一种丛菔提取物在制备治疗肺结核药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种中药材提取物在制备治疗肺结核药物中的应用,具体是涉及丛菔提取物在制备治疗肺结核药物中的应用。
背景技术
肺结核是由结核分枝杆菌入侵机体后在一定条件下引起发病的慢性传染性疾病。目前全球结核病防治形势严峻,2006年全球新增920万个结核病例,2006年有170万人死于结核病。肺结核的治疗以化学治疗为主,近年来结核病免疫学研究大踏步前进,使人们对结核病的发病、临床经过、预后和复发有了更全面的认识。由于结核病免疫学理论的更新,化学治疗和免疫治疗相结合的疗法成为部分患者有效的治疗模式。近年来大量的中医药基础研究显示,中药治疗有杀菌、抑菌、降低毒性、降低耐药发生率和提高患者免疫功能等优势。
近年来,耐多药菌株和高耐药率结核杆菌使得难治性肺结核迅速增多。西药“全程联合”化疗模式的肝毒性致命弱点,使得西药治疗肺结核受到局限,中医药治疗结核病成为关注的热点,优势包括:一是中医辨证论治,对症治疗,首先能减轻症状,促进患者抗病能力的恢复,缓解并发症,为病人树立其良好的信心。二是中药复方不易引起病菌耐药性,在治疗耐药性肺结核和减缓结核杆菌变异速度方面具有很大的潜力。
肺结核初起在肺,久则累及脾肾,甚则传遍五脏,在整个疾病过程中表现为气阴亏耗、阴虚火旺、阴阳两虚等正虚证候。肺结核治则补虚培元、扶正杀虫。治疗中,应注重调补肺脾肾三脏,如《理虚元鉴》:“治虚有三本,肺脾肾是也,肺为五脏之天,脾为百骸之母,肾为万物之源,治肺治脾治肾,治劳之道毕矣”。
丛菔为十字花科植物宽果丛菔Solms-Laubachia eurycarpa(Maxim.)Bofsch 的干燥根或全草。花盛期采收,洗净晾干。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准 藏药(第一册)》,标准编号:WS3-BC-0029-95。性凉,味苦。具有清肺热、退烧之功效。用于肺炎上胸部发烧等。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关丛菔的基础研究尚十分有限,使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明丛菔的化学成分主要有β-谷甾醇硬酸酯、硬脂酸酯、正二十烷醇、β-谷甾醇、花生醇、新蜡酸、花生酸、硬脂酸、白芥酸、亚油酸、亚麻酸等。药理作用鲜有报道。
国内专利检索,未见丛菔相关专利报道。
上述文献及专利等,尚未见丛菔提取物用于制备治疗肺结核药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丛菔提取物在制备治疗肺结核药物中的应用。
本发明所用丛菔为十字花科植物宽果丛菔Solms-Laubachia eurycarpa(Maxim.)Bofsch 的干燥根或全草。
本发明一种丛菔提取物在制备治疗肺结核药物中的应用,所述丛菔提取物的制备方法为:
(1)丛菔,用浓度80%-100%乙醇作为溶剂,加热回流提取,提取次数为1-3次,每次提取时间为1-4小时,每次溶剂用量为丛菔重量的8-15倍,滤过,得药渣A和提取液,提取液回收乙醇,浓缩,干燥,得丛菔提取物A;
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度0-20%乙醇为溶剂,加热回流提取,提取次数为1-3次,每次提取时间为1-4小时,每次溶剂用量为丛菔重量的8-15倍,滤过,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度d=1.10-1.12,滤过,得药液B;
(3)将步骤(2)得到的药液B,通过非极性大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,水洗脱液直接通过极性大孔树脂柱,再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂柱,收集不同浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物B;再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂柱,收集不同浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物C;
(4)上述丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C,其中一种或两种或三种按一定比例混匀,即得本发明的丛菔提取物。
丛菔提取物的制备方法为:
(1)丛菔,用浓度80%-100%乙醇作为溶剂,加热回流提取,提取次数为1-3次,每次提取时间为1-4小时,每次溶剂用量为丛菔重量的8-15倍,滤过,得药渣A和提取液,提取液回收乙醇,浓缩,干燥,得丛菔提取物A;
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度0-20%乙醇为溶剂,加热回流提取,提取次数为1-3次,每次提取时间为1-4小时,每次溶剂用量为丛菔重量的8-15倍,滤过,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度d=1.10-1.12,滤过,得药液B;
(3)将步骤(2)得到的药液B,通过非极性大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,水洗脱液直接通过极性大孔树脂柱,再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱非极性大孔吸附树脂柱,收集不同浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物B;再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱极性大孔吸附树脂柱,收集不同浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物C;
(4)将上述丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C混匀,即得本发明的丛菔提取物。
优选的丛菔提取物的制备方法为:
(1)丛菔,用浓度95%乙醇作为溶剂,加热回流提取,提取次数为3次,每次提取时间为2小时,每次溶剂用量为丛菔重量的12倍,滤过,得药渣A和提取液,提取液回收乙醇,浓缩,干燥,得丛菔提取物A;
(2)将步骤(1)得到药渣A用水为溶剂,加热回流提取,提取次数为2次,每次提取时间为2小时,每次溶剂用量为丛菔重量的12倍,滤过,提取液浓缩至相对密度d=1.11,滤过,得药液B;
(3)将步骤(2)得到的药液B,通过D101非极性大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,水洗脱液直接通过HPD600极性大孔树脂柱,再用浓度60%的乙醇溶液洗脱D101非极性大孔吸附树脂柱,收集60%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物B;再用浓度60%的乙醇溶液洗脱HPD600极性大孔吸附树脂柱,收集60%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物C;
(4)将上述丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C混匀,即得本发明的丛菔提取物。
本发明的丛菔提取的物制备方法,所采用的非极性大孔吸附树脂为D101大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂;所采用的极性大孔吸附树脂为X-5大孔吸附树脂、LSA-40大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂。
本发明的丛菔提取物在制备治疗肺结核药物中的应用,可用于制备治疗肺结核药物。
本发明的丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C在制备治疗肺结核药物中的应用。
本发明的丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C与化学药或中药或天然药物组成治疗肺结核药物。
本发明的丛菔提取物与化学药或中药或天然药物组成治疗肺结核药物。
本发明的丛菔提取物,通过加入药剂学允许的各种辅料,制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
本发明首次对丛菔采用两次大孔吸附树脂纯化技术进行提取物制备研究,分离得到了具有治疗肺结核活性的提取物,包括丛菔提取物A、丛菔提取物B和丛菔提取物C。制备工艺操作简便,生产成本低,适于工业化大生产。
本发明提供的丛菔提取物,通过体内抗结核作用研究表明,对牛型结核菌、耐INH菌、耐RFP菌、耐SM菌及耐INH+RFP+SM的结核菌均有一定的抑制或杀灭作用。体外抗结核作用研究表明,具有显著的抗结核作用。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对丛菔提取物在制备治疗肺结核药物中的应用做进一步说明但不限于本发明。
实施例1:丛菔提取物的制备
(1)丛菔30kg,用浓度95%乙醇作为溶剂,加热回流提取,提取次数为3次,每次提取时间为2小时,每次溶剂用量为丛菔重量的12倍,滤过,得药渣A和提取液,提取液回收乙醇,浓缩,干燥,得丛菔提取物A;
(2)将步骤(1)得到药渣A用水为溶剂,加热回流提取,提取次数为2次,每次提取时间为2小时,每次溶剂用量为丛菔重量的12倍,滤过,提取液浓缩至相对密度d=1.11,滤过,得药液B;
(3)将步骤(2)得到的药液B,通过D101非极性大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,水洗脱液直接通过HPD600极性大孔树脂柱,再用浓度60%的乙醇溶液洗脱D101非极性大孔吸附树脂柱,收集60%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物B;再用浓度60%的乙醇溶液洗脱HPD600极性大孔吸附树脂柱,收集60%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物C;
(4)将上述丛菔提取物A、丛菔提取物B和丛菔提取物C混匀,即得本发明的丛菔提取物。
实施例2:丛菔提取物的制备
(1)丛菔23kg,用浓度80%乙醇作为溶剂,加热回流提取,提取次数为1次,每次提取时间为4小时,每次溶剂用量为丛菔重量的15倍,滤过,得药渣A和提取液,提取液回收乙醇,浓缩,干燥,得丛菔提取物A;
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度10%乙醇为溶剂,加热回流提取,提取次数为3次,每次提取时间为1小时,每次溶剂用量为丛菔重量的8倍,滤过,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度d=1.12,滤过,得药液B;
(3)将步骤(2)得到的药液B,通过AB-8非极性大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,水洗脱液直接通过LSA-40极性大孔树脂柱,再用浓度50%的乙醇溶液洗脱AB-8非极性大孔吸附树脂柱,收集50%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物B;再用浓度70%的乙醇溶液洗脱LSA-40极性大孔吸附树脂柱,收集70%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物C;
(4)将上述丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C混匀,即得本发明的丛菔提取物。
实施例3:丛菔提取物的制备
(1)丛菔24kg,用100%乙醇作为溶剂,加热回流提取,提取次数为3次,每次提取时间为1小时,每次溶剂用量为丛菔重量的8倍,滤过,得药渣A和提取液,提取液回收乙醇,浓缩,干燥,得丛菔提取物A;
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度20%乙醇为溶剂,加热回流提取,提取次数为1次,每次提取时间为4小时,每次溶剂用量为丛菔重量的15倍,滤过,提取液回收乙醇,浓缩至相对密度d=1.10,滤过,得药液B;
(3)将步骤(2)得到的药液B,通过D101非极性大孔吸附树脂柱,先用水洗脱,水洗脱液直接通过X-5极性大孔树脂柱,再用浓度70%的乙醇溶液洗脱D101非极性大孔吸附树脂柱,收集70%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物B;再用浓度50%的乙醇溶液洗脱X-5极性大孔吸附树脂柱,收集50%浓度乙醇洗脱液,浓缩干燥,即得丛菔提取物C;
(4)将上述丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C混匀,即得本发明的丛菔提取物。
实施例4:丛菔提取物片的制备
取实施例1丛菔提取物165g,加入淀粉75g,混匀,制粒,干燥,加微晶纤维素20g,硬脂酸镁2.5g,混匀,压制成1000片, 即得丛菔提取物片。
实施例5:丛菔提取物颗粒的制备
取实施例2丛菔提取物175g,加入糊精80g,糖30g,混匀,制粒,干燥,整粒,即得丛菔提取物颗粒。
实施例6:丛菔提取物胶囊的制备
取实施例3丛菔提取物165g,加入淀粉65g,混匀,制粒,干燥,整粒,加入适量硬脂酸镁,混匀,装胶囊1000粒,即得丛菔提取物胶囊。
实验例1:丛菔提取物体内外抗结核作用。
1.材料和方法
试验药品:按本发明实施例1方法制备的丛菔提取物、丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C,批号分别为:20111012、20111013、20111014、20111015。临用前用蒸馏水配成所需浓度的混悬液备用,本实验剂量按g原生药/kg计算。利福平(RPP)胶囊:0.15 g×100粒,成都锦华药业有限公司出品,批号为110912,有效期至2013-08,临用前用0.5%CMC配成所需浓度的混悬液备用。
试验菌株H37RV标准菌(ATCC27294):牛型分支杆菌;单耐RFP菌;单耐INH菌;单耐SM菌;耐INH+SM+RFP菌;均由中国疾病预防控制中心结核病预防控制分中心提供。
豚鼠:一级动物;雌雄各半,体重:300~320 g。生产许可证号:15号,由山东省实验动物研究所提供。
2.方法与结果。
2.1 对细菌生长的影响
2.1.1 体外对结核菌生长的影响最小抑菌浓度(MIC)的测定:采用试管法,将药物分别加入苏通培养基内后,加入定时的菌液(1mg/ml,每支接种0.1 m1),经37℃培养2周后,每支吸0.1 ml转种于2支改良罗氏(L-J)培养基斜面同时设空白对照管。在含药苏通培养基内培养2周见细菌生长的最小浓度为最小抑菌浓度。最小杀菌浓度(MBC)的测定:将在苏通培养基内未见细菌生长的培养物,分别吸取0.05 ml接种于改良罗氏(L-J)斜面,经37℃培养4周后,所接种的2支培养基斜面上的菌落数之和少于5个的最小稀释度的药物浓度为该药的最小杀菌浓度。
表1 体外对结核菌生长的影响
从表1可见,丛菔提取物对牛型结核菌、耐INH菌、耐RFP菌、耐SM菌及耐INH+RFP+SM的结核菌均有一定的抑制或杀灭作用。
2.1.2 体内对结核感染豚鼠的作用:豚鼠经PPD测试阴性后,随机分组,分别灌胃丛菔提取物、丛菔提取物A、丛菔提取物B、丛菔提取物C,均为20g/kg;利福平50mg/kg及等量蒸馏水,1次/d,连续45D。在给药后2周,除对照组外,在各豚鼠蹊部皮下注射菌悬液0.5mL/只(将1mg/ml的菌悬液稀释100倍)使动物感染结核杆菌。在末次给药后24 h处死动物,解剖肉眼计数每个脏器的结核结节,取肺脏、肝脏及脾脏称湿重并计算其脏器指数,然后称取一定量的组织做匀浆以便做结核菌培养,同时将各组织置于10%福尔马林中固定并做切片以便做HE染色和z-N染色彩。结果见表2、3、4。
表2 对结核豚鼠脏器指数的影响
注:与模型组比较:*P<0.05,**P<0.0l。
从表2可见,豚鼠在感染结核菌后,其肝脏指数、脾脏指数及肺脏指数均显著增加,丛菔提取物可降低结核豚鼠肝脏指数,与模型组比较有统计学差异;丛菔提取物有减少结核豚鼠肝脏指数及肺脏指数的趋势,与模型组比较有统计学差异;丛菔提取物可显著减少结核豚鼠脾脏指数,与模型组比较有统计学差异。
表3 对结核豚鼠体重及肺结核结节数量的影响
注:与模型组比较:*P<0.05,**P<0.0l。
从表3可见,豚鼠在感染结核菌后,其体重显著减少,同时肺部形成大量肉眼可见的结核结节;丛菔提取物对结核豚鼠体重均无明显影响,与模型组比较无统计学差异,但丛菔提取物可减少豚鼠肺部肉眼可见的结核结节,与模型组比较有统计学差异。
表4 对结核豚鼠脾脏、肺脏组织培养结核菌数量的影响
注:与模型组比较:*P<0.05,**P<0.0l。
从表4可见,结核菌感染的豚鼠肺脏和脾脏均有大量的结核菌;而丛菔提取物可显著减少结核豚鼠肺脏及脾脏的结核菌数量,与模型组比较有统计学差异。