0mg,溶于0.5ml氘代氯仿中,400MHz超导核磁共振波谱仪鉴定载体材料的结构,获得核磁共振图谱,结果见附图1。PDMAEMA与Me-PEG反应后,在3.4ppm处出现甲氧基的特征吸收峰,并在3.6ppm出现聚乙二醇的特征吸收峰,说明Me-PEG成功修饰到PDMAEMA上(即MePEG-PDMAEMA);同时,PDMAEMA与Maleimide-PEG反应后,除了在3.6ppm出现了聚乙二醇的特征吸收峰,还在6.7ppm处出现了马来酰亚胺基的特征吸收峰,表明Maleimide-PEG成功连接到PDMAEMA上(即Maleimide-PEG-PDMAEMA)。
实施例3.
精密称取适量冻干后的Maleimide-PEG-PDMAEMA,溶于PBS(pH7.0),配制成氮原子浓度为100nmol/μL的储备液;同时配制脑靶向功能基TGN的pH7.0PBS储备液,浓度为含半胱氨酸100nmol/μL。量取等体积的两种储备液于西林瓶,室温下搅拌4h。马来酰亚胺基与半胱氨酸上的巯基特异性结合,形成TGN-PEG-PDMAEMA。将制备的TGN-PEG-PDMAEMA基因递释载体2.0mg,溶于0.5ml氘代氯仿中,400MHz超导核磁共振波谱仪鉴定其结构,结果见附图1。Maleimide-PEG-PDMAEMA与脑靶向功能基TGN反应后,6.7ppm处的马来酰亚胺基特征吸收峰消失,表明TGN通过马来酰亚胺基成功与Maleimide-PEG-PDMAEMA结合。
实施例4.
将实施例1制备的各载体材料溶于适量的pH7.4的PBS中配成1mg/ml的溶液,将pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒溶于适量的pH8.0的Tris-EDTA中配制成1mg/ml的溶液,室温下两者等体积涡旋30s混匀制成纳米基因递释系统。其电位和粒径如表1所示。
表1纳米基因递释系统的电位和粒径
实施例5.
按实施例4的方法,分别制备氮磷比为10的MePEG-PDMAEMA/DNA、TGN-PEG-PDMAEMA/DNA、pHPMA-PDMAEMA/DNA、TGN-pHPMA-PDMAEMA/DNA、TGN-PEG-PLGA-PDMAEMA/DNA、TGN-PEG-PLA-PDMAEMA/DNA和TGN-PEG-PCL-PDMAEMA/DNA基因递释系统,称取适量琼脂糖,加入1×TAE溶液,加热溶解,配制0.7%琼脂糖凝胶溶液,室温冷却至约50℃,加入溴乙锭溶液(500μg/ml),插入DNA染色、灌胶、家养,100V电泳40min左右,紫外投射仪观察并拍照,结果如图2所示。图中显示,不同材料制备的纳米基因递释系统,当氮磷比为10时,载体材料能够很好地包载DNA,且功能基TGN的修饰不影响载体对DNA的压缩能力。
实施例6.
按实施例4分别制备MePEG-PDMAEMA/pEGFP、TGN-PEG-PDMAEMA/pEGFP基因递释系统,将上述两种递释系统和脑毛细血管内皮细胞于培养箱中孵育1h,采用PBS溶液润洗细胞,48h后荧光显微镜观察转染结果并拍照,同时以目前公认转染效率好的市售试剂Lipofectamine2000为对照,结果显示,细胞中有绿色荧光蛋白表达,TGN修饰后的基因递释系统表达效率高,结果如图3A所示。
再分别制备载虫荧光素酶报告基因的MePEG-PDMAEMA、TGN-PEG-PDMAEMA递释系统,将上述两种递释系统和脑毛细血管内皮细胞于培养箱中孵育1h,采用PBS溶液润洗细胞,48h后裂解细胞,裂解物漩涡、离心,取上清,分别采用荧光素酶分析系统测定基因表达产物荧光素酶的活性和BCA法测定细胞蛋白,计算荧光素酶活性单位/mg蛋白,结果TGN-PEG-PDMAEMA递释系统的细胞转染效率是MePEG-PDMAEMA递释系统的3.1倍(图3B)。
实施例7.
按实施例4分别制备TGN-PEG-PLGA-PDMAEMA/pEGFP、TGN-PEG-PLA-PDMAEMA/pEGFP和TGN-PEG-PCL-PDMAEMA/pEGFP基因递释系统,将上述三种递释系统和脑毛细血管内皮细胞于培养箱中孵育1h,采用pH7.4的PBS溶液润洗细胞,48h后荧光显微镜观察转染结果并拍照,同时以Lipofectamine2000为对照,结果显示,TGN修饰后的基因递释系统表达效率较Lipofectamine2000高,结果如图4所示。
实施例8.
Balb/c小鼠静脉注射实施例4中制备的pHPMA-PDMAEMA/DNA和TGN-pHPMA-PDMAEMA/DNA基因递释系统,剂量为50μg/鼠,1h后采用小动物活体成像仪观察基因递释系统在小鼠体内的分布情况,然后常规处理小鼠,分取脑、心、肝、脾、肺、肾等主要器官,离体观察荧光标记的基因递释系统在主要脏器中的分布情况,结果如图5所示,表明,未经脑靶向功能基TGN修饰的荧光纳米胶束经小鼠尾静脉注射后主要分布于肝、肺和肾;而经TGN修饰后,荧光纳米胶束显著增加了在脑部的蓄积量,而降低了其在肝和肾的分布。
实施例9.
Balb/c小鼠静脉注射实施例4中制备的MePEG-PDMAEMA/DNA和TGN-PEG-PDMAEMA/DNA基因递释系统,剂量为50μg/鼠,2天后取脑,4℃、4%的多聚甲醛溶液固定48h,15%和30%的蔗糖溶液中脱水24h,包埋、冷冻后进行冰冻切片,荧光试剂DAPI染核,用荧光显微镜观察小鼠脑部各区域中绿色荧光蛋白的表达情况,结果表明,本发明基因递释系统具有良好的脑靶向效果(如图6所示)。
实施例10.
采用MTT法评价MePEG-PDMAEMA和TGN-PEG-PDMAEMA对BCECs的细胞毒性。将对数生长期细胞以104/孔的密度接种于96孔培养板中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后弃去培液,然后加入100μL含有不同浓度的MePEG-PDMAEMA和TGN-PEG-PDMAEMA的溶液,以基因转染金标准25kDPEI溶液为对照;培养4h后将培液吸出,按MTT试剂盒说明书操作,以酶标仪测定570nm处的吸光度值(A);细胞存活率=(A给药组/A空白对照组)×100%;结果显示,当浓度达282.5μg/ml,无论是MePEG-PDMAEMA还是TGN-PEG-PDMAEMA仅显示出弱的细胞毒性,而PEI25kD则具强细胞毒性(如图7所示),表明MePEG-PDMAEMA和TGN-PEG-PDMAEMA具有良好的安全性。
Claims (4)
1.一种基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统,其特征在于,该脑靶向基因递释系统为包含质粒DNA、阳离子载体材料和靶向功能基TGN的纳米胶束,所述阳离子载体材料为嵌段共聚物,其包括阳离子链段和电中性链段;所述的阳离子载体材料和靶向功能基TGN组成基因递释载体;
所述阳离子链段为聚甲基丙烯酸酯,其分子量为5,000-30,000,
n为10-200;
所述的阳离子链段与电中性链段的分子比为1:1-20,二者通过原子转移自由基聚合法相连接;
所述的靶向功能基TGN与阳离子载体材料的分子比为1-10:1;
所述的阳离子链段与质粒DNA的氮磷比是0.5-20:1;
所述的脑靶向基因递释系统通过下述方法制备:采用共价键将阳离子链段聚甲基丙烯酸酯、电中性链段和脑靶向功能基TGN相连接获得基因递释载体,获得的基因递释载体与质粒DNA通过静电复合形成纳米级基因递释系统。
2.按权利要求1所述的基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述电中性链段选自聚乙二醇、聚氧乙烯、聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇、聚丙交酯-聚乙二醇或聚己内酯-聚乙二醇。
3.按权利要求2所述的基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述的聚乙二醇为甲氧基-聚乙二醇或马来酰亚胺基-聚乙二醇,其分子量为1,000-6,000,聚氧乙烯的分子量为2,000-10,000,聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺的分子量为2,000-10,000,聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇的分子量为2,000-30,000,聚丙交酯-聚乙二醇或聚己内酯-聚乙二醇的分子量为2,000-35,000。
4.按权利要求2所述的基于聚甲基丙烯酸酯的脑靶向基因递释系统,其特征在于,所述的聚乙二醇其分子量为2,000-5,000;聚氧乙烯的分子量为3,000-6,000;聚-N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺的分子量为5,000-8,000;聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇的分子量为10,000-20,000;聚丙交酯-聚乙二醇或聚己内酯-聚乙二醇的分子量为20,000-25,000。
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