CN103509783A - 一种enu诱导草鱼基因组dna中基因突变的化学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ENU在草鱼基因组DNA中诱发基因突变的化学方法，所述的ENU作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理浓度为0.1~0.5mM；精子诱导处理浓度为0.5~10mM。本发明还提供了ENU工作液在诱导草鱼基因DNA突变中的应用。本发明优点在于：采用ENU化学诱变剂浸泡受精卵和处理精子的方法均能产生一定比例发育正常、快速生长的个体，该方法可成功用于草鱼的育种工作，大大缩短草鱼的育种周期。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种ENU诱导基因突变的化学方法。
【背景技术】
养殖鱼类繁殖力强、体外受精和体外孵化等特点都十分有利于实施基因组化学诱变。ENU（N-ethyl-N-nitrosourea, N-乙基-N-亚硝基脲）是一种化学诱变剂，它通过对基因组DNA碱基的烷基化修饰，诱导DNA 在复制时发生错配而产生突变。它主要诱发单碱基突变，从而使得相应基因发生突变，其诱变模式与自发基因突变特征类似。同时，ENU的突变效率非常高，单个位点的突变率可达0.5 × 10-3到3.9 × 10-3，是其他突变手段的10倍左右，而且这种突变是随机的，不具有任何的倾向性。目前，ENU诱变已在果蝇、斑马鱼、青鳉、非洲爪蟾和小鼠等模式生物中成功开展，获得了一些列功能突变体，成为解释模式生物功能基因组的重要方法和手段。尽管，化学诱变技术已广泛用于微生物和作物的遗传育种，但国内外在养殖鱼类中开展的极其有限。 ENU诱变应该也可在养殖鱼类中进行DNA诱变，筛选获得优良突变性状，在养殖鱼类遗传改良方面具有潜在的发展前景。
草鱼为典型的草食性鱼类，是我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，其性成熟时间通常需要5年以上，体重在大于10Kg，通常六代选育需要耗费30年以上的时间，迄今为止，草鱼没有获得选育良种。中国专利文献关于化学法诱导草鱼类基因突变的专利目前还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变的化学方法。
本发明的再一的目的是，提供一种ENU工作液的新用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种在草鱼基因组DNA中利用ENU 作为诱导剂诱发基因突变的化学方法， ENU 作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理浓度为0.1~0.5 mM；精子诱导处理浓度为0.5~10 mM。
所述的ENU 作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理最佳浓度为0.3mM。
所述的ENU 作为诱导剂诱变精子处理最佳浓度为1mM。
本发明诱导方法中使用的不同浓度的ENU工作液有固体部分和1L无菌蒸馏水组成，其中固体组分含量按重量百分比由以下组分组成
ENU 1%~2%
NaOAc 1%~2%
KCl 3%~6%
NaCl 65%~80%
NaHCO3 2%~5%
NaH2PO4·7H2O 1%~2%
MgSO4·7H2O 1%~2%
MgCl2·6H2O 1%~2%
KH2PO4 1%~2%
CaCl2 1%~2%
葡萄糖 8%~15% 。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
ENU工作液在诱导草鱼基因DNA突变中的应用。
本发明优点在于：采用ENU化学诱变剂浸泡受精卵和处理精子的方法均能产生一定比例发育正常、快速生长的个体，该方法可成功用于草鱼的育种工作，大大缩短草鱼的育种周期。
【附图说明】
图1A显示在mstn1基因编码框的190bp到252bp区域中，一个个体(编号：690 000 116 601 909，见图3B)在205nt的C突变成T和另一个个体（编号：690 000 116 601 814，见图3A）在239nt的A突变成G的基因改变图。
图1B显示在mstn1基因编码框区域中个体(编号：690 000 116 601 909，见图3B)在205nt出的C变为T导致的第69位编码谷氨酰胺产生终止密码子，造成密码子的无义突变。
图1C显示在mstn1基因编码框区域中个体（编号：690 000 116 601 814，见图3A）在239nt出的A变为G导致的第80位编码谷氨酰胺产生终止密码子，造成密码子的错义突变。
图2A显示在mstn2基因编码框的652bp到726bp片段中，一个个体（编号：690 020 042 302 468，见图3E）在658nt的G突变成A和另一个个体（编号690 020 042 302 463，见图3D）在717nt的G突变成A的基因突变图。
图2B显示在mstn2基因编码框区域中个体（编号：690 020 042 302 468，见图3E）在658nt的G突变成A，导致第220位编码缬氨酸突变成异亮氨酸，造成密码子的错义突变。
图2C显示在mstn2基因编码框区域中个体（编号：690 020 042 302 463，见图3D）在717nt的G突变成A，则产生谷氨酸密码子的同义突变。
图3A显示在mstn1基因编码框区域中个体（编号：690 000 116 601 814）在239nt出的A变为G导致的第80位编码谷氨酰胺产生终止密码子，造成密码子的无义突变后ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼的发育正常的形态特征。
图3B显示在mstn1基因编码框区域中个体(编号：690 000 116 601 909，在205nt出的C变为T导致的第69位编码谷氨酰胺产生终止密码子，造成密码子的无义突变后ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼发育正常的形态特征。
图3C显示ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼畸形发育的形态特征。
图3D显示在mstn2基因编码框区域中个体（编号：690 020 042 302 463）在717nt的G突变成A，则产生谷氨酸密码子的同义突变后ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼畸形发育的形态特征。
图3E显示在mstn2基因编码框区域中个体（编号：690 020 042 302 468）在658nt的G突变成A，导致第220位编码缬氨酸突变成异亮氨酸，造成密码子的错义突变后ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼畸形发育的形态特征。
图4显示ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼的生长特征（黑框代表畸形，白框代表正常体型）。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
ENU工作液的配制一
1、将0.1 g ENU溶解于8.5 ml浓度为10 mM的NaOAc溶液中，配成0.1 M的ENU母液。
实施例2
ENU工作液的配制二
1、将0.1 g ENU溶解于8.5 ml浓度为10 mM的NaOAc溶液中，配成0.1 M的ENU母液，使用前，用改进的Hanks平衡盐溶液稀释到0.3 mM。
2、改进的Hanks溶液的配制方法：0.4 g KCl、8 g NaCl、0.35 g NaHCO3、0.09 g NaH2PO4·7H2O、0.1 g MgSO4·7H2O、0.1 g MgCl2·6H2O、0.06 g KH2PO4、0.14 g CaCl2和1 g葡萄糖加入1 L无菌重蒸水中。
实施例3
ENU工作液的配制三
1、将0.1 g ENU溶解于8.5 ml浓度为10 mM的NaOAc溶液中，配成0.1 M的ENU母液，使用前，用改进的Hanks平衡盐溶液稀释到0.5 mM。
2、改进的Hanks溶液的配制方法：0.4 g KCl、8 g NaCl、0.35 g NaHCO3、0.09 g NaH2PO4·7H2O、0.1 g MgSO4·7H2O、0.1 g MgCl2·6H2O、0.06 g KH2PO4、0.14 g CaCl2和1 g葡萄糖加入1 L无菌重蒸水中。
实施例4
ENU工作液的配制四
1、将0.1 g ENU溶解于8.5 ml浓度为10 mM的NaOAc溶液中，配成0.1 M的ENU母液，使用前，用改进的Hanks平衡盐溶液稀释到1 mM。
2、改进的Hanks溶液的配制方法：0.4 g KCl、8 g NaCl、0.35 g NaHCO3、0.09 g NaH2PO4·7H2O、0.1 g MgSO4·7H2O、0.1 g MgCl2·6H2O、0.06 g KH2PO4、0.14 g CaCl2和1 g葡萄糖加入1 L无菌重蒸水中。
实施例5
ENU工作液的配制五
1、将0.1 g ENU溶解于8.5 ml浓度为10 mM的NaOAc溶液中，配成0.1 M的ENU母液，使用前，用改进的Hanks平衡盐溶液稀释到5 mM。
2、改进的Hanks溶液的配制方法：0.4 g KCl、8 g NaCl、0.35 g NaHCO3、0.09 g NaH2PO4·7H2O、0.1 g MgSO4·7H2O、0.1 g MgCl2·6H2O、0.06 g KH2PO4、0.14 g CaCl2和1 g葡萄糖加入1 L无菌重蒸水中。
实施例6
ENU工作液的配制六
1、将0.1 g ENU溶解于8.5 ml浓度为10 mM的NaOAc溶液中，配成0.1 M的ENU母液，使用前，用改进的Hanks平衡盐溶液稀释到10 mM。
2、改进的Hanks溶液的配制方法：0.4 g KCl、8 g NaCl、0.35 g NaHCO3、0.09 g NaH2PO4·7H2O、0.1 g MgSO4·7H2O、0.1 g MgCl2·6H2O、0.06 g KH2PO4、0.14 g CaCl2和1 g葡萄糖加入1 L无菌重蒸水中。
实施例7
1 材料和方法
1.1、材料与仪器
繁殖用鱼为上海海洋大学青浦鱼类育种试验站保有的长江水系草鱼亲本
ENU（Sigma公司），引物（上海生工生物工程技术服务有限公司），Nikon SMZ1500体视显微镜，促黄体素释放激素（宁波市三生药业有限公司），地欧酮（宁波市三生药业有限公司），100目渔网，塑料培养皿，95%酒精，无菌重蒸水，葡萄糖，化学药品KCl、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、KH2PO4、CaCl2，NaOAc等（上海生工生物工程公司），直尺，
1.2具体步骤
1.2.1 草鱼亲本人工催产、取精
挑选发育良好的6龄草鱼亲鱼雌、雄亲鱼各9尾，平均体重约24 kg。草鱼雌亲鱼注射促黄体素释放激素A2（LHRH-A2）4 μg/kg+地欧酮DOM 4 mg/kg，进行催产，雄鱼剂量减半。雌、雄亲鱼置于产卵池中，流水刺激，在草鱼发情后拉网，立即取雄性草鱼精子开始ENU处理。在精子处理过程中，雌鱼亲鱼仍放于产卵池中，待草鱼精子ENU处理结束后即进行人工授精。同时，进行未处理草鱼卵与精子的人工授精，用于草鱼0-1细胞期受精卵的ENU浸泡。
1.2.2 ENU浸泡草鱼0-1细胞期受精卵可诱发后代基因组DNA 突变
对草鱼进行催产和人工授精，受精卵放于直径为60 cm的白色搪瓷盆中用孵化水室温孵化，在草鱼受精卵还处于0 - 1细胞期（授精后约10 - 15分钟，此时草鱼受精卵还处于吸水膨胀阶段）时，用100目渔网滤出适量（1000-2000粒）受精卵，分别放于用孵化水稀释好的含不同浓度ENU的工作液（0.1 mM为实施例1配制、0.3 mM为实施例2配制和0.5 mM 为实施例3配制）中浸泡10分钟。之后倒出工作液，用孵化水清洗受精卵5次。将清洗好的受精卵分入直径90 mm培养皿中，每个培养皿200颗左右的卵进行孵化。整个操作过程戴好手套和口罩，并在室外上风口进行。每4hr用吸管换水和挑死卵，在Nikon SMZ1500体视显微镜下进行发育时相观察、统计和拍照，统计体节期胚胎的畸形率和正常鱼苗的出苗率。出苗平游后，将鱼苗放于标准化土池发塘和养殖。
1.2.3 精子ENU处理、授精、孵化、养殖和标记
处理精子时，取不同浓度的ENU工作液（0.5 mM为实施例3配制、1 mM为实施例4配制、5 mM为实施例5配制和10 mM 为实施例6配制）浸泡草鱼精子，精子与ENU工作液按1:4稀释，摇匀并放置在室温下，每10 min用镊子尖头粘取精液在解剖镜或显微镜下检测精子的活力，在处理30 – 60 min后，与草鱼卵子进行人工干法授精。受精卵置于塑料培养皿（直径90 mm）中进行室温培养，每个培养皿放置草鱼受精卵约200颗，每4 hr用吸管换水和挑死卵，在Nikon SMZ1500体视显微镜下进行发育时相观察、统计和拍照，统计体节期胚胎的畸形率和正常鱼苗的出苗率。出苗平游后，将鱼苗放于标准化土池发塘和养殖。年底起捕，对每条鱼进行PIT标记、测量体重和数码拍照，剪鳍置于95%酒精保存，并建立个体档案。
1.2.4 诱变F1代突变位点的检测
在0.3 mM ENU草鱼受精卵处理组中和1.0 mM ENU草鱼精子处理组中，随机提取20尾1＋龄诱变F1子代的95%酒精保存鳍条，剪取0.1 g左右, 按照Sambrook等方法提取基因组DNA。根据igf-2a、igf-2b、mstn-1、mstn-2、fst-1和fst-2 6个生长发育通路相关基因的部分阅读框设计引物（如表1所示）
1.3 PCR扩增程序
PCR扩增混合物中含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)、20 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、1.5 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L每种dNTP、引物浓度为0.2 μmol/L、约200 mg基因组DNA、2 U Taq酶, 反应总体积为25 μL。PCR扩增程序为: 94℃预变性5 min后; 94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 1~2 min, 共35个循环; 最后再72℃延伸10 min。取3 μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳, EB染色后, 在Bio-Rad凝胶成像系统中照相记录。雌雄亲本在PCR后，采用直接对上述6个基因测序，以排除可能存在的SNP位点对后代突变位点的统计所带来的干扰。突变子代经PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后, 进行割胶回收，回收片段与pMD19-T（TaKaRa）载体连接，然后转化到感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB平板上培养并进行PCR检菌。
1.4 基因突变率的计算方法
每个个体单个基因挑取8个阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，采用Polyphred version 6.0 Beta软件检测出突变位点。如果某一突变位点在8个克隆中的2个以上存在，即定位发生了点突变。某一基因座位突变率的检测采用如下公式进行：
突变率 (%) =
。
1.5 统计分析
采用t检验（t-test）2个平均值之间的差异显著性，P<0.01为差异极显著。
2. 结果与讨论
2.1 ENU难以对雄性草鱼亲鱼体内注射诱导精子突变
2010年1月 - 5月，选取6尾雄性草鱼亲鱼，每条重约10 kg，采用胸鳍腔注射的方式分3批进行ENU注射，每批注射2尾。药品注射方式为，将1 g ENU用5 ml酒精溶解后，再加入1 ml pH为6.0的磷酸缓冲液，得到6 ml的溶液，然后给每条雄草鱼注射3 ml，每批注射2条，即最终相当于给每条雄性草鱼注射了0.5 g的ENU。需注明的是，为了区分打针后的草鱼，我们给打针的每条鱼还打了电子标签，以便进行身份确定。同时剪取胸鳍保存于95%的酒精中，方便后期监测其后代基因型的变化。每批雄性的草鱼都注射3针ENU，每针注射时间相隔一个星期。第一批分别于1月26日、2月2日和2月9日进行注射，第二批分别于2月23日、3月2日和3月9日进行注射，第三批分别于3月20日、3月27日和4月3日进行注射，每批鱼3针打完后，放入亲鱼池与其它亲鱼混养，等待到繁殖季节后再取出进行人工授精。2010年5月中旬繁殖季节，对6尾雄性草鱼亲鱼进行检测，发现性腺无精子产生，无法进行繁殖。
实验结果说明采用胸鳍腔注射的方式进行雄性草鱼亲鱼ENU注射，注射的草鱼亲鱼在繁殖季节不能产生精子，无法产生后代，因此该方法不适合进行草鱼基因组DNA 诱变。
2.2 ENU浸泡草鱼0-1细胞期受精卵诱发突变
以0、0.1、0.3、0.5 mM等不同浓度的ENU溶液浸泡草鱼0-1细胞期受精卵10 min，正常鱼苗的出苗率分别为93.4%、80.1%、50.8%和39.1%，与ENU处理浓度成反比；在ENU诱导的孵化期胚胎中，既存在发育正常的胚胎，还存在一定比例的畸形胚胎。类型包括：（1）脊椎发育异常，如长度缩短、尾部弯曲;（2）神经系统发育异常，如头部中枢神经缩小，有些胚胎出现头部不发育等极端类型;（3）内脏器官发育异常，如心脏移位、围心腔扩大等。
根据ENU诱变特性，当ENU诱变子代正常与畸形鱼苗的比例各为50%时，可在后代中有效产生基因组突变，而在0.3 mM ENU处理组中，正常苗的出苗率接近50%，可以作为一个合适的草鱼胚胎诱变处理浓度处理草鱼胚胎，说明采用ENU浸泡草鱼0-1细胞期受精卵可以有效的诱导草鱼胚胎基因DNA的突变。
2.3 ENU处理草鱼精子的方法诱发精子突变
以0.5 mM、1 mM、5 mM和10 mM等不同浓度ENU处理草鱼成熟精子，再与野生型雌鱼受精获得了诱变F1子代，诱变F1子代的胚胎发育到体节期（受精后约16-18hr）时的畸形率分别为16.1％、38.7％、66.9％和91.3％（表2），极显著高于对照组的畸形率（3.1％），不同浓度的ENU诱变子代胚胎的畸形率也存在极显著差异（P<0.01），并与ENU浓度成正相关；诱变F1代的正常鱼苗出苗率分别为76.9％、52.6％、14.4％和4.4％（表2），在不同浓度ENU诱导组间存在极显著差异（P<0.01），并显著低于对照（93.1％），诱变后代的正常苗出苗率与ENU浓度成负相关。实验结果说明采用ENU处理草鱼精子的方法可以有效的诱导草鱼胚胎基因DNA的突变。
表2 不同ENU处理浓度对草鱼胚胎发育的影响
注：同列中平均值上标不同字母表示差异极显著（P<0.01）
2.4 ENU诱变F1代突变位点的检测和诱变频率
为了检测ENU诱变F1代的突变位点和诱变频率，在0.3 mM ENU草鱼受精卵处理组中和1.0 mM ENU草鱼精子处理组中，分别随机提取10尾1＋龄诱变F1子代的基因组DNA和5尾对照F1子代的基因组DNA，根据igf-2a、igf-2b、mstn-1、mstn-2、fst-1和fst-2等6个生长发育通路相关基因的部分阅读框设计引物，进行PCR、割胶回收、连接、转化、阳性克隆筛选和测序。就单个个体而言，每个基因的PCR产物送6个克隆进行测序。如表3所示，在igf-2a、igf-2b、mstn-1、mstn-2、fst-1和fst-2扩增的224bp、174 bp、356bp、329bp、196bp和173bp片段中，在突变F1代的20个个体中分别检测出突变位点15个、10个、18个、21个、12个和12个，突变频率分别为0.34％、0.29％、0.26％、0.32％、0.31％和0.35％，这些基因的平均突变频率为0.31%，在对照F1子代中未检测到点突变的发生（表3）。实验结果对比说明经0.3 mM ENU草鱼受精卵处理组和1.0 mM ENU草鱼精子处理后的6个产物片段中，均可以检测到基因突变的发生。
表3 6个生长相关基因位点的突变频率
Mutation rate (%) = Number of mutated sites / Number of fish examinedｘLocus size (bp) excluding primers. 序列分析结果显示，在ENU诱变后代基因组DNA中，有52%（46/88）产生了G-C到A-T的转换、35%（31/88）产生了A-T到G-C的转换、9%（8/88）产生了A-T到T-A的颠换、2个A-T到C-G的颠换和1个G-C到T-A的颠换（结果未列出）。这些点突变可造成密码子的66%（58/88）非同义突变，其中64%（37/88）为错义突变，其余则为无义突变。如图1所示，在mstn1基因编码框的190bp到252bp区域中，一个个体（编号：690 000 116 601 909，见图3B）在205nt的C突变成T (图1A)，导致第69位编码谷氨酰胺产生终止密码子，造成密码子的无义突变 (图1A, 图1B)；另一个个体（编号：690 000 116 601 814，见图3A）在239nt的A突变成G (图1A)，导致第80位编码谷氨酰胺突变成精氨酸，造成密码子的错义突变 (图1A, 图1C)。在mstn2基因编码框的652bp到726bp片段中，一个个体（编号：690 020 042 302 468，见图3E）在658nt的G突变成A，导致第220位编码缬氨酸突变成异亮氨酸，造成密码子的错义突变 (图2A, 图2B)；另一个个体（编号：690 020 042 302 463，见图3D）在717nt的G突变成A，则产生谷氨酸密码子的同义突变 (图2A, 图2C)。
2.5 ENU诱变F1代一龄阶段的生长情况
如表2所示，在0.3 mM ENU草鱼受精卵处理组中和1.0 mM ENU草鱼精子处理组中，均能产生一定数量存活的F1后代，同时又能显示出明显的显性突变性状。保留以在0.3 mM ENU草鱼受精卵处理组中和1.0 mM ENU草鱼精子处理组获得的诱变鱼苗，待平游后，3个处理组和对照分别放于标准化6个土池发塘和养殖。经8个月的养殖后，年底起捕，并对每条鱼进行PIT标记、测量体重和数码拍照，剪鳍置于95%酒精保存，并建立个体档案。
在ENU诱变F1代一龄幼鱼中，生长和发育正常的个体约占50％，如图3A和3B所示；其它50％左右的个体存在不同的生长和发育障碍，产生的一些畸形个体如图3C、3D和3E所示。如图4A所示，ENU诱变F1代1＋龄阶段的生长存在较大的差异，体重范围在204.5-756.6g，平均体重为437.1±276.2g（表4），而对照体重范围在504.2-576.4g，平均体重为548.7±42.4g（表4；图4B）。
尽管ENU诱变F1代的平均体重只有对照体重的80％，但ENU诱变后代的体重的变异系数为对照的6.5倍。因此这种方法可以有效地希望获得大量的突变体品系，建立自己的突变体遗传资源库，从而利用它们作为遗传育种的物质基础。
表4 ENU诱变F1代1＋龄阶段幼鱼的生长
| Crossing group | ENU concentration (mM) | No. of F1 fish | Body weight range (g) | Body weight (g) |
| ♀1ｘ♂1 | 1 | 304 | 218.3-756.6 | 431.2 ±270.1 |
| 0 (control) | 102 | 511.7-576.4 | 555.8 ±44.7 | |
| ♀2ｘ♂2 | 1 | 322 | 212.1-744.2 | 452.9 ±292.4 |
| 0 (control) | 128 | 504.2-565.5 | 538.5 ±40.3 | |
| ♀3ｘ♂3 | 1 | 418 | 204.5-750.6 | 427.2 ±266.1 |
| 0 (control) | 189 | 519.3-559.8 | 551.8 ±42.2 | |
| Mean | 1 | — | — | 437.1 ±276.2 a |
| 0 (control) | — | — | 548.7 ±42.4 b |
2、讨论
本研究采用草鱼受精卵和精子浸泡法进行了ENU诱变，由于精子的头部和0-1细胞期受精卵主要由高含量DNA的核物质组成，各种诱变剂的遗传效应最明显。在我们的研究中，在ENU诱导的孵化期胚胎中，既存在发育正常的胚胎，还存在一定比例的畸形胚胎，草鱼胚胎的畸形率随精子的ENU处理浓度的增加而显著提高，诱变后代的正常苗出苗率与ENU浓度成负相关。ENU诱变后代的畸形率升高的原因可能有2个：一是ENU诱变剂影响了处理精子的受精能力，这与性细胞原生质结构的损伤有关，属于非遗传因素；二是ENU诱变剂使得一些显性基因产生致畸形或致死突变，基因物质发生突变的体现。诱变获得的后代经一年的养殖后，发现在1＋龄阶段的生长存在较大的变异，体重范围在204.5-756.6g，平均体重为437.1±276.2g，变异系数显著宽于对照（548.7±42.4g），这些遗传突变后代可为草鱼进一步的遗传选育提供材料，并已成功用于草鱼的育种工作，可大大缩短草鱼的育种周期。
采用在草鱼受精卵或精子浸泡法进行ENU诱变获得的草鱼F1代突变体，突变碱基通常以杂合或嵌合形式存在于基因组DNA中。通过进行草鱼F1代突变基因组DNA的PCR、割胶回收、连接、转化，并挑取一定量的阳性克隆进行测序，就可检测到以杂合或嵌合形式存在于基因组DNA中的突变碱基。本研究在igf-2a、igf-2b、mstn-1、mstn-2、fst-1和fst-2扩增的224bp、174 bp、356bp、329bp、196bp和173bp片段中，在突变F1代中检测到不同的点突变，突变类型基本均为A-T到G-C或G-C到A-T的点突变，这些突变主要造成密码子的无义突变、错义突变和同义突变。草鱼突变F1代30个个体中的突变频率分别为0.34％、0.29％、0.26％、0.32％、0.31％和0.35％，这些基因的平均突变频率为0.31%。这些结果表明，ENU溶液浸泡草鱼精子可实现较高的诱变，预示着ENU诱变方法在草鱼功能基因组研究和育种方面具有潜在的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海海洋大学
<120> 一种ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变的化学方法
<130> /
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacaggaggt cccaagaaa 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcacttgtgg ctaacgtagt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtgaagtat tccaaataga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcatttgtgg gatgtgttga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgcatttta cgcaggtttt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctctgtggc catggtcatg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caagccatca cccatcttga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cagtccttcc tctccagatt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggccaagtc atgcgatgat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttacagttg caagatccta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agacgccagg tcctgtgaag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agttgcagga gcccgagtgc 20
Claims (2)
1.一种在草鱼基因组DNA中利用ENU 作为诱导剂诱发基因突变的化学方法，其特征在于：ENU 作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理浓度为0.1~0.5 mM；精子诱导处理浓度为0.5~10 mM。
2.一种如权利要求1所述的一种ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变化学方法，其特征在于ENU 作为诱导剂诱变草鱼胚胎处理最佳浓度为0.3mM。
3.一种如权利要求1所述的一种ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变化学方法，其特征在于ENU 作为诱导剂诱变精子处理最佳浓度为1mM。
4. 根据权利要求1-3任一所述的ENU诱导草鱼基因组DNA中基因突变化
学方法，其特征在于：诱导方法中使用的不同浓度的ENU工作液有固体部分和1L无菌蒸馏水组成，其中固体组分含量按重量百分比由以下组分组成
ENU 1%~2%
NaOAc 1%~2%
KCl 3%~6%
NaCl 65%~80%
NaHCO3 2%~5%
NaH2PO4·7H2O 1%~2%
MgSO4·7H2O 1%~2%
MgCl2·6H2O 1%~2%
KH2PO4 1%~2%
CaCl2 1%~2%
葡萄糖 8%~15%
5. 根据权利要求1 – 3任一所述的化学方法配制的ENU工作液在诱导草鱼基因DNA突变中的应用。
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