CN1035194C

CN1035194C - 聚乙烯醇微生物或酶固定化载体的制备方法

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Publication number: CN1035194C
Application number: CN92101875A
Authority: CN
Inventors: 陈国诚; 林莹峰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-03-17
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1997-06-18
Anticipated expiration: 2007-03-17
Also published as: CN1076488A

Abstract

将微生物或酶与1-20重量%的PVA(碱化度70%以上，聚合度1000-3000)溶液混合后，置于饱和硼酸溶液中，短时间内使其形成球体，随即将该球体与磷酸盐溶液(＞5重量%)接触，使其充分硬化，而制成微生物或酶固定化载体。并将制得之固定化载体，使用于去除废水中无机氮及有机碳，以及生化产品之生产程序中。

Description

聚乙烯醇微生物或酶固定化载体的制备方法

本发明涉及微生物或酶固定化载体的制备方法，具体地讲，涉及聚乙烯醇微生物或酶固定化载体的改良制备方法。

有效地应用种种天然或合成高分子材料来包覆微生物完整细胞的固定化微生物或酶技术，在八十年代以来，备受注目。而且已有不少实际应用于工业生产的成功例，例如高果糖糖浆，6-APA，L-氨基酸等生化产品的生产。通常使用于固定化载体的代表性高分子材料为聚丙烯酰胺，鹿角藻胶(K-carrageenan)，藻胶钠及琼脂等。聚丙烯酰胺较其他高分子价廉，常被采用。但是，较难制成有利于一般连续反应器的球形颗粒，而且其单体分子及聚合促进剂等皆具毒性，不利于微生物活细胞之固定化操作。鹿角藻胶虽然成形容易、毒性低，但主要缺点是价格较高。藻胶钠虽也价格低廉，容易制成球形，但是，在含有磷酸盐，钠及钾等阳离子的反应液中，胶体强度相当不稳定，甚至崩解。另外，琼脂胶体的机械强度又嫌太弱，不适合长期操作。因此，若欲将固定化菌体技术有效应用于生化商品的工业化制程，尤其是最近备受注目的废水处理领域，其成功与否之关键，乃在于对微生物不具毒性，成本低廉及具有强韧机械强度之载体材料的开发。

聚乙烯醇(PVA)，是由醋酸乙烯单体经聚合，醇化而成的水溶性树脂。PVA不具毒性甚至对人体亦公认无害，制形容易，机械强度高，而且是低价生产的工业化高分子原料。因此，非常适合作为固定化菌体的载体。

近年来，欧美文献及日本的专利公报已公布种种有关利用PVA进行微生物固定化之技术。譬如将PVA水溶液与微生物混合后施以冻结真空干燥或以冷冻回温法进行凝胶固定(日本专利特开昭61-139385)。施以紫外线照射，形成光交联结构的凝胶方法(日本专利特开平1-454372)。另外亦有将PVA水溶液与微生物菌体混合液，置于饱和硼酸水溶液接触形成架桥结构的凝胶技术(日本专利特开昭61-100193)。上述方法虽可获得高强度之胶体作为固定化菌体之载体，但却仍有不少缺点有待改良。在冷冻干燥方法中，须将材料冷冻保持在-30～-80℃的低温下，而后须干燥脱水至一定的含水率，此种冷冻-解冻-脱水的步骤，不仅费时甚久，而且手续繁杂，耗费能源。光交联法则大抵以制成薄膜时所利用之方法，不利于一般的菌体固定化程序之使用。再者，PVA-硼酸法中，微生物-PVA的混合物则须与硼酸接触浸渍12-24小时，方能获得相当强度的胶体，否则胶体脆弱。

总而言之，上述已有技术的共同缺点有，第一，固定化程序费时长久，手续繁杂，需要大型的生产设备方可生产，导致生产成本的提升，降低生产力。第二，低温、真空及硼酸皆不甚适合微生物生存之环境。尤其硼酸更具毒性，长时间的制作程序皆可能引起微生物活性的降低。北野清之曾提出利用PVA与微生物菌体混合物，置于硫酸盐溶液中接触之方法，企图改良上述缺点(日本专利特开昭64-5490，64-5491)。此方法虽然有效地缩短了固定化程序所需时间，然而所使用的凝胶溶液浓度相当高，须以30％硫酸钠或70％硫酸铵溶液进行，如果此浓度过低时颗粒成形不易，强度亦不佳。因此，所需材料成本也较高；而成胶过程中高盐类浓度亦对微生物生化活性甚有不良影响。

本发明所提出硼酸-磷酸盐二阶段成胶之方法，首先置于3％至饱和浓度的硼酸溶液中短时间成形，再于3-20％磷酸盐溶液中强化。成形相当容易，且磷酸盐价格低廉，亦为微生物能源代谢来源，不具生物毒性。此外，盐类使用浓度低，降低成本。而且比硫酸盐法具有更佳的胶体韧性。

本发明之目的在于提出制作程序简单，低成本，且在短时间内即可获得高耐水性、强韧机械强度，且具优异生化活性的PVA凝胶固定化微生物或酶，并将其广泛应用在废水处理领域及生化产业上。

本发明提供一种聚乙烯醇微生物或酶固定化载体之改良制备方法，包含将聚乙烯醇及微生物或酶所形成之混合物于一浓度为3重量％至饱和的硼酸水溶液中进行凝胶化处理而产生一凝胶球体，其改良之处在于该凝胶化处理时间为10分钟至2小时，该凝胶球体接着以3-20重量％磷酸或磷酸盐水溶液浸渍30分钟以上使其硬化而获得聚乙烯醇微生物或酶固定化载体。

本发明方法之原理与特征在于利用PVA分子中羟基与硼酸分子间的离子架桥作用使之成形；而后，再将此不甚强固的凝胶，浸渍于磷酸或磷酸盐溶液中，利用PVA与磷酸或磷盐间的酯化反应使胶体硬化，获得耐水性强，机械强度高且几乎不损害微生物或酶生化活性的固定化菌体。本发明的微生物或酶固定化载体的制作流程可用附图1表示。

本发明所使用的PVA，碱化度70％以上，聚合度为1000-3000，而以碱化度95％以上及聚合度1500-2000者较为适宜。聚合度过低则胶体不稳定，过高则粘度升高不易处理。该PVA系以一水溶液形式与该微生物或酶混合，合适之PVA浓度则在10-20重量％。硼酸成形时间以饱和硼酸水溶液进行约15-30分钟为较佳。

磷酸或磷酸盐水溶液之较佳浓度为5-15重量％，浸渍时间约需1-2小时，即可获得理想成品。该磷酸盐水溶液可使用磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸二氢铵。

本发明方法之另一较佳实施方式为将该硼酸与磷酸或磷酸盐水溶液混合，而同时进行该凝胶化与硬化，时间约为30分钟至3小时，以1-2小时为较佳。

本发明的特征在于首先在硼酸溶液建立胶体基础构架，由于接触时间不长，使硼酸对微生物或酶可能的伤害减至最低(桥本奖所提的硼酸法，须接触15-24小时，日本专利特开昭61-100193)。再者，胶体硬化过程使用具有缓冲作用的磷酸盐溶液，而且磷元素亦为微生物能源代谢之必需元素，所以对微生物而言不但无害且可能具有活化微生物之功能。

根据本发明制备所得的PVA胶体适合使用于酶、工业微生物、废水处理微生物菌群及动植物细胞等的包覆固定化技术。就酶而言，比如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等。就微生物而言，酒精发酵酵母、硝化细菌、脱硝细菌以及活性污泥、厌气消化污泥、甲烷化污泥、脱硝污泥等微生物茵群。以上所述皆为本发明PVA凝胶方法的可行应用对象。

实施例1

15重量％的PVA(碱化度99％以上，聚合度2000)水溶液20g，与脱硝污泥的浓缩液(污泥浓度50g/l)20g充分搅拌混合(脱硝污泥微生物取自实验室生物脱氮程序中的脱硝槽)。将此PVA-污泥混合物滴入缓慢搅拌的饱和硼酸水溶液中，形成直径约3mm的圆球胶体，并置于该溶液中20分钟后，再取出转移至8重量％的磷酸二氢钠溶液中浸渍40分钟，最后将胶体颗粒取出水洗。制成的固定化微生物载体20g，与含有硝酸钾及甲醇为主成份的80ml人工废水(硝酸氮浓度为100ppm，甲醇350ppm)混合，置于125ml的血清瓶中，在无氧条件下进行批式脱硝。经2小时培养后人工废水的硝酸氮浓度降为32ppm。

相同的固定化微生物载体进行重覆批式脱硝试验，每天更新相同成份的人工废水，并测得固定化微生物的脱硝速率，在第七天后达0.65mgN/g凝胶/h，此后，一直到第30天之连续操作皆维持于此一速率，生化活性相当稳定。再者利用桥本奖(日本专利特开昭61-100193)所提方法制备相同污泥含量的固定化菌体，在相同条件下，进行与此实施例同样之实验。批式脱硝经2小时培养后，人工废水的硝酸氮浓度为82ppm，而重覆批式试验须在15天后方达到0.55mg N/g凝胶/h之脱硝速率，往后持续操作亦不甚稳定。实施例2

20重量％的PVA(碱化度99％以上，聚合度2000)水溶液，与硝化污泥的浓缩液(污泥浓度30g/l)，以1∶1重量比例均匀混合(硝化污泥微生物取自实验室生物脱氮程序中的硝化槽)。PVA-污泥混合物进行与实施例(1)同样之微生物固定化程序。

制成之微生物固定化载体(粒径为3mm)置于操作容积为101的生物反应器中，连续入流含200ppm氨氮的人工废水(流入量301/天)，载体充填率为25％，通气量201/分钟。经10天连续操作后，出流水之氨氮浓度为9ppm，并有92％的氨氮被转换成硝酸氮。实施例3

以养猪事业废水(COD浓度1500-2000ppm，总氮浓度200-300ppm)驯化达1个月的活性污泥，经离心而得浓缩污泥溶液，以1∶1重量比例混合18重量％PVA(碱化度99％以上，聚合度2000)的水溶液，此均匀混合液滴入含有5重量％硼酸与10重量％磷酸二氢钾的混合溶液中，浸渍1小时形成3mm粒径的圆球胶体颗粒。制成的固定化微生物载体，置于与实施例(2)同样的生物反应器中，进行养猪事业废水之处理，反应器操作条件与实施例(2)相同。经20天连续操作后，出流水之COD浓度降至200-300ppm，总氮浓度亦降为120-180ppm。实施例4

20重量％的PVA(碱化度99％以上，聚合度2000)水溶液10g，与啤酒酵母(Saccharomyces cerevisia)离心浓缩液(细胞浓度30g/l)10g充分搅拌混合，PVA-酵母菌体混合物进行与实施例(1)同样之微生物固定化程序。制成的固定化细胞载体(粒径为2mm)15g与含有3重量％葡萄糖的培养基150ml混合，置于三角瓶中，于30℃下振荡培养，经8小时后，培养液之酒精产生浓度为10.2g/l。而以相同的菌体量，于同样培养条件下进行游离细胞的培养，经8小时后，培养液中之酒精产生浓度为10.6g/l。实施例5

20重量％的PVA(碱化度99％以上，聚合度2000)水溶液10g，与简单节杆菌(Arthrobacter simplex)浓缩液(细胞浓度20g/l)10g充分搅拌混合，此混合物进行与实施例3同样的微生物固定化程序。制成的固定化微生物载体(粒径约为2mm)15g与含有0.2g/l皮质甾醇的培养基150ml混合，置于容积500ml的三角瓶中振荡培养，进行类固醇的△1-脱氢生化反应，经5小时培养后，有90％的基质被转化生成脱氢皮质甾醇(prednisolone)。实施例6

15重量％PVA(碱化度99％以上，聚合度2000)水溶液10g，与3g的异淀粉酶发酵液及2g的β-淀粉酶发酵液充分混合，并以实施例(1)同样的凝胶程序进行酶固定化。制成的固定化载体(粒径约2mm)15g与含有50g/l液化淀粉的基质溶液150ml混合，置于容积500ml的三角瓶中振荡搅拌，进行淀粉水解反应，于反应3小时后溶液中麦芽糖浓度可达41g/l，基质转换率约为82％。

Claims

1.一种聚乙烯醇微生物或酶固定化载体的改良制备方法，包含将聚乙烯醇及微生物或酶所形成的混合物于一浓度为3重量％至饱和的硼酸水溶液中进行凝胶化处理而产生一凝胶球体，其特征在于该凝胶化处理时间为15至30分钟，该凝胶球体接着以5-15重量％磷酸或磷酸盐水溶液浸渍1-2小时使其硬化而获得聚乙烯醇微生物固定化载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该硼酸水溶液为饱和硼酸水溶液。

3.一种聚乙烯醇微生物或酶固定化载体的改良制备方法，包含将聚乙烯醇及微生物或酶所形成的混合物于一浓度为3重量％至饱和的硼酸水溶液中进行凝胶化处理而产生一凝胶球体，其特征在于该硼酸水溶液中含有5-15重量％磷酸或磷酸盐而硬化该凝胶球体，并且该凝胶化及硬化处理同时进行的时间为30分钟至2小时。

4.根据权利要求3所述的方法，其中该硼酸水溶液含有5重量％的硼酸。

5.根据权利要求3所述的方法，其中该凝胶化及硬化同时进行的时间为1-2小时。

6.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述的磷酸盐水溶液选自磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸铵、磷酸氢铵、磷酸二氢铵。

7.根据权利要求1或3所述的方法，其中微生物为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

8.根据权利要求1或3所述的方法，其中该微生物为简单节杆菌(Arthrobacter simplex)。

9.根据权利要求1或3所述的方法，其中该酶为淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶或葡萄糖异构酶。