CN103543240B - 发酵液中黄腐酸含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明发酵液中黄腐酸含量的测定方法，该方法包括：1）发酵液中糖的测定；2）发酵液中总黄腐酸的测定；3）发酵液中纯黄腐酸含量的计算：①根据葡萄糖为与黄腐酸对应的线性关系，计算葡萄糖相当于黄腐酸的量；②以葡萄糖质量为横坐标X，对应黄腐酸质量为纵坐标Y作图得到工作曲线和线性回归方程为Y=aX+b,其中a为斜率，b为截距，将样品中的含糖量折合成黄腐酸的量，再用总黄腐酸量减去糖折合成黄腐酸的量比发酵液样品的总量，即为发酵液中纯黄腐酸的百分含量。采用本发明方法能准确测定发酵液中的黄腐酸的含量。

Description

发酵液中黄腐酸含量的测定方法

技术领域：

本发明与黄腐酸含量的测定方法有关，特别与发酵液中黄腐酸含量的测定方法有关。

背景技术：

发酵液是将秸秆、蔗渣酒类发酵酒精等有机资材（植物残渣）经过深层液体生物发酵技术而产生的，除含有高浓度的腐熟型有机质、腐植酸、氨基酸、高吸收率N、P、K外，更含有在发酵过程中产生的未知生长因子(UGF)，对植物可起到类似添加复硝酚钠、萘乙酸等人工合成激素的刺激作用，可广泛作为叶面肥、液体冲施肥、固体有机颗粒肥的辅助原料或直接稀释作为成品叶面肥、冲施肥使用。其功效表现为：1、改善贫瘠土壤、提高化学肥料的利用率。2、含有丰富的氨基酸、钾及其它植物营养成分能快速被植物吸收利用。3、增加土壤有机质的含量，疏松土壤，改善土壤中微生物的生育环境。

以焦磷酸钠提取液提取发酵液，可将除腐植酸和糖以外的其它物质除去，其中的腐植酸分为黄腐酸、棕腐酸、黑腐酸。黄腐酸是腐植酸中的低分子酸，其特点是分子量较小，生物活性大，酸性基因多，渗透性强，易被植物吸收。而棕黑腐酸是高分子有机酸，较难被植物吸收利用，特别是作为叶面肥或液体肥，在Cu、Fe、Zn、Mn等二价离子的作用下，很易絮凝沉淀，因此，在生产过程中一般会出现絮凝，难以成为真溶液，即使使用螯合剂，在硬水中也易被沉淀。喷施在作物叶面也很难被作物吸收利用。可见目前在“含腐植酸水溶肥料”中，采取酸沉淀氧化还原滴定法排斥低分子黄腐酸类物质的检测方法，是不妥当的。若以总腐植酸和棕黑腐植酸之间的差值，或将酸沉淀棕黑腐植酸后滤液中的有机物作为黄腐酸含量也是不妥当的。因为这两种方法都是将原料中溶于提取液和酸的部分全部当成了黄腐酸。这部分不属于黄腐酸的物质则以糖为主。因此建立一种测定发酵液中真正的黄腐酸的检测方法是非常必要的。

发明内容：

本发明的目的是为了克服以上不足，提供一种能准确测定发酵液中的黄腐酸含量的测定方法。

本发明的目的是这样来实现的：

本发明发酵液中黄腐酸含量的测定方法包括以下步骤：

1）、发酵液中糖的测定：

将发酵液样品的水溶性糖经热稀酸彻底水解后转化成还原糖，再用费林试剂A、B与还原糖共沸、生成氧化亚铜沉淀，以次甲基蓝为指示剂，用发酵液样品滴定沸腾状态的溶液、达到终点时、稍微过量的还原糖将次甲基蓝还原成无色为终点，依据葡萄糖标准滴定液的消耗量求得还原糖的含量，发酵液样品中还原糖含量X以葡萄糖计按下式计算：

$X=\frac{C_1(V_1-V_2)\×D_1}{m_1}\×100\%$

式中：C₁——葡萄糖标准溶液浓度，g/ml；

V₁——空白滴定时耗用葡萄糖标准液体积，ml；

V₂——样品滴定时耗用葡萄糖标准液体积，ml；

D₁——样品稀释倍数；

m₁——样品称取量，g；

计算结果保持二位小数，

费林试剂A、B二液等体积混合时生成的天蓝色Cu(OH)₂沉淀后，立即与酒石酸钾钠起反应生成深蓝色的酒石酸钾钠铜络合物。此络合物与还原糖共热时，二价铜即被还原糖还原为一价的红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜沉淀与亚铁氰化钾反应，生成可溶性化合物避免干扰滴定。达到终点时，稍微过量的葡萄糖标准滴定液将蓝色的次甲基蓝还原成无色，溶液呈酒红色而指示滴定终点，根据葡萄糖标准滴定液标定碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖的质量，以及测定样品所消耗葡萄糖标准滴定液的体积。

反应方程式如下：

滴定时是以亚甲基蓝为氧化还原指示剂，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝，即达滴定终点。

2）、发酵液中总黄腐酸的测定：用焦磷酸钠溶液提取样品中的腐植酸(包含糖)，再用酸沉淀除去棕腐酸和黑腐酸，用定量的重铬酸钾和硫酸溶液氧化试样中的有机碳，剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁标准滴定溶液滴定，以试剂空白为基准，根据试样氧化前后氧化剂消耗体积之差，计算出有机碳含量，经过碳系数的换算得到总黄腐酸含量。

C+K₂Cr₂O₇+H₂SO₄→Cr₂(SO₄)₃+K₂SO₄+CO₂↑+H₂O

K₂Cr₂O₇(过剩)+Fe²⁺+4SO₄ ^2-→Cr₂(SO₄)₃+K₂SO₄+Fe³⁺

样品中总黄腐酸含量W按下式计算：

$W=\frac{C(V_3-V_4)\×0.003\×1.3\×D_2}{m_2\×K}\×100$

式中：C——硫酸亚铁标准滴定溶液浓度，mol/L；

V₃——空白实验时，消耗硫酸亚铁标准滴定溶液体积，ml；

V₄——测定试样时，消耗硫酸亚铁标准滴定溶液体积，ml；

1.3——氧化校正系数；

0.003——与1.00ml硫酸亚铁标准滴定溶液[C(FeSO4)=1.000mol/L]相当的以克表示的碳的质量；

D₂——测定时试样溶液的稀释倍数；

m₂——试样的质量，g；

K——不同煤种黄腐酸碳系数（风化煤0.64、褐煤0.58、泥炭0.51、河南巩义风化煤0.55、广东湛江泥炭0.46、吐鲁番风化煤0.51）。

计算结果保留二位小数；

3）发酵液中纯黄腐酸含量的计算：

①根据葡萄糖与黄腐酸对应的线性关系，计算葡萄糖相当于黄腐酸的量m：

$m=\frac{C(V_0-V_7)\×0.003\×1.3}{K}$

式中：m——黄腐酸质量（g）；

C——FeSO₄标准滴定溶液浓度，mol/L；

V₀——空白耗用FeSO₄标准滴定溶液体积，ml；

V₇——样品耗用FeSO₄标准滴定溶液体积，ml；

1.3——氧化校正系数

0.003——与1.00ml FeSO₄标准滴定溶液相当的以克表示的碳的质量；

K——不同煤种黄腐酸碳系数（风化煤0.64、褐煤0.58、泥炭0.51、河南巩义风化煤0.55、广东湛江泥炭0.46、吐鲁番风化煤0.51）；

计算结果保留二位小数；

②以葡萄糖质量（g）为横坐标X，对应黄腐酸质量（g）为纵坐标Y，作图得到工作曲线和线性回归方程为Y=aX+b,其中a为斜率，b为截距，将样品中的含糖量折合成黄腐酸的量，再用总黄腐酸量减去糖折合成黄腐酸的量比发酵液样品的总量，即为发酵液中纯黄腐酸的百分含量。

本发明测定方法能准确测定发酵液中黄腐酸的含量。

附图说明：

图1为葡萄糖与黄腐酸的线性关系图。

具体实施方式：

实施例1：

本实施例1糖蜜发酵液中黄腐酸的测定包括以下步骤：

1、准备试剂：

1.1焦磷酸钠提取液：称取15g焦磷酸钠和7g氢氧化钠，溶解到1L蒸馏水中；

1.2硫酸溶液： $C\left(\frac{1}{2}{H}_2{\mathrm{SO}}_4\right)=2\mathrm{mol}/L;$

1.3邻菲啰啉-亚铁指示剂：称取邻菲啰啉1.490g溶于含有0.700g硫酸亚铁的100ml水溶液中，密闭保存于棕色瓶中；

1.4重铬酸钾溶液：称取重铬酸钾49.031g，溶于500ml水中（必要时可加热溶解），冷却，定容至1L，摇匀；

1.5重铬酸钾标准溶液：称取经120℃烘至恒重的重铬酸钾基准试剂5.1776g，用水溶解，定容至1L，摇匀；

1.6硫酸亚铁标准滴定溶液：称取硫酸亚铁56g溶于600ml～800ml蒸馏水中，加入20ml浓硫酸，定容至1L,贮于棕色瓶中保存。硫酸亚铁溶液在空气中易被氧化，使用时应标定准确浓度；

硫酸亚铁标准滴定溶液的标定：吸取20.0ml重铬酸钾标准溶液（1.5），置于250ml三角瓶中，加入3ml浓硫酸和邻菲啰啉-亚铁指标剂（1.3）3滴～5滴，用硫酸亚铁溶液（1.6）滴定，根据基消耗体积，计算硫酸亚铁标准滴定溶液浓度c。具体按下式计算：

$c=\frac{c_2{V}_5}{V_6}$

c——硫酸亚铁标准滴定溶液的浓度，mol/L；

c₂——重铬酸钾标准溶液的浓度，mol/L；

V₅——吸取重铬酸钾标准溶液的体积，mL；

V₆——滴定时消耗的硫酸亚铁标准溶液的体积，mL；

1.7葡萄糖标准溶液，0.001g/mL：称取经103～105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.5038g，加水溶解后，定容至500ml；

1.8次甲基蓝指示液，10g/L：称取次甲基蓝1.0g，水溶解后稀释至100ml；

1.9费林试剂A液：称取硫酸铜（CuSO₄.5H₂O）15g，加水溶解并定容至1000ml摇匀，静置24h后过滤备用；

1.10费林试剂B液：称取酒石酸钾钠（C₄H₄O₆KNa.4H₂O）50g、NaOH54g、亚铁氰化钾（K₄Fe(CN)₆.3H₂O）4g，加水溶解并定容至1000ml摇匀，过滤备用。

2、样品溶液制备：

2.1称取糖蜜发酵液样品0.7559g，加约30ml焦磷酸钠提取液，于沸水浴中提取2h，取出冷却，转入50ml容量瓶，用焦磷酸钠提取液定容、过滤。吸滤液25.0ml于50ml烧杯，再吸入溶液25.0ml搅匀、离心。上清液吸三份5.0ml。一份吸入250ml锥瓶，用于总黄腐酸的测定；

2.2另两份分别吸入两个150ml烧杯用于含糖的测定。向溶液中各加入2mlHCl（1+1），于电炉上煮沸2～3min，取下，冷却。用C（NaOH）=100g/L溶液在PH计上分别调至碱性（＞9），一份用于测糖的预滴定，另一份用于测糖的正式滴定。

3、样品总黄腐酸的测定：

3.1硫酸亚铁标准滴定溶液的标定：

吸取20.0ml重铬酸钾标准溶液（1.5），置于250ml三角瓶中，加入3ml浓硫酸和邻菲啰啉-亚铁指示剂（1.3）3滴～5滴，用硫酸亚铁溶液（1.6）滴定，消耗体积V₆=11.50ml；

硫酸亚铁标准滴定溶液浓度 $c=\frac{0.1056\×20.0}{11.50}=0.1837\mathrm{mol}/L;$

3.2总黄腐酸的测定：

上述吸入250ml锥瓶的溶液（2.1）中准确加入重铬酸钾溶液（1.4）5.0ml，10ml浓H₂SO₄，沸水浴中氧化30min，冷却。加水70ml，邻菲啰啉-亚铁指示剂3～5滴，用新标定C(FeSO₄)=0.1837mol/L标准滴定液滴至样液由橙黄经蓝绿变暗棕红为终点，同时在相同条件下测空白，消耗体积为V₃=29.06ml，V₄=20.41ml，黄腐酸碳系数以0.58计：

则总黄腐酸 $W=\frac{0.1837\×(29.06-20.41)\×0.003\×1.3}{0.7559\×0.58\×(25\÷50)\×(5\÷50)}\×100=28.27\%.$

4、样品含糖的测定

4.1空白糖液测定：

预滴定：准吸费林试剂A、B液各5.0ml于250ml锥瓶，加小玻珠2粒、水50ml，2min加热至沸腾，保持沸腾状态先快后慢滴加葡萄糖标准液，待溶液蓝色即将消失时加入1～2滴次甲基蓝指示液，继续用葡萄糖标准溶液滴至蓝色消失呈现酒红色，记下耗用葡萄糖标液总体积V_a；

正式滴定：准吸费林试剂A、B液各5.0ml于250ml锥瓶，加小玻珠2粒，加入比预滴定体积V_a少1ml的葡萄糖标准滴定液（1.6），再加水50ml摇匀。电炉上2min内加热至沸并保持2min，加入1～2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下用葡萄糖标准滴定液在1min内滴至蓝色消失呈现酒红色，记录消耗葡萄糖标液体积V₁=14.25ml；

4.2试样中糖的测定：

试样预滴定：将（2.2）中处理后的其中一份溶液转入250ml锥瓶，准吸费林试剂A、B液各5.0ml，加小玻珠2粒、水50ml摇匀。电炉上2min加热至沸腾，保持沸腾状态下用葡萄糖标准溶液先快后慢进行滴定，待溶液蓝色即将消失时,加入1～2滴次甲基蓝指示液，继续用葡萄糖标准溶液滴至蓝色消失呈酒红为终点，记下耗用葡萄糖标准溶液体积V_b；

试样正式滴定：将（2.2）中处理后的另一份溶液转入250ml锥瓶，准吸费林试剂A、B液各5.0ml，加小玻珠2粒，水50ml，加入比预滴定体积V_b少1ml的葡萄糖标准滴定液（1.6），电炉上2min内加热至沸腾，保持沸腾2min，加入1～2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下用葡萄糖标准溶液在1min内滴至蓝色消失呈酒红色为终点，记下耗用葡萄糖标准液体积V₂=7.64ml；

糖含量（以葡萄糖计） $X=\frac{0.001\×(14.25-7.64)}{0.7559\×(25\÷50)\×(5\÷50)}\×100=17.62\%.$

5以葡萄糖为标准做与黄腐酸对应的线性关系：

5.1葡萄糖标液的配制：称取于105±2℃干燥至恒重的葡萄糖，用水定容、摇匀，配制成浓度为0.01g/ml的溶液。分别吸取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml于10个250ml锥瓶中，葡萄糖质量分别为0.005g、0.010g、0.015g、0.020g、0.025g、0.030g、0.035g、0.040g、0.045g、0.050g；

5.2将葡萄糖按黄腐酸的方法测定：于各锥瓶中分别加入C（K₂Cr₂O₇）=1mol/L溶液10.0ml和20ml浓H₂SO₄于沸水浴中氧化30min后冷却，再加水100ml，邻菲啰啉-亚铁指示液3-5滴，用新标定C（FeSO₄）=0.1837mol/L滴至样品由橙黄经蓝绿变为暗棕红为终点，分别记下消耗的体积V₇。同时在相同条件下测空白。记下空白耗用标液体积V₀。黄腐酸碳系数以0.58计：

葡萄糖相当于黄腐酸量的计算：

式中：m——黄腐酸质量（g）；

C——FeSO₄标准滴定溶液浓度，mol/L；

V₀——空白耗用FeSO₄标准滴定溶液体积，ml；

V₇——样品耗用FeSO₄标准滴定溶液体积，ml；

1.3——氧化校正系数；

0.003——与1.00ml FeSO₄标准滴定溶液相当的以克表示的碳的质量；

0.58——黄腐酸碳系数；

5.3工作曲线的绘制：以葡萄糖质量（g）为横坐标X，对应黄腐酸质量（g）为纵坐标Y作图，得线性回归方程为Y=0.8336X+0.0003，相关系数r=0.99993（见图1），空白V₀=58.12ml。

测定数据及计算结果见表1。

表1

6、糖蜜液中纯黄腐酸含量的计算：

6.1用于测定的试样中含糖量： $0.7559\×\frac{25}{50}\×\frac{5}{50}\×17.62\%=0.00666g;$

6.2代入回归方程计算对应的黄腐酸：Y=0.8336×0.00666+0.0003=0.00585g；

6.3样品中的总黄腐酸： $W=\frac{(29.06-20.41)\×0.1837\×0.003\×1.3}{0.58}=0.01068g;$

6.4样品中扣除糖后含纯黄腐酸：W'=0.01068-0.00585=0.00483g；

6.5

六、样品中含糖量回收率试验：

以上述举例的样品为基准，加入标准葡萄糖，测回收率。

称上述糖蜜发酵液样品1.0001g于50ml烧杯，另称烘干后的AR葡萄糖0.1431g于50ml烧杯，均用水溶解后转入同一100ml容量瓶中混匀、定容。分别吸取不同的体积按上述测糖方法进行操作、计算，结果见下表2。

表2：样品中含糖量回收率

体积（ml）	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0
						理论糖（mg）	6.386	7.983	9.579	11.176	12.772
测得糖（mg）	6.479	7.982	9.650	11.180	12.929
						回收率（%）	101.46	99.99	100.74	100.04	101.23

七、样品中含总黄腐酸量回收率试验：

以上述举例的样品为基准，加入已知的黄腐酸量，测回收率。

称上述糖蜜发酵液样品1.0007g于50ml烧杯，另称美国95%黄腐酸标品0.1504g于50ml烧杯，均用水溶解后转入同一100ml容量瓶中混匀、定容。分别吸取不同的体积按上述测总黄腐酸的方法进行操作、计算，结果见下表3：

表3：样品中总黄腐酸量回收率

体积（ml）	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0
						理论总黄腐酸（mg）	0.8518	1.0647	1.2776	1.4906	1.7035
测得总黄腐酸（mg）	0.8619	1.0747	1.2576	1.4706	1.7236
						回收率（%）	101.19	100.94	98.43	98.66	101.18

实施例2：

本实施例2秸秆发酵液中黄腐酸的测定包括以下步骤：

1、准备试剂：同实施例1；

2、样品溶液制备：

2.1称取秸秆发酵液样品5.8403g，加约30ml焦磷酸钠提取液，于沸水浴中提取2h，取出冷却，转入50ml容量瓶，用焦磷酸钠提取液定容、过滤。吸滤液25.0ml于50ml烧杯，再吸入溶液25.0ml搅匀、离心。上清液吸三份5.0ml。一份吸入250ml锥瓶，用于总黄腐酸的测定；

2.2另两份分别吸入两个150ml烧杯用于含糖的测定。向溶液中各加入2mlHCl（1+1），于电炉上煮沸2～3min，取下，冷却。用C（NaOH）=100g/L溶液在PH计上分别调至碱性（＞9），一份用于测糖的预滴定，另一份用于测糖的正式滴定；

3、样品总黄腐酸的测定：

3.1硫酸亚铁标准滴定溶液的标定：同实施例1

3.2总黄腐酸的测定：

上述吸入250ml锥瓶的溶液（2.1）中准确加入重铬酸钾溶液（1.4）5.0ml，10ml浓H₂SO₄，沸水浴中氧化30min，冷却。加水70ml，邻菲啰啉-亚铁指示剂3～5滴，用新标定C(FeSO₄)=0.1837mol/L标准滴定液滴至样液由橙黄经蓝绿变暗棕红为终点，同时在相同条件下测空白。消耗体积为V₃=29.06ml，V₄=25.11ml。黄腐酸碳系数以0.58计：

则总黄腐酸 $W=\frac{0.1837\×(29.06-25.11)\×0.003\×1.3}{5.8403\×0.58\×(25\÷50)\×(5\÷50)}\×100=1.67\%.$

4、样品含糖的测定：

4.1空白糖液测定：同实施例1；

4.2试样中糖的测定：

试样预滴定：将（2.2）中处理后的其中一份溶液转入250ml锥瓶，准吸费林试剂A、B液各5.0ml，加小玻珠2粒、水50ml摇匀。电炉上2min加热至沸腾，保持沸腾状态下用葡萄糖标准溶液先快后慢进行滴定，待溶液蓝色即将消失时,加入1～2滴次甲基蓝指示液，继续用葡萄糖标准溶液滴至蓝色消失呈酒红为终点，记下耗用葡萄糖标准溶液体积V_b；

试样正式滴定：将（2.2）中处理后的另一份溶液转入250ml锥瓶，准吸费林试剂A、B液各5.0ml，加小玻珠2粒，水50ml，加入比预滴定体积V_b少1ml的葡萄糖标准滴定液（1.6），电炉上2min内加热至沸腾，保持沸腾2min，加入1～2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下用葡萄糖标准溶液在1min内滴至蓝色消失呈酒红色为终点，记下耗用葡萄糖标准液体积V₂=14.22ml：

糖含量（以葡萄糖计） $X=\frac{0.001\×(14.25-14.22)}{5.8403\×(25\÷50)\×(5\÷50)}\×100=0.01035\%.$

5以葡萄糖为标准做与黄腐酸对应的线性关系：同实施例1。

6、秸秆发酵液中纯黄腐酸含量的计算：

6.1用于测定的试样中含糖量： $5.8403\×\frac{25}{50}\×\frac{5}{50}\×0.01035\%=0.00003g;$

6.2代入回归方程计算对应的黄腐酸：

Y=0.8336×0.00003+0.0003=0.000325g；

6.3样品中的总黄腐酸： $W=\frac{(29.06-25.11)\×0.1837\×0.003\×1.3}{0.58}=0.00488g;$

6.4样品中扣除糖后含纯黄腐酸：W'=0.00488-0.000325=0.004555g；

6.5

实施例3：

本实施例3酿酒发酵液中黄腐酸的测定包括以下步骤：

1、准备试剂：同实施例1。

2、样品溶液制备：

2.1称取酿酒发酵液样品1.5383g，加约30ml焦磷酸钠提取液，于沸水浴中提取2h，取出冷却，转入50ml容量瓶，用焦磷酸钠提取液定容、过滤。吸滤液25.0ml于50ml烧杯，再吸入溶液25.0ml搅匀、离心。上清液吸三份5.0ml。一份吸入250ml锥瓶，用于总黄腐酸的测定；

2.2另两份分别吸入两个150ml烧杯用于含糖的测定。向溶液中各加入2mlHCl（1+1），于电炉上煮沸2～3min，取下，冷却。用C（NaOH）=100g/L溶液在PH计上分别调至碱性（＞9），一份用于测糖的预滴定，另一份用于测糖的正式滴定；

3、样品总黄腐酸的测定：

3.1硫酸亚铁标准滴定溶液的标定：同实施例1；

3.2总黄腐酸的测定：

上述吸入250ml锥瓶的溶液（2.1）中准确加入重铬酸钾溶液（1.4）5.0ml，10ml浓H₂SO₄，沸水浴中氧化30min，冷却。加水70ml，邻菲啰啉-亚铁指示剂3～5滴，用新标定C(FeSO₄)=0.1837mol/L标准滴定液滴至样液由橙黄经蓝绿变暗棕红为终点，同时在相同条件下测空白。消耗体积为V₃=29.06ml，V₄=18.25ml。黄腐酸碳系数以0.58计；

则总黄腐酸 $W=\frac{0.1837\×(29.06-18.25)\×0.003\×1.3}{1.5383\×0.58\×(25\÷50)\×(5\÷50)}\×100=17.36\%.$

4、样品含糖的测定

4.1空白糖液测定：同实施例1；

4.2试样中糖的测定：

试样预滴定：将（2.2）中处理后的其中一份溶液转入250ml锥瓶，准吸费林试剂A、B液各5.0ml，加小玻珠2粒、水50ml摇匀。电炉上2min加热至沸腾，保持沸腾状态下用葡萄糖标准溶液先快后慢进行滴定，待溶液蓝色即将消失时,加入1～2滴次甲基蓝指示液，继续用葡萄糖标准溶液滴至蓝色消失呈酒红为终点，记下耗用葡萄糖标准溶液体积V_b；

试样正式滴定：将（2.2）中处理后的另一份溶液转入250ml锥瓶，准吸费林试剂A、B液各5.0ml，加小玻珠2粒，水50ml，加入比预滴定体积V_b少1ml的葡萄糖标准滴定液（1.6），电炉上2min内加热至沸腾，保持沸腾2min，加入1～2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下用葡萄糖标准溶液在1min内滴至蓝色消失呈酒红色为终点，记下耗用葡萄糖标准液体积V₂=7.92ml；

糖含量（以葡萄糖计） $X=\frac{0.001\×(14.25-7.92)}{1.5383\×(25\÷50)\×(5\÷50)}\×100=8.29\%.$

5以葡萄糖为标准做与黄腐酸对应的线性关系：同实施例1。

6、酿酒发酵液中纯黄腐酸含量的计算：

6.1用于测定的试样中含糖量： $1.5383\×\frac{25}{50}\×\frac{5}{50}\×8.29\%=0.00638g;$

6.2代入回归方程计算对应的黄腐酸：Y=0.8336×0.00638+0.0003=0.00562g；

6.3样品中的总黄腐酸： $W=\frac{(29.06-18.25)\×0.1837\×0.003\×1.3}{0.58}=0.01335g;$

6.4样品中扣除糖后含纯黄腐酸：W'=0.01335-0.00562=0.00773g；

6.5

上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims (1)

1.发酵液中黄腐酸含量的测定方法，该方法包括以下步骤：

1)发酵液中糖的测定：将发酵液样品的水溶性糖经热稀酸彻底水解后转化成还原糖，再用费林试剂A、B与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀，以次甲基蓝为指示剂，用葡萄糖标准液滴定沸腾状态的溶液，达到终点时，稍微过量的葡萄糖标准滴定液将蓝色的次甲基蓝还原成无色，溶液呈酒红色而指示滴定终点，依据葡萄糖标准滴定液的消耗量求得还原糖的含量；发酵液样品中还原糖含量X以葡萄糖计，按下式计算：

$X=\frac{C_1(V_1-V_2)\×D_1}{m_1}\×100\%$

式中：C₁——葡萄糖标准溶液浓度，单位为g/ml；

V₁——空白滴定时耗用葡萄糖标准液体积，单位为ml；

V₂——样品滴定时耗用葡萄糖标准液体积，单位为ml；

D₁——样品稀释倍数；

m₁——样品称取量，单位为g；

上述的费林试剂A液是硫酸铜溶液；

上述的费林试剂B液是酒石酸钾纳、氢氧化钠、亚铁氰化钾配制的水溶液；

2)发酵液中总黄腐酸的测定：先用焦磷酸钠提取液提取发酵液样品中的包括糖的腐植酸，再用酸沉淀除去棕腐酸和黑腐酸，用定量的重铬酸钾和硫酸溶液氧化试样中的有机碳，剩余的重铬酸钾用硫酸亚铁标准滴定溶液滴定，以试剂空白为基准，根据试样氧化前后氧化剂消耗体积之差，计算出有机碳含量，经过碳系数的换算得到总黄腐酸含量，样品中总黄腐酸含量W按下式计算：

$W=\frac{C(V_3-V_4)\×0.003\×1.3\×D_2}{m_2\×K}\×100$

式中：C——硫酸亚铁标准滴定溶液浓度，单位为mol/L；

V₃——空白实验时，消耗硫酸亚铁标准滴定溶液体积，单位为ml；

V₄——测定试样时，消耗硫酸亚铁标准滴定溶液体积，单位为ml；

1.3——氧化校正系数；

0.003——与1.00ml浓度为1.000mol/L硫酸亚铁标准滴定溶液相当的以克表示的碳的质量；

D₂——测定时试样溶液的稀释倍数；

m₂——试样的质量，单位为g；

K——不同煤种黄腐酸碳系数，其中风化煤0.64、褐煤0.58、泥炭0.51；

3)发酵液中纯黄腐酸含量的计算：

①将葡萄糖按黄腐酸的测定方法测定，计算葡萄糖相当于黄腐酸的量m：

$m=\frac{C(V_0-V_7)\×0.003\×1.3}{K}$

式中：m——黄腐酸质量，单位为g；

C——FeSO₄标准滴定溶液浓度，单位为mol/L；

V₀——空白耗用FeSO₄标准滴定溶液体积，单位为ml；

V₇——样品耗用FeSO₄标准滴定溶液体积，单位为ml；

1.3——氧化校正系数；

0.003——与1.00ml浓度为1.000mol/L硫酸亚铁标准滴定溶液相当的以克表示的碳的质量；

K——不同煤种黄腐酸碳系数，其中风化煤0.64、褐煤0.58、泥炭0.51；

②以葡萄糖质量为横坐标X，对应黄腐酸质量为纵坐标Y，质量单位均为g，作图得到工作曲线和线性回归方程为Y＝aX+b,其中a为斜率，b为截距，将样品中的含糖量折合成黄腐酸的量，再按照以下关系式计算所得结果，即为发酵液中纯黄腐酸的百分含量：