CN103588843A

CN103588843A - 一种从发酵柠檬酸废菌丝体中提取麦角固醇的方法

Info

Publication number: CN103588843A
Application number: CN201310577514.9A
Authority: CN
Inventors: 李荣杰; 尚海涛; 杨为华; 邓远德; 吴鹏举; 左成彬; 单勇
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明提供了一种从发酵柠檬酸废菌丝体中提取麦角固醇的方法，是将发酵用废菌丝体用水洗至中性后，用稀碱将其皂化，皂化后的菌丝体水洗去色素等杂质，然后将皂化后的菌丝体投入萃取罐，用正丁醇提取其中的麦角固醇，浓缩提取液得到麦角固醇粗品；然后利用水和乙醇重结晶得到较纯产品。本发明采用正丁醇进行萃取避免了高毒性的甲苯、甲醇、乙醚等有机溶剂，大大提高了提取率和产品纯度，蒸馏回收的正丁醇分水后可直接循环再利用，降低了成本，工艺流程简单，既解决废菌丝体的污染问题又得到低成本的麦角固醇，减少“三废”的产生。

Description

一种从发酵柠檬酸废菌丝体中提取麦角固醇的方法

技术领域

本发明涉及一种提取麦角固醇的方法，属于生物工程和环境科学的交叉技术领域。

背景技术

麦角固醇又名麦角甾醇，又有时被称为麦角甾醇水合物，(22E,24R)-麦角甾烷-5,7,22-三烯-3β醇等；英文名为Ergosterol，分子式C₂₈H₄₄O，分子量396.65；它是一种植物固醇，在动物体内起到维生素D前体的作用，是一种重要的医药化学原料，可用于“考的松”和“激素黄体酮”等药物和农药的使用，存在于酵母和某些植物中，当它受紫外线照射时，分子中四个碳环中的一个发生断裂，变成维生素D₂，因此麦角固醇成为工业化大批量生产维生素D₂的主要原料。由于维生素D₂是动物和人维持正常生理活动的微量有机化合物之一，药品、食品和饲料中都可以添加维生素D₂来满足人和动物的摄入需求。

目前，国内生产麦角固醇的生产方法有两种：一种是采用发酵法，发酵菌株主要是酵母、曲霉菌等，酵母发酵后收集酵母，经皂化、萃取、结晶等工艺得到麦角固醇晶体，通过该方法生产麦角固醇所需原料时间长，成本高，且制备工艺周期长，所得麦角固醇成品的纯度较低。另一种生产方法是从废菌丝体中提取麦角固醇，利用微生物发酵过程中产生的副产物麦角固醇这一反应机理；由于废菌丝体中原料成分复杂、来源不一，麦角固醇的提取率极低，因而提取工艺复杂、提取成本高、产品纯度低、质量不稳定，很难工业化；因此目前绝大多数生产方法都是采用前者，后者虽然理论上也可进行，但是实际生产中因其提取工艺复杂，成本高昂，提取率很低，质量不稳定，因而受到很大限制，实际价值不大；另外，提取过程中要使用有毒有害的有机溶剂，一方面对工人健康造成潜在的危害，另一方面也对环境存在较大污染。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，通过对麦角固醇的生产方法进行研究，发现通过改进具体的提取溶剂、提取工艺和参数，即使利用废菌丝体进行提取，也能够实现生产成本低、提取率高、纯度高、质量稳定、易于工业化生产等优点。从而利用发酵柠檬酸的废菌丝体提取麦角固醇的新方法解决了上述问题，在避免使用高毒有机溶剂的前提下成功实现了提取率和纯度的提高以及成本的降低。

本发明的从废菌丝体中提取麦角固醇的生产方法包括以下几个步骤：

（1）将发酵柠檬酸的废菌丝体用自来水洗至接近中性后，加入稀碱溶液进行皂化处理，皂化完全后过滤，水洗菌丝体至滤液基本无色；

（2）将皂化水洗后的菌丝体投到皂化罐，加入有机溶剂（正丁醇），充分混匀后加热进行热提取，浓缩滤液得到麦角固醇粗品；

（3）将麦角固醇粗品溶解在乙醇溶液中进行重结晶，后过滤真空干燥得到纯品麦角固醇。

优选地，步骤（1）中所述皂化步骤中，采用的稀碱溶液是NaOH溶液；NaOH溶液浓度优选为0.5wt%-20wt%，最适宜浓度为2wt%-5wt%。

所述皂化反应所用的NaOH溶液的量与菌丝体的体积比为1：1-4：1。所述皂化反应所用的NaOH溶液的质量与菌丝体的质量比为1:1-4:1。

皂化温度则控制在85-95℃最佳。

皂化反应时间控制在2-2.5h为最适宜时间。

优选地，步骤（1）中所述水洗皂化后的菌丝体的pH值在9-10最适宜。

步骤（2）中正丁醇热提取的温度为90-100℃；优选地，最适宜温度在95-97℃，保温时间1.5-2.5h最适宜。

所述正丁醇的用量占溶液体积比的60-80%最适宜。正丁醇提取麦角固醇的次数为3-4次最适宜。

步骤（3）中所述乙醇溶液中，水和乙醇比为体积比为3：1-5：1为最适宜。

本发明的从发酵柠檬酸废菌丝体中提取麦角固醇的方法优选地包括以下步骤：

（1）除杂：将发酵柠檬酸的废菌丝体用体积倍数4-6倍水进行洗涤，使其中的发酵带出的杂质去除，且一定程度上降低菌丝体的酸性，防止降低皂化时的稀碱浓度而导致皂化不完全。

（2）皂化：将洗涤后的菌丝体、2-5wt%的NaOH溶液加入到皂化罐中进行加热、搅拌进行皂化反应，其中菌丝体（含水量75wt%）与碱液的投量比为质量比为1：2，皂化温度选择95-97℃，皂化反应时间为2-2.5h，趁热过滤。

（3）洗涤：将皂化后的菌丝体用水洗涤至pH在9-10，滤液基本呈现无色状态。

（4）提取：皂化洗涤后的菌丝体中加入正丁醇充分混匀、搅拌。其中加入正丁醇的量与菌丝体的量比约为体积质量比为2:1（L:kg），加热条件下进行抽提3次，保温时间1.5-2.5h，抽提萃取时温度选择在85-95℃。

（5）浓缩：将提取液在55-60℃下进行减压浓缩，加入水使水和正丁醇产生共沸带出正丁醇，回收的正丁醇在热提取循环再利用。浓缩后的麦角固醇提取液放入冷冻结晶。加水量以能够使水和正丁醇产生并保持共沸为宜。

（6）重结晶：过滤结晶后的麦角固醇提取液，将过滤后的母液应用到下一批的氨基葡萄糖盐酸盐溶液的浓缩中。将麦角固醇溶解在水和乙醇体积比为3:1-5:1的酒精进行重结晶，过滤真空干燥得到麦角固醇纯品。其中，上述步骤（2）中搅拌速度优选为480-520r/min，步骤（4）中搅拌速度优选为400-420r/min，步骤（5）中浓缩倍数优选约为原体积的1/20。

本发明的提取方法中，不采用除了正丁醇之外的其他有机溶剂，因而大大降低了毒性，方便操作，且通过具体工艺优化，即使使用正丁醇，也实现了非常好的提取率，产品纯度很高。

采用本发明提取麦角固醇的方法，利用发酵用废柠檬酸菌丝体、NaOH、正丁醇、乙醇等常用化工原料和一般化工设备，避免甲苯、甲醇等高毒有机溶剂的情况下提高提取率和纯度，生产成本低，操作简单，为大批量生产麦角固醇提供了一定的工艺保障。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例1-3中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

将原料柠檬酸发酵后用清水洗至中性的菌丝体1kg(含水质量百分比为74.42%)放入皂化罐中，向其中加入2kg的重量百分浓度为4%NaOH溶液，加热到90℃条件下以510r/min搅拌速度进行皂化反应2h，反应完成后过滤除去色素等杂质，并水洗固相至pH值为9，溶液基本无色，抽滤至溶液基本不流出为止。将固相返回提取罐中，向其中依次加入2.5L、2L、1.5L的正丁醇在95-97℃进行三次提取，搅拌速度维持在400r/min，每次都是趁热进行固液分离，然后合并三次萃取液，将提取液（有机相）在60℃进行减压浓缩（加入水使水和正丁醇产生共沸带出正丁醇，回收的正丁醇在热提取循环再利用）。低真空条件下进行浓缩至有机相总体积的1/20进行低温结晶，浓缩后的麦角固醇提取液放入冷冻结晶，过滤得到麦角固醇粗品2.2g，紫外检测纯度85.1%，用乙醇和水重结晶后得到麦角固醇1.3g，色谱柱：HC-C18柱（4.6mm*150mm,5μm），柱温：30℃，流动相：纯甲醇，流速1.5mL/min，检测波长：218nm，进样量10ml,，运行时间：10min。检测仪器：Agilent Technologies1200series（请注明检测的方法、设备和条件，以增强可信度），纯度97%。收率达到0.48%（以菌丝体干重计）。

实施例2

将原料柠檬酸发酵后用清水洗至中性的菌丝体1kg(含水量为74.42%)放入皂化罐中，向其中加入2kg的重量百分浓度为2%NaOH溶液，加热到95℃条件下以520r/min搅拌速度进行皂化反应2.0h，反应完成后过滤除去色素等杂质，并水洗固相至pH值在10，溶液基本无色，抽滤至溶液基本不流出为止。将固相返回提取罐中，向其中依次加入2.5L、2L、1.5L的正丁醇在95-97℃进行三次提取，搅拌速度维持在410r/min，每次都是趁热进行固液分离，然后合并三次萃取液，将有机相在58℃进行减压浓缩（加入水使水和正丁醇产生共沸带出正丁醇，回收的正丁醇在热提取循环再利用）。，低真空条件下进行浓缩至有机相总体积的1/20进行低温结晶，过滤得到麦角固醇粗品2.5g，紫外检测粗品纯度82.1%，用乙醇和水重结晶后得到麦角固醇1.65g，色谱柱：HC-C18柱（4.6mm*150mm,5μm），柱温：30℃，流动相：纯甲醇，流速1.5mL/min，检测波长：218nm，进样量10ml,，运行时间：10min。检测仪器：Agilent Technologies1200series（请注明检测的方法、设备和条件，以增强可信度），纯度98%，收率达到0.60%（以菌丝体干重计）。

实施例3

将原料柠檬酸发酵后用清水洗至中性的菌丝体1kg含水量为74.42%放入皂化罐中，向其中加入2kg的重量百分浓度为5%NaOH溶液，加热到100℃条件下以480r/min搅拌速度进行皂化反应2.5h，反应完成后过滤除去色素等杂质，并水洗固相至pH值在9，溶液基本无色，抽滤至溶液基本不流出为止。将固相返回提取罐中，向其中依次加入2.5L、2L、1.5L的正丁醇在95-97℃进行三次提取，搅拌速度维持在420r/min，每次都是趁热进行固液分离，然后合并三次萃取液，将有机相在55℃进行减压浓缩（加入水使水和正丁醇产生共沸带出正丁醇，回收的正丁醇在热提取循环再利用）。，低真空条件下进行浓缩至有机相总体积的1/20进行低温结晶，过滤得到麦角固醇粗品2.2g，母液循环套用，紫外检测粗品纯度77.5%，用乙醇和水重结晶后得到麦角固醇1.4g，色谱柱：HC-C18柱（4.6mm*150mm,5μm），柱温：30℃，流动相：纯甲醇，流速1.5mL/min，检测波长：218nm，进样量10ml,，运行时间：10min。检测仪器：Agilent Technologies1200series（请注明检测的方法、设备和条件，以增强可信度），纯度97%，收率0.54%（以菌丝体干重计）。

Claims

1.一种从发酵柠檬酸废菌丝体中提取麦角固醇的方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：

（1）将发酵柠檬酸的废菌丝体用自来水洗至中性，加入稀碱溶液进行皂化处理，皂化完全后过滤，水洗菌丝体至滤液基本无色；

（2）将皂化水洗后的菌丝体投到皂化罐，加入有机溶剂，充分混匀后加热进行热提取，浓缩滤液得到麦角固醇粗品；

2.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中所述皂化步骤中，采用的稀碱溶液是NaOH溶液。

3.根据权利要求2所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中所述皂化步骤中，采用的NaOH溶液浓度为0.5wt%-20wt%。

4.根据权利要求2所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中所述皂化步骤中，皂化温度为85-95℃。

5.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的工艺方法，其特征在于，步骤（1）中所述皂化反应时间为2-2.5h。

6.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中所述皂化反应所用的NaOH的量与菌丝体的质量百分比为1:1-4:1。

7.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于，步骤（1）中所述水洗皂化后的菌丝体的pH值在9-10。

8.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的工艺方法，其特征在于，步骤（2）中所述有机溶剂是正丁醇。

9.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于：步骤（2）中所述正丁醇热提取的温度在90-100℃。

10.根据权利要求1所述的提取菌丝体中的麦角固醇的方法，其特征在于：步骤（2）中所述正丁醇热提取的保温时间为1.5-2.5h。