CN103623097A - 一种臭山羊提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明臭山羊提取物及其制备方法和用途，涉及中草药提取物及其应用，是以臭山羊植物的根、茎和叶为原料，自然风干、粉碎，用乙醇浸提，回收溶剂乙醇，得乙醇浸膏，乙醇浸膏经pH1-3的盐酸或酒石酸酸水溶解，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯酸萃取物，水相调pH9-11，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯碱萃取物;臭山羊乙醇浸膏、乙酸乙酯酸萃取物和乙酸乙酯碱萃取物皆为棕色膏状物，经紫外-可见分光光度扫描在波长630-710nm之间有共同的吸收峰，三者都具有良好的抑制结核分枝杆菌活性。

Description

一种臭山羊提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及中草药提取物及其应用，具体地说是臭山羊提取物及其制备方法和用途。 
背景技术
臭山羊（Orixa japonicaThunb.），又名臭苗、臭常山、大山羊，为芸香科植物，具有疏风清热，行气活血，解毒除湿，截疟，镇痛的功效，主要化学成分为生物碱和挥发性物质，现今关于臭山羊的药用价值研究报道较少。而在结核病防治方面的应用更是从未见过报道。结核病作为人类史上一项难以攻克的慢性传染病，直到近几年仍保持流行趋势，其致病源为结核分枝杆菌。本发明的发明人，为进一步发掘臭山羊的药用价值，用臭山羊提取物对结核分枝杆菌标准强毒株H37RV（ATCC27294）进行体外药敏实验，结果发现臭山羊提取物具有良好的抑制结核分枝杆菌活性。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种臭山羊提取物，公开制备方法以及臭山羊提取物在制备、防治结核病药物方面的应用。 
为实现上述目的，本发明一种臭山羊提取物及其制备方法和用途，所指提取物是以臭山羊植物的根、茎和叶为原料，自然风干、粉碎，用乙醇浸提，回收溶剂乙醇，得乙醇浸膏，乙醇浸膏经pH1-3的盐酸或酒石酸酸水溶解，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯酸萃取物，水相调pH9-11，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯碱萃取物;臭山羊乙醇浸膏、臭山羊乙酸乙酯酸萃取物和臭山羊乙酸乙酯碱萃取物皆为棕色膏状物，经紫外-可见分光光度扫描在波长630-710nm之间有共同吸收峰，三者都具有良好的抑制结核分枝杆菌活性。 
本发明一种臭山羊提取物的制备方法，按下列步骤进行： 
（1）将臭山羊植物的根、茎和叶为原料，自然风干，粉碎，得臭山羊细粉；
（2）将臭山羊细粉，加90%-99%V/V乙醇，在超声波作用下浸提，超声波频率为40KHz，浸提温度为30-40℃，浸提时间为20-40min，臭山羊细粉与乙醇重量比为1:2-1:5，浸提三次，合并三次浸提液；
（3）过滤浸提液，合并滤液，经减压回收乙醇，得乙醇浸膏；
（4）乙醇浸膏用pH1-3的盐酸或酒石酸酸水溶解，用乙酸乙酯萃取，乙醇浸膏酸水溶液与乙酸乙酯体积比1:5，萃取3-5次，合并萃取液；经减压浓缩回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯酸萃取物；
（5）步骤（4）萃取后的水相用氨水调pH9-11，再用乙酸乙酯萃取，水相与乙酸乙酯体积比1:5，萃取3-5次，合并萃取液，经减压浓缩回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯碱萃取物。
本发明臭山羊提取物的用途，在于臭山羊乙醇浸膏、臭山羊乙酸乙酯酸萃取物和臭山羊乙酸乙酯碱萃取物在制备、防治结核病药物方面的应用。 
本发明三种臭山羊提取物体外抗结核分枝杆菌活性测试，包括以下步骤： 
    （1）改良罗氏培养基：依据国标GB 15987-1995配制改良罗氏培养，作为空白对照；
    （2）含异烟肼罗氏培养基：改良罗氏培养基中加入异烟肼，最终异烟肼在培养基中的终浓度为0.2μg/ml，作为阴性对照；
    （3）含提取物罗氏培养基：依据国标GB 15987-1995配制改良罗氏培养基基础后，分三组分别加入三种提取物，利用二倍稀释法对培养基中提取物量进行稀释，每种提取物稀释10个浓度梯度，蒸汽灭菌后，冰箱保存待用；
    （4）接菌量：研磨结核标准强毒菌株H37RV，添加9%无菌生理盐水以1个麦斯单位比浊管调整菌液浓度，稀释10倍和稀释1000倍，配得C1和C2两个浓度菌悬液，接菌量为刚好铺满培养基斜面；
    （5）接菌后的培养基置37℃恒温培养箱中培养4-6个星期，对比空白培养基、阴性培养基、含提取物培养基，得出药敏结果。
   三种提取物用二甲亚砜（DMSO）或吐温-80进行溶解，DMSO和吐温-80的量控制在合理范围内。 
空白培养基、阴性培养基、提取物培养基斜面对照图见说明书附图1。经过4-6周培养后，空白培养基斜面肉眼观察长满黄色的结核分枝杆菌，为阳性对照；阴性培养基斜面经肉眼观察无结核分枝杆菌生长，为阴性对照。提取物培养基斜面肉眼观察到结核分枝杆菌，与空白对照斜面的结核分枝杆菌一致，结果判定为阳性；提取物培养基斜面肉眼观察无结核分枝杆菌，与阴性培养基斜面结果一致，判定为阴性。 
附图说明
图1为实施例2中空白培养基、阴性培养基、提取物培养基斜面对照图，从图可知，乙酸乙酯碱萃取物、乙酸乙酯酸萃取物对H37RV有显著的抑制作用，相比较乙醇浸膏而言，效果更为突出，对抗结核分枝杆菌意义更大，其中1-1为空白对照；1-2阴性对照；1-3提取物培养基（阳性结果）；1-4提取物培养基（阴性结果）。 
图2为三种提取物用紫外-可见分光光度光谱扫描图，从图可知，三种提取物在波长630-710nm之间有吸收峰，有共同物质，图中1是臭山羊乙酸乙酯酸萃取物，2为臭山羊乙醇提取物，3为臭山羊乙酸乙酯碱萃取物。 
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。 
实施例1：臭山羊提取物的制备方法： 
（1）以臭山羊植物的根、茎和叶为原料，自然风干，粉碎过30目筛，得臭山羊细粉；
（2）取臭山羊细粉426.24g，加860ml 90%-99%V/V乙醇，在超声波作用下浸提，超声波频率为40KHz，浸提温度为40℃，浸提时间为40min，更换等体积乙醇，反复浸提三次，合并三次浸提液；
（3）过滤浸提液，滤液经减压回收乙醇，得乙醇浸膏 16.65g；
（4）取乙醇浸膏4.24g,加pH1-3的盐酸或酒石酸酸水溶夜5ml，加25ml乙酸乙酯萃取，萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液；减压浓缩回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯酸萃取物1.45g；
（5）步骤（4）萃取后的水相用氨水调pH9-11，再用25ml乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯碱萃取物 2.79g。
实例2：臭山羊乙醇浸膏乙酸乙酯酸萃取物、乙酸乙酯碱萃取物的药敏实验，包括以下步骤： 
   （1）改良罗氏培养基：依据国标GB 15987-1995配制改良罗氏培养，作为空白对照；
   （2）含异烟肼罗氏培养基：改良罗氏培养基中加入异烟肼，最终异烟肼在培养基中的终浓度为0.2μg/ml，作为阴性对照；
    （3）含提取物罗氏培养基：依据国标GB 15987-1995配制改良罗氏培养基基础后，分别加入乙醇提取物制备提取物培养基、乙酸乙酯酸萃取物制备的培养基、乙酸乙酯碱提取物制备的培养基，对培养基提取物的量进行稀释，乙醇提取物的浓度梯度为Y1-Y9，共9个浓度梯度,每个浓度做10支平行，蒸汽灭菌后-4℃冰箱保存待用；乙酸乙酯碱萃取物浓度梯度为S1-S10，共10个浓度梯度，每个浓度做10支平行，蒸汽灭菌后-4℃冰箱保存待用；乙酸乙酯酸萃取物，浓度梯度为F1-F10，共10个浓度梯度，每个浓度做10支平行，蒸汽灭菌后-4℃冰箱保存待用；
（4）接菌量：研磨结核标准强毒菌株H37RV，添加9%无菌生理盐水以1个麦斯单位比浊管调整菌液浓度，稀释10倍 (C1)和稀释1000倍(C1)两个浓度菌悬液，接菌量为刚好铺满培养基斜面；
    （5）接菌后的培养基置37℃恒温培养箱中培养4-6个星期，观察对比空白培养基、阴性培养基、含提取物培养基中结核分枝杆菌的生长情况，如下表：
Figure 2013106737619100002DEST_PATH_IMAGE001
Figure 89779DEST_PATH_IMAGE002
由上表可知，臭山羊乙醇提取物对结核分枝杆菌标准菌株H37RV有一定的抑制作用，当达到MIC值时，提取物培养基斜面与异烟肼培养基斜面一样，肉眼观察物无结核分枝杆菌生长，而空白培养基斜面长满菌落。说明乙醇提取物具备抑制结核分枝杆菌的能力。而乙酸乙酯碱萃取物和酸萃取物对H37RV有显著的抑制作用，效果更为突出，对抗结核分枝杆菌意义更大。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。 

Claims (3)

1. 一种臭山羊提取物，其特征是以臭山羊植物的根、茎和叶为原料，自然风干、粉碎，用乙醇浸提，回收溶剂乙醇，得乙醇浸膏，乙醇浸膏经pH1-3的盐酸或酒石酸酸水溶解，用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯酸萃取物，水相调pH9-11，再用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得乙酸乙酯碱萃取物;臭山羊乙醇浸膏、臭山羊乙酸乙酯酸萃取物和臭山羊乙酸乙酯碱萃取物皆为棕色膏状物，经紫外-可见分光光度扫描在波长630-710nm之间有共同吸收峰，三者都具有良好的抑制结核分枝杆菌活性。
2.按照权利要求1所述的一种臭山羊提取物的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
（1）将臭山羊植物的根、茎和叶为原料，自然风干，粉碎，得臭山羊细粉；
（2）将臭山羊细粉，加90%-99%V/V乙醇，在超声波作用下浸提，超声波频率为40KHz，浸提温度为30-40℃，浸提时间为20-40min，臭山羊细粉与乙醇重量比为1:2-1:5，浸提三次，合并三次浸提液；
（3）过滤浸提液，滤液经减压回收乙醇，得乙醇浸膏；
（4）乙醇浸膏用pH1-3的盐酸或酒石酸酸水溶解，用乙酸乙酯萃取，乙醇浸膏酸水溶液与乙酸乙酯体积比1:5，萃取3-5次，合并萃取液；经减压浓缩回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯酸萃取物；
（5）步骤（4）萃取后的水相用氨水调pH9-11，再用乙酸乙酯萃取，水相与乙酸乙酯体积比1:5，萃取3-5次，合并萃取液，经减压浓缩回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯碱萃取物。
3.按照权利要求1或2所述的臭山羊提取物的用途，其特征在于臭山羊乙醇浸膏、臭山羊乙酸乙酯酸萃取物和臭山羊乙酸乙酯碱萃取物在制备、防治结核病药物方面的应用。
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