CN103610862A

CN103610862A - 一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液

Info

Publication number: CN103610862A
Application number: CN201310664623.4A
Authority: CN
Inventors: 宋敏训; 林树乾; 黄中利; 赵增成; 傅剑; 李桂明; 冯敏燕
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Domestic Fowls Inst., Shandong Academy of Agricultural Sciences; Shandong Hao Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103610862B

Abstract

本发明公开了一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液。它由下述原料药制成：忍冬藤、射干、苦参、沙参、清半夏、蜜炙枇杷叶（单包）、大黄（后下）。该中草药口服液对鸡呼吸型传染性支气管炎病毒有较强的抑制作用，对鸡呼吸型传染性支气管炎防治效果好，无毒副作用。

Description

一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液

技术领域

本发明涉及一种防治鸡病毒性疾病的药物，具体地说是一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液。

背景技术

病毒性传染病是严重危害养鸡业健康发展的疾病，目前尚无特效治疗药物，虽有特异抗体进行治疗，由于交叉感染等问题，临床难以大规模使用和推广。中药在预防和治疗鸡病毒性疾病方面具有灵活配伍、随症加减、标本兼治、低毒高效等特点，是预防和治疗鸡病毒性疾病的首选药物；是减少药物残留，提高禽产品质量，保证人类健康最有效的技术措施。

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由冠状病毒科的传染性支气管炎病毒(Infectious bronehitis virus，IBV)引起的急性、高度接触性传染病。IBV可通过呼吸，直接接触感染家禽及污染的垫料、设备等，或可通过其他污染物传播。病毒主要侵害鸡呼吸系统、消化道系统和泌尿生殖道系统，出现打喷嚏、流鼻液、咳嗽、呼吸困难、气管啰音、偶尔出现鼻窦肿胀、肾脏病变、尿酸盐沉积、产蛋下降等症状。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液，其疗效显著，无毒副作用。

本发明的技术方案为：一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液，其特征是，由下述重量份的原料药制成：忍冬藤15-20、射干5-10、苦参15-20、沙参10-15、清半夏5-10、蜜炙枇杷叶（单包）10-20、大黄（后下）5-10。

优选配比为（重量份）：忍冬藤20、射干10、苦参20、沙参15、清半夏10、蜜炙枇杷叶（单包）20、大黄（后下）5。

生产工艺为：

（1）称量：按上述重量份称取各原料药，其中蜜炙枇杷叶用两层纱布单包，大黄单放；

（2）浸泡与煎煮：将大黄与其余原料药分别加温水（40～50℃）浸泡；然后将其余原料药（含浸泡使用的温水）进行煮沸40-70分钟，过滤；滤渣加入大黄及温水进行第2次煮沸40-70分钟；过滤，合并两次滤液；

（3）浓缩：真空减压（<60kpa）浓缩至浓缩液与生药（原料药）的质量比为0.8-1.2：1；

（4）防腐：加入苯甲酸钠防腐；

（5）灌装：待药液温度下降至50℃时，边搅拌边灌装，封口。

使用方法：预防，每日0.25～0.5g/kg体重，饮水，2次/日，连用3～5日；治疗，每日1.0g～1.5g/kg体重，饮水，2次/日，连用5～7日。

本发明所选中草药的药性及药理分析如下：

忍冬藤：为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb带叶的干燥茎、枝。味甘，性寒。归肺、胃经。具清热解毒，通经活络之功效。《滇南本草》：“宽中下气，消痰，祛风热，清咽喉热痛。”用于温病发热，上呼吸道感染，肺炎，流行性感冒等。现代医学研究证实叶含忍冬甙（Lonicerin）即木犀草素-7-鼠李糖葡萄糖甙（Luteolin-7-rhamno-glucoside）、木犀草素（Luteolin）等。茎含鞣质、生物碱。木犀草素在1：350,000浓度时可抑制葡萄球菌和枯草杆菌的生长。木犀草素对兔离体小肠、豚鼠气管平滑肌及回肠有解痉作用。用小鼠酚红法和大鼠毛细管法试验，木犀草素有较好的祛痰作用。

射干：为鸢尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的根状茎。味苦；性寒。入肺、肝经。具清热解毒，祛痰利咽，活血祛瘀之功效。主治咽喉肿痛，扁桃体炎，支气管炎等。《本草纲目》云：“射干，能降火，故古方治喉痹咽痛为要药。孙真人《千金方》治喉痹有乌翣膏。张仲景《金匮玉函》方治咳而上气，喉中作水鸡声，有射干麻黄汤。又治疟母鳖甲煎丸，亦用乌扇烧过，皆取其降厥阴相火也。火降则血散肿消，而痰结自解，症瘕自除矣。”

苦参：为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根。味苦；性寒。归肝；肾；大肠；小肠经；心经；膀胱经。具清热利湿；祛风杀虫之功效。现代医学研究证实苦参中含苦参碱（matrine），氧化苦参碱（oxymatrine），N-氧化槐根碱（N-oxysophocarpine）、槐定碱（sophoridine），右旋别苦参碱（-allomatrine），右旋异苦参碱（I-somatrine）等。苦参碱主要是通过兴奋β受体，尤其是兴奋中枢的β受体，解除支气管痉挛及抑制抗体和慢反应物质的释放而产生平喘作用的。苦参碱在有钙或无钙克氏营养液中，均能对抗乙酰胆碱氯化钡兴奋离体豚鼠、大鼠气管和肠管的作用。苦参总碱、氧化苦参碱对组胺致喘豚鼠的平喘效果与氨茶碱基本相似，1小时平喘率都在90%以上，而对照组在15%左右；平喘时间上，氨茶碱在6小时平喘率是55%，苦参总碱则在80%以上。槐果碱Ach的致喘作用比氨茶碱强，其平喘作用可能是通过兴奋中脑的β-受体而起作用。酚红排泌法证明、小鼠灌胃苦参总碱、黄酮0.8g／kg，有明显祛痰作用。

沙参：为桔梗科沙参属植物四叶沙参Adenophora tetraphylla（Thunb.）Fisch.[A.berticillata（Pall.）Fisch.]、杏叶沙参A.axilliflora Borb[A.stricta Miq.]或其同属植物，以根入药。味甘；性凉。归肺，胃经。具清热养阴，润肺止咳之功效。主治气管炎，肺热咳嗽，咯痰黄稠等。四叶沙参的根含沙参甙，杏叶沙参的根含花椒素。现代医学研究证实沙参有祛痰作用，可持续4小时以上。

清半夏：为天南星科半夏属植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.)Breit.）的块茎与白矾共煮后干燥而成的炮制加工品。味辛；性温；有毒。归脾、胃经。燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结。治湿痰冷饮，咳喘痰多，胸膈胀满，痰厥头痛等。现代医学研究证实20%半夏煎剂可抑制猫的人工性咳嗽。

蜜炙枇杷叶：为蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.叶的蜜炙品。味苦；性平。归肺，胃经。具化痰止咳，和胃降逆之功效。《滇南本草》有“止咳嗽，消痰定喘，能断痰丝，化顽痰，散吼喘，止气促”。《本草纲目》：“枇杷叶，治肺胃之病，大都取其下气之功耳。气下则火降痰顺，而逆者不逆，呕者不呕，渴者不渴，咳者不咳矣。”蜜枇杷叶多用于肺燥咳嗽。枇杷叶含皂甙、苦杏仁甙（Amygdalin）、齐墩果酸等。苦杏仁甙能分解出氢氰酸有一定的止咳、镇痛作用。

大黄：为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。味苦；性寒。归胃经、大肠经、肝经、脾经。具有攻积滞，清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒之功效。其主要泻下成分为结合性大黄蒽醌A、B、C(sennosideA、B、C)，其中番泻甙A为主要有效成分。

本发明中忍冬藤、射干均具有清热解毒、清咽利痰之功效，治疗传染性支气管炎发热恶寒、咽喉肿痛、气管罗音之主症，共为君药。蜜炙枇杷叶消痰定喘、止气促，沙参清热养阴，润肺止咳，二药共同辅助君药治疗本病痰庸气喘之症，共为臣药。苦参清热利湿，清半夏燥湿化痰，降逆止呕，清除脾胃之湿热，使痰无所化之源；大黄入大肠经，泻大肠湿热，肺与大肠相表里，使肺经湿热从大肠而泻，协助肺经通调水道，清解肺热为佐。枇杷叶蜜炙引药入肺经，兼为使药。本发明中枇杷叶背面有黄色绒毛，如处理不净，将刺激咽喉黏膜，故采用四层纱布单包；《本草纲目》云“治胃病以姜汁涂炙，治肺病以蜜水涂炙良。”故选用蜜炙枇杷叶。大黄久煎泻下功效降低，故后下。

中兽医认为畜禽的致病因素主要有“六淫”、“疫疠”等。“疫疠”是天地间一种可以传染的不正之气，又有“瘟疫”、“疠气”、“戾气”、“异气”、“毒气”、“乖戾之气”之称，比“六淫”之气对畜禽健康的危害更大。鸡传染性支气管炎病主要是在机体正气虚弱或“疫疠”之气IBV毒力过强时，通过呼吸道感染所致。“疫疠”客于肺卫，致使卫气郁闭，肺气不宣，出现恶寒发热、身痛、缩颈杂毛、不愿走动、鼻流清涕、咳嗽等症状。如邪疫入里，肺主肃降、通调水道之功能受阻，肺气上逆，水湿不得及时下泻郁而化痰，就会出现气喘、痰鸣。治宜清肺热解毒、宣肺平喘化痰。

本发明的有益效果是：本发明中草药口服液对鸡呼吸型传染性支气管炎病毒有较强的抑制作用，对鸡呼吸型传染性支气管炎防治效果好，无毒副作用。

附图说明

图1为气管内墨汁移动图；其中A图为用手电筒观察气管内墨汁移动图，B图为气管内墨汁移动的放大图。

图2为用药24h三组气管黏膜组织比较图；其中，A图为用药24h试验药组气管黏膜图，从A图可以看出：试验药组气管黏膜未见明显的病变；B图为用药24h对照药物组气管黏膜组织图，从B图可以看出：对照药物组部分气管黏膜上皮细胞脱落，固有层大量淋巴细胞浸润，轻度水肿；C图为用药24h IBV对照组气管黏膜组织图，从图C可以看出：用药24h IBV对照组气管黏膜固有层充血、水肿；

图3为试验结束三组气管黏膜组织图；其中，A图为试验结束试验组气管黏膜组织图（×200），从A图可以看出：试验结束试验组气管黏膜未见明显的病变；B图为试验结束药物对照组气管黏膜组织图（×200），从B图可以看出：试验结束药物对照组气管黏膜固有层见淋巴细胞浸润；C图为试验结束IBV对照组气管黏膜组织图（×200），从C图可以看出：试验结束IBV对照组气管黏膜固有层充血；

图4为肾小管上皮细胞组织图；其中，A图为试验组肾小管上皮细胞组织图（×200），从A图可以看出：试验组皮质区肾小管上皮细胞、肾小球未见明显病变；B图为药物对照组肾小管上皮细胞组织图（×100），从B图可以看出：药物对照组淋巴细胞局灶性浸润，肾小管上皮细胞颗粒及水泡变性；图C图为IBV对照组肾小管上皮细胞组织图（×100），从C图可以看出：IBV对照组肾皮质区充血、出血。

具体实施方式

实施例1

配比（重量份）：忍冬藤20、射干10、苦参20、沙参15、清半夏10、蜜炙枇杷叶20、大黄5。

生产工艺为：

（1）按上述重量份精确称取各味药，其中枇杷叶用两层纱布单包，大黄单放；

（2）浸泡与煎煮：将大黄与其余原料药分别加入6倍质量的温水（40～50℃）浸泡1小时；将其余原料药进行煮沸1小时，过滤；滤渣加入大黄并加入原料药质量4倍的温水进行第2次煮沸1小时；过滤，合并两次滤液；

（3）浓缩真空减压（<60kpa）浓缩至浓缩液与生药质量为1：1；

（4）防腐加入0.5wt%苯甲酸钠防腐；

（5）灌装：药液温度下降至50℃时，边搅拌边灌装，封口。

实施方式1鸡胚抗呼吸型传染性支气管炎病毒实验

1材料

11日龄SPF鸡胚：山东昊泰实验动物繁育中心提供；试验药：实施例1制备的中草药口服液；对照药：盐酸吗啉胍，辽宁制药总厂生产，用PBS配成0.1%的浓度的溶液备用；IBV-M41尿囊液：EID50为1×10^6.5/0.1mL，作100倍稀释备用；超净工作台：济南杰康净化设备厂产品；孵化器：北京海江孵化设备制造有限公司产品；PCR仪等。

2 方法

2.1 鸡胚接种将实施例1制备的中草药口服液分别作1倍、10倍、50倍、100倍稀释。将不同浓度的实施例1制备的中草药口服液、吗啉胍溶液各0.1mL分别与等量IBV混合，37℃水浴1h，分别接种11日龄的SPF鸡胚。实施例1制备的中草药口服液、IBV尿囊液、生理盐水各0.1ml/枚接种，分别为试验药对照组、IBV对照组和生理盐水对照组。每组10枚SPF胚。37℃孵育156h，每24h检查1次鸡胚，统计鸡胚存活率。

2.2 IBV PCR检测在超净工作台内无菌取156h活胚肾脏进行IBV PCR检测。

3 结果

3.1实施例1制备的中草药口服液对鸡胚死亡率的影响

表1 实施例1制备的中草药口服液对鸡胚死亡率的影响（%）

本发明实施例1制备的中草药口服液原液（即1倍稀释）抗100倍稀释IBV的效最好，156h死亡率为10%，与吗啉胍对照组差异显著（p＜0.05），与100倍稀释的IBV组差异极显著（p＜0.01）；吗啉胍对照组与IBV组差异不显著（p＞0.05）。

3.2活胚肾脏IBV PCR检测结果：本发明实施例1制备的中草药口服液原液组活胚肾组织无条带出现，吗啉胍对照组、IBV对照组均有条带出现。

4 结论

本发明中药口服液原药液与100倍稀释IBV-M41混合后，对IBV-M41具有较强的杀灭作用。

实施方式2中药对鸡气管纤毛运动的影响

2.1 材料 SPF公鸡：40日龄，平均体重286g；药品与试剂：实施例1制备的中草药口服液；

氨基甲酸乙酯，中华墨汁，冷光手电筒，游标卡尺，止血钳，剪刀，消毒脱脂棉等。

2.2 方法将20只公鸡随机分为中草药口服液组和生理盐水组，每组10只。中草药口服液组灌药0.3mL/次，2次/日，连用3d，生理盐水组灌服等量生理盐水。第4d停料8h，用20%氨基甲酸乙酯溶液3000mg/kg体重腹腔注射麻醉。至深麻后将鸡固定在特制的平台上，拉伸颈部，剪去颈部被毛，皮肤消毒，用手术间剪开颈部皮肤，止血钳止血，充分暴露、剥离气管。用1mL卡介苗注射器从近心脏端刺入气管内壁推入约0.02mL中华墨汁，暗室内手电筒照射下用游标卡尺测量1min内墨汁移动的距离（如图1所示）。

2.3 结果

表2 实施例1中草药口服液对鸡气管纤毛运动的影响

备注：与生理盐水组比较**P<0.01.

从表2可以看出，中草药口服液组墨汁移动距离极显著大于生理盐水对照组，极显著促进气管纤毛的运动。

实施方式3 急性毒性试验

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物

清洁级健康ICR小鼠20只，体重18～22g，雌、雄各半，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2007-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2007-0005。小鼠饲喂苏杭公司双狮牌经60Co照射的饲料，自由采食和饮水，饮用水为符合城市饮用水标准的自来水。试验前在实验动物房环境中适应饲养3d，经口给药前停饲12h，不限制饮水。

鼠饲粮的主要营养含量：水分（%）：≦10，粗蛋白（%）：≧18，粗脂肪（%）：≧4，粗纤维（%）：≧5，粗灰分（%）：≦8，钙（%）：1.0～1.8，磷（%）：0.6～1.2。

1.1.2 受试药物及配制

受试药物：本发明中草药口服液，生药含量2000mg/ml。

1.1.3 受试药物给药方法

给药途径为经口给药，小鼠给予受试药物体积为0.2ml/10g b.w.。给药前禁饲12h，不限制饮水，给药后3h饲喂。

1.2 试验步骤

1.2.1 预试验

4只小鼠（雌、雄各半）进行预试验，以最大给药浓度2000mg/ml和最大灌胃容积0.2ml/10gb.w.给药，未出现死亡。表明中草药口服液对小鼠的0/4致死剂量大于40000mg/kg b.w.。

1.2.2 正式试验

预试验中，中药口服液以最大使用浓度和最大灌胃量给药后，小鼠未出现死亡。根据农业部“兽药急性毒性试验（LD50测定）指导原则（2009）”，按最大耐受剂量法进行试验。

1.2.2.1 实验动物称重、标记编号和分组

清洁级健康ICR小鼠20只，雌雄各半，雄、雌动物分开进行正式试验。

1.2.2.2 给药方法

各组根据各小鼠体重，计算应给予的受试药物体积。按1.1.3方法经口给予受试药物。

1.2.2.3 试验观察

给药结束后，每日两次观察小鼠的一般状况，包括体重、精神状态、毛色、自主活动、呼吸、饮食欲、粪便、口鼻分泌物，中毒症状和死亡情况。对观察期间死亡小鼠进行大体解剖学检查，并记录全部大体病理变化。连续观察14天。试验结束后将存活小鼠处死，观察剖检症状。

1.2.3 数据整理

根据试验记录，整理获得各项数据。

2 试验结果

2.1 给药后症状

小鼠经口给药后未观察到异常临床症状，观察期内动物毛色光润，眼球红亮；眼、鼻、口无分泌物；行为、活动、精神状况无异常；摄食正常；大小便无异常。

2.2 经口MTD

经口给予中药口服液后观察14天，小鼠未出现死亡，也未发现异常临床症状（表3、4）。根据给药物浓度和灌胃量，中药口服液对小鼠的急性经口MTD大于40000mg/kg b.w.。

表3 经口给予中药口服液后小鼠死亡情况

3 试验结论

中药口服液对ICR小鼠的急性经口MTD大于40000mg/kg b.w.。

实施方式4亚急性毒性试验

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠80只，体重140～180克，雌、雄各半，购自扬州大学比较医学中心。动物生产许可证号：SCXK（苏）2007-0001，使用许可证号：SYXK（苏）2007-0005。大鼠饲喂苏杭公司双狮牌经60Co照射的饲料，自由采食和饮水，饮水为符合城市饮用水标准的自来水。

1.2 药品和试剂

受试药物：中药口服液，生药含量2000mg/ml。

哺乳动物血常规分析配套试剂。生化指标测定配套试剂。组织标本固定用试剂。

1.3 主要仪器

OLYMPUS Au2700全自动生化分析仪，Sysmex F-820型全自动血常规分析仪。生物显微镜，紫外分光光度计，离心机、组织病理学检查常用仪器设备等。

1.4 试验步骤

1.4.1 剂量组设计

根据“兽用化学药物安全毒理学试验指导原则”（中华人民共和国农业部第1247号公告，2009），“兽药临床前毒理学评价试验指导原则”及“兽药30天和90天喂养试验指导原则”，对于求不出LD50的受试物，30天喂养试验应尽可能涵盖人体摄入量100倍的剂量组。对于人体摄入量较大的受试物高剂量组可以按最大耐受剂量设计。本试验受试药物中药口服液对Wistar大鼠的经口MTD大于40000mg/kg b.w.。因此本试验将80只Wistar大鼠分为4组，分别为高、中、低3个剂量组和一个对照组，每组20只大鼠，雌雄各半，即40000mg/kgb.w.（高）、20000mg/kg b.w.（中）、10000mg/kg b.w.（低）三个剂量组，另设一个阴性对照组。

1.4.2 试验动物标记称重、标记编号和分组

试验前购置大鼠，饲养观察3～5天后，分别选择健康雌、雄大鼠进行称重和标记编号，采用完全随机法，将其分为4组，每组两种性别大鼠均为10只。

1.4.3 给药方案

给药途径为经口给药，大鼠每日给予受试药物体积为1ml/100g b.w.，将受试药物中药口服液用无菌蒸馏水配制并稀释成各应用浓度，连续给药30天。阴性对照组给予相同量的无菌蒸馏水灌胃。每日灌胃的时间均一致。

1.4.4 试验观察

试验期间，每天观察记录动物的一般行为表现、中毒及死亡情况；按周时间段测量记录实验大鼠体重、投入饲料量及剩余饲料量。

1.4.5 检测

1.4.5.1 血液学指标

所测血液学指标包括：红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血红蛋白(Hg b)、血小板数(PLT)、中性粒细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、嗜酸性粒细胞数。于试验结束后测定。各组取20只大鼠（雌、雄各半）采血进行血液学指标测定。

1.4.5.2 血液生化指标

所测血液生化指标包括：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、肌酐（CRE）、血糖（GLUC）、总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）等。于试验结束后测定。各组取20只大鼠（雌、雄各半）采血进行生化指标测定。

1.4.5.3 病理检查

①大体解剖

于试验结束时，各组取20只大鼠（雌、雄各半）进行剖检（结合采血进行）。做好记录，并将重要器官和组织固定保存。

②脏器称量

剖检试验大鼠的同时，称取大鼠体重及各主要脏器（包括肝、肾、脾、睾丸）重量，做好记录。计算各脏器的相对重量（脏/体比值）。

③组织病理学检查

对高剂量组及对照组大鼠的主要脏器进行组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。肝、肾、脾、胃肠、睾丸及卵巢的组织病理学检查为必测项目。

1.5 试验结果整理及数据分析

1.5.1 数据整理

（1）整理归纳各试验组大鼠的临床表现。

（2）整理大鼠的饲料摄入量和增重，求取各剂量组大鼠的平均增重率（表述为

）。

（3）整理测得的血液学指标，求取各指标的组内平均值（表述为）。

（4）整理测得的血液生化指标，求取各指标的组内平均值（表述为

）。

（5）整理测得的大鼠体重及其主要脏器重量，计算脏/体比值（脏器系数），求取各试验组大鼠脏器系数的平均值（表述为）。

（6）归纳各试验组大鼠剖检和组织病理学检查结果，并与阴性对照组进行比较分析。

1.5.2 数据分析

以统计学方法分析上述整理的数据，比较受试物各试验组与阴性对照组之间的差异显著性。

1.6 结果评价

综合试验观察结果，评价受试物作用下大鼠的临床表现。结合数据评价受试物对大鼠增重率及总体生长情况的影响，对大鼠血液学指标和血液生化指标的影响，对大鼠脏器系数的影响，对大鼠组织器官造成的病理变化。

2 试验结果与分析

2.1 中药口服液对大鼠自然状况和体重的影响

经口给予大鼠中药口服液进行30天喂养试验，在试验过程中，观察到各组大鼠的进食、饮水、精神状态、活动状况、被毛光泽度均无异常变化。体重均在正常范围内增长（表5）。对表5中受试物各剂量组大鼠和空白对照组大鼠体重进行统计学分析（t检验）。结果表明，在试验结束后受试物各剂量组大鼠的体重与阴性对照组相比差异不显著（P>0.05），给药期间受试物3个剂量组的大鼠体重增加幅度与阴性对照组间差异不显著（P>0.05）。

2.2 中药口服液对大鼠血液生理指标的影响

试验结束后，将大鼠处死后取血，用全自动血液生理指标分析仪对大鼠血液生理指标进行测定（表6）。对表6数据进行统计学分析（t检验）。结果表明，在试验中受试物各剂量组大鼠的红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血红蛋白(Hg b)、血小板数(PLT)、中性粒细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、嗜酸性粒细胞数与阴性对照组相比差异不显著(P>0.05)。

2.3 中药口服液对大鼠血液生化指标的影响

在试验结束后，大鼠取血、分离血清，用自动血液生化指标分析仪对大白鼠血液生化指标进行测定（表7）。从表7数据可以看出，受试物各剂量组大鼠的血液生化指标与阴性对照组大鼠相应指标均在正常范围内。受试物3个剂量组大鼠的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、肌酐（CRE）、血糖（GLUC）、总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）指标与阴性对照组相应指标间差异不显著（P>0.05）。

2.4 大鼠的病理解剖与病理组织学变化

2.4.1 大体剖检

试验结束后，各组取20只大鼠（雌、雄各半）进行剖检。受试物3个剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、胃和肠与阴性对照组大鼠的各相应脏器比较无肉眼可见的病理变化。

2.4.2 脏器系数

大鼠连续染毒30d的脏器系数指标测定结果分别见表8。统计学分析显示，中药口服液各剂量组的脏器系数与阴性对照组相比，差异不显著（P>0.05）。

2.4.2 组织学观察

试验结束后，取高剂量组及对照组所有剖检大鼠心、肝、脾、肾、肠和胸腺组织，石蜡包埋，切片，H-E染色，于普通光镜下观察，受试物各剂量组与阴对照组相比较均未见任何明显病理变化。

3 试验结论

中药口服液连续给药30d，各剂量组动物生长发育良好，体重、脏器系数、血常规和血液生化指标等各项指标与对照组之间均无统计学差异，且均在正常范围。其中母鼠的体重、增重、耗料及饲料利用率较公鼠的少，可解释为性别差异所造成。

综上所述，在本试验条件下，未发现中药口服液对Wistar大鼠的生长发育产生影响，长期重复应用无亚急性毒性。

表5 试验结束后中药口服液对大鼠体重增长的影响(

n=10)

表6 试验结束后中药口服液对大鼠血液学指标的影响(n=10)

实施方式5 靶动物安全性试验

本试验为不同剂量本发明中草药口服液作用于靶动物（鸡）后，观察药物对靶动物的影响情况，旨在考察中药服液用于靶动物的安全性及安全剂量范围，为进一步临床试验给药方案的制定提供依据。依据《兽用中药、天然药物临床试验技术指导原则》，本试验选择中药口服液临床推荐剂量的1倍、3倍和5倍低、中、高剂量进行考察。

1 试验材料

1.1 试验仪器

美国热电Thermo微量高速离心机；

ACS-电子计重秤，由上海三积分电子有限公司生产；

东芝TBA-40FR生化分析仪，由株式会式三广医疗生产等；

1.2 试验药物

实施例1制备的中药口服液。

1.3 试验试剂

丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒（速率法），规格：液体双剂型（R1:R2=4:1），批号：120371，由中生北控生物科技股份有限公司生产；

总胆红素测定试剂盒（钒酸盐法），规格：液体双剂型，批号：120371，由中生北控生物科技股份有限公司生产；

肌酐测定试剂盒（苦味酸法），规格：液体双剂型，批号：120371，由中生北控生物科技股份有限公司生产；

尿素测定试剂盒（酶偶联速率法），规格：液体双剂型，批号：120371，由中生北控生物科技股份有限公司生产。

1.4 试验动物

17日龄SPF公鸡，购于山东昊泰实验动物繁育股份有限公司，自由采食饮水。

2 试验方法

2.1 分组将150只雏鸡，随机分成3组，每组30只，分别为1倍、3倍、5倍和空白对照组。各试验组鸡按使用剂量的1倍、3倍、5倍连续饮水给药5d，空白组自由饮自来水。

2.2 观察指标

2.2.1 一般健康状况观察试验期间每天观察各组试验鸡的精神、采食量、粪便等情况，并记录死亡情况，与对照组相比较。

2.2.2 血液学指标于末次给药24h每组随机扑杀15只鸡，进行血清生化指标测定：谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、总胆红素（TBI）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血糖（GLU）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）；血液生理指标测定：红细胞（RBC）、白细胞（WBC）血红蛋白（Hb）。

2.2.3 组织病理学检查解剖观察鸡内脏组织器官的病变，统计病变率，并取心、肝、脾、肺、肾等组织进行病理学检查。

3 数据统计分析

用SPSS应用软件进行数据的显著性检验。采用t检验比较试验组与对照组间均增重、料重比(饲料利用率)、血液学和血液生化学等各项指标的显著性差异。

4 结果

4.1 对鸡体重的影响

表9 对鸡体重的影响（n=30.g.%）

组别	低剂量	中剂量	高剂量	空白
					试验前（g）	91.6±15.8a	92.3±8.5a	88.9±11.2a	86.5±12.4a
试验结束（g）	144.4±15.9a	129.6±9.2ab	124.2±17.7ab	118.2±17.5bc
					绝对增重（g）	46.9	30.9	29.3	26.1
增重率（%）	48.1	31.31	30.87	28.34

从表9可见各试验组绝对增重、增重率均大于对照组，5倍药量对鸡体重均有不同程度的促进作用，低剂量组体重显著大于空白组。

4.2 对鸡免疫器官的影响

表10 对鸡免疫器官的影响（n=30）

组别	低剂量	中剂量	高剂量	空白
					胸腺指数	4.76±0.51	4.56±0.32	4.09±1.34	3.84±0.91
脾脏指数	1.04±0.26	0.92±0.18	0.81±0.15	0.89±0.12
					法氏囊指数	4.26±0.95	4.23±0.78	4.12±0.97	4.53±0.49

从表10可见胸腺指数低、中、高剂量组均大于对照组；脾脏指数各组间差异不显著；法氏囊指数低、中、高剂量组均小于对照组，各组间差异不显著。

4.3 对鸡生化指标的影响

表11 用药5d对鸡生化指标的影响

处理	低剂量	中剂量	高剂量	空白
					谷丙转氨酶（U/L）	1.6±0.2	1.5±0.2	1.4±0.2	1.3±0.3
谷草转氨酶（U/L）	270±25.1	262±10.6	239.8±2.4	227±13.5
					碱性磷酸酶（U/L）	2287.8±592.6	2478.5±156.0	2536.2±139.1	4641.3±1314.9
谷氨酰胺转移酶（U/L）	21.6±1.2	21.0±0.9	20.6±0.8	20.7±1.5
					总蛋白(g/L)	25.9±1.1	26.5±1.2	27.1±1.2	24.6±0.8
白蛋白(g/L)	11.4±0.4	12.1±0.3	12.3±0.5	10.9±0.3
					球蛋白(g/L)	14.5±1.0	14.6±0.8	14.8±0.8	13.7±0.5
白球比	0.8±0.6	0.8±0.4	0.8±0.2	0.8±0
					总胆红素(μ mol/L)	25.7±6.4	23.5±5.2	20.4±1.13	24.3±4.9
直接胆红素(μ mol/L)	3.8±1.3	3.1±0.7	2.9±0.3	3.4±0.9

间接胆红素(μmol/L)	21.9±5.1	19.3±2.4	17.5±0.8	21.0±4.0
					尿素氮(mmol/L)	0.3±0.1	0.3±0.1	0.3±0.0	0.3±0.1
肌酐(μmol/L)	5.0±0.6	4.9±0.1	4.7±0.7	5.6±0.8
					葡萄糖(mmol/L)	17.6±0.5	17.3±0.3	16.8±0.4	18.2±0.4

从表11可见给药5d中药各剂量组的血清生化参数与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

4.4 病理学检查

试验结束时对各组处死的雏鸡进行剖检，发现各组脏器大小正常；胸腔、腹腔、心包无积液与粘连；肝、脾、肾色泽均匀。表面光滑，无肿大及包块；胃、十二指肠亦未发现溃疡、出血点及其他异常变，组织病理学切片检查表明，5倍推荐剂量组的心、肝、脾、肺、肾等均未发现显微病理学变化。

5 结论

该中药制剂1倍、3倍、5倍推荐剂量组试验鸡在健康状况、食欲情况，以及可能的急性反应、血液学、临床生化学等参数指标与未用药照组相比无显著性差异，剖检和组织学观察主要内脏器官的形态、组织结构均未发现异常变化。具有较高的临床用药安全性。

实施方式6 雏鸡呼吸型传染性支气管炎攻毒保护试验

3.1 材料与方法

3.1.1 材料 14日龄SPF雏鸡，山东昊泰实验动物繁育中心提供；SPF鸡饲养隔离器，苏州冯氏实验动设备有限公司；试验药：实施例1制备的中草药口服液；麻杏石甘口服液，洛阳惠中兽药有限公司产品，批准文号：兽药字（2013）160036112，批号：20130501；IBV-M41尿囊液，EID50为1×106.5/0.1mL；饲料、饮水等。

3.1.2 方法雏鸡饲养在隔离器内，温度控制在15-18℃。

3.1.2.1 分组与用药：分试验药物组、对照药物组、IBV对照组和空白对照组，每组20只鸡，逐只鸡编号、称重。试验药物组与对照药物组均于攻毒24h用药，试验药0.5mL/只，每日2次，对照药1mL药液兑水1L，自由饮水，连用5天，用药前控水1-2小时；攻毒对照组采用同样方式使用等量生理盐水；空白对照组不攻毒、不用药，正常饮水。

3.1.2.2 攻毒方法：IBV-M41尿囊液0.3mL/只，两侧滴鼻。

3.1.2.3 观察指标与标准：详细统计各组发病率、死亡率、给药1-3d发病鸡的治愈时间、评分分。

发病标准：凡出现精神不振、气喘、甩鼻、鼻孔粘液堵塞的鸡均判为发病。

评分标准：精神不振2分，甩鼻3分，鼻孔粘液堵塞5分，甩鼻+鼻孔粘液者8分，气喘者10分。

3.1.2.4 免疫指标测定：空腹称重，用器官重量比法进行免疫器官(法氏囊、胸腺和脾脏)指数的测定。采用MTT法测定各组淋巴细胞转化率。

3.1.2.5 器官（气管、肺）病理变化：无菌取用药24h和试验结束有症状鸡肺脏、气管、肾脏，分别用甲醛固定，石蜡包埋，切片，H-E染色，于普通光镜下观察。

3.1.2.6 IBV RT-PCR检测：无菌取鸡的气管、肺脏、肾脏研磨，离心，取上清液，进行RT-PCR检测。

3.1.2.7 数据分析以统计学方法分析上述整理的数据，比较受试物各试验组与阴性对照组之间的差异显著性。

3.2 结果

3.2.1本发明实施例1中药口服液对鸡发病率的影响

表12 发病率的影响（%）

注：同一行数字肩标小写字母不同差异显著，大写字母不同差异极显著。

从表12可见：用药期间试验组、药物对照组、IBV对照组间发病率无显著差异（P＞0.05）；停药第1天、第2天试验组发病率均显著低于药物对照组(P＜0.05)、极显著低于IBV对照组(P＜0.01)，药物对照组、IBV对照组间差异不显著（P＞0.05）；停药第3天试验组、药物对照组发病率均极显著低于IBV对照组(P＜0.01)，试验组、药物对照组间差异不显著（P＞0.05）。空白对照组均未发病。

3.2.2本发明实施例1中草药口服液对治愈时间的影响分别统计用药1-3天发病鸡的平均治愈时间，试验组治愈时间均低于药物对照组和IBV对照组，但差异均不显著（P＞0.05）。详见表13.

表13 治愈时间的影响（d）

3.2.3免疫指标的影响

3.2.3.1免疫器官指数的影响试验组免疫器官指数均大于IBV组；试验组、对照药物组IBV组脾脏指数均低于空白组（详见表14）。

表14 试验结束各组免疫器官指数的影响

4.2.3.2实施例1中草药口服液对淋巴细胞转化率的影响试验组吸光值高于IBV组和空白组，IBV组吸光值低于空白组，证实IBV感染降低鸡淋巴细胞转化率和免疫力（详见表15）。

表15 试验结束各组淋巴细胞转化率的影响（570nm处吸光值）

4.2.4对肺脏、气管、肾脏病理组织学的影响

试验组气管黏膜、肾脏均未见明显病变，而对照药物和IBV组均见明显病理变化（详见图2-4）；试验药物对IBV感染鸡的气管、肾脏具有明显的保护作用。

实施例2

优选配比为（重量份）：忍冬藤19、射干10、苦参18、沙参11、清半夏10、蜜炙枇杷叶19（单包）、大黄10。

生产工艺及使用方法同实施例1。

实施例3

优选配比为（重量份）：忍冬藤15、射干5、苦参15、沙参16、清半夏5、蜜炙枇杷叶15（单包）、大黄9。

生产工艺及使用方法同实施例1。

Claims

1.一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液，其特征是，由下述重量份的原料药制成：忍冬藤15-20、射干5-10、苦参15-20、沙参10-15、清半夏5-10、蜜炙枇杷叶10-20、大黄5-10；其中蜜炙枇杷叶采用两层纱布单包；大黄后下。

2.如权利要求1所述的一种防治鸡呼吸型传染性支气管炎的中草药口服液，其特征是，由下述重量份的原料药制成：忍冬藤20、射干10、苦参20、沙参15、清半夏10、蜜炙枇杷叶20、大黄5。

3.如权利要求1或2所述的中草药口服液的生产工艺，其特征是，

（1）称量：按权利要求1或2所述重量份称取各原料药，其中蜜炙枇杷叶用两层纱布单包，大黄单放；

（2）浸泡与煎煮：将大黄与其余原料药分别加温水浸泡；然后将其余原料药进行煮沸40-70分钟，过滤；滤渣加入大黄及温水进行第2次煮沸40-70分钟；过滤，合并两次滤液；

（3）浓缩：真空减压浓缩至浓缩液与原料药的质量比为0.8-1.2：1；

（4）防腐：加入苯甲酸钠防腐；

4.如权利要求3所述的中草药口服液的生产工艺，其特征是，所述苯甲酸钠加入量为0.5wt%。

5.如权利要求3所述的中草药口服液的生产工艺，其特征是，所述步骤（3）浓缩至浓缩液与原料药的质量比为1：1。