CN103484400A - 一种杀虫防病促生长的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种杀虫防病促生长的工程菌株TLB15，由能够防治蔬菜多种病害且对蔬菜具有促生长作用的枯草芽孢杆菌TL2和具有杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌B7216，构建的新菌株；其构建方法为应用热-紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内，获得新的具有杀虫防病促生长的多重功能的工程菌株TLB15。该工程菌同时具有杀虫防病促生长的多重功能，工程菌株TLB15经固态发酵后，经加工制得的可湿性粉剂，可用于农业病虫害的生物防治，特别是用于防治小菜蛾、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病及促进辣椒和黄瓜的生长。

Description

一种杀虫防病促生长的工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一株杀虫防病促生长的工程菌株及其构建方法，更具体而言是两株生防细菌通过热-紫外灭活原生质体后融合成的高效新菌株及其融合方法。 

背景技术

农药在农业生产中必不可少，但化学农药具有剧毒、高残留、难降解等诸多问题，已造成严重的环境污染，还使得很多病虫害产生抗药性。作为代替传统农药的微生物农药已逐渐成为生态农药产业的主体。（我国微生物农药的研究与展望。（2010）段永兰，侯金丽，邢文会。安徽农业科学。38（8）：4135-4138）。生物防治已经成为保护地蔬菜和瓜果类等一些经济价值较高的绿色农业生产中的首选防治手段。 

黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病都是作物的土传病害，是黄瓜和辣椒的常见病害。黄瓜枯萎病是世界各国黄瓜生产中的主要病害之一，该病属于维管束病害，重病年份的发病率可达80%-90%（黄瓜枯萎病对黄瓜光合和水分生理特性的影响。（2011）郭晋云，胡晓峰，李勇，王敏，沈其荣，郭世伟。南京农业大学学报。34（1）：79-83）辣椒疫霉病在辣椒的整个属于其都能发生，可侵染茄科和葫芦科的多种作物，今年来随着辣椒连茬种植增多，疫霉病有加重的趋势，往往导致短期内辣椒大面积死亡（辣椒疫霉病的发生与综合防治。（2010）王娟，吕巧玲。西北园艺。1:42-43）。目前对黄瓜枯萎病（2007武振亚，潘兰，孙利忠，安徽农学通报，13（11）：220-221）和辣椒疫霉病（2010王娟，吕巧玲，病虫防治，西北园艺。1：42-44）防治还是以化学农药防治为主，因此为了降低环境污染保护环境，也为了加强食品安全保护人类的健康，研究开发对蔬菜病虫害均有效的生物农药具有非常重大而深远的意义。 

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis 简称Bt）是细菌杀虫剂中研究最深入的微生物农药菌种，其通过所含的伴孢晶体、外毒素和卵磷脂等引起昆虫肠道等病症，达到致死作用（我国微生物农药的研究与展望。（2010）段永兰，侯金丽，邢文会。安徽农业科学。38（8）：4135-4138）。目前Bt农药主要用来防止鳞翅目、双翅目和鞘翅目的某些有害昆虫（刘石泉，苏云金芽孢杆菌高效价杀虫剂的研究进展（微生物学通报，2008, 35(7): 1091-1095）。本发明所使用的菌株（Bt 7216）属于苏云金芽孢杆菌，主要用于防治鳞翅目害虫，为本实验室分离保存菌种。枯草芽孢杆菌TL2是从茶树上分离的具有内生防病和降解农药作用的一株多功能菌株（茶树内生防病和农药降解菌的分离。（2005），25（3）：183-188），由合作方武夷学院提供。 

在诸多构建工程菌株的途径中，原生质体融合是获得菌种融合体和重组体的有效方法，利用灭活原生质体作为供体进行融合是选育优质菌株的重要技术研究方向。（热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究。王燕（2008）。中国酿造。13:42-44）微生物原生质体的灭活是利用物理或化学的方法造成原生质体丧失独立的再生活性，而其染色体仍保持复制与重组能力，融合后原生质体的细胞核和线粒体等仍具有转化和互补功能（Ferenczy L. cel l fusion-Gene t rasfer and transformation,New York:Raveb Oressam,1984.）。其中热灭活主要作用在细胞之中，使核糖体或核糖体RNA受损伤，（Hopwood D A, et al. Bacterial Rev,1977;42:595-635. Witter L D, et al. Science,1981; 64:174.）使细胞内的功能蛋白、酶蛋白的合成受影响甚至变性灭活（热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究。王燕（2008）。中国酿造。13:42-44）。紫外灭活主要作用在DNA上，对不同原生质体细胞作用位置存在差异（Hopwood D A, et al. Bacterial Rev,1977;42:595-635.）。双亲灭活原生质体融合方法省去了使出发菌株获得稳定遗传标记的过程，排除了双方亲本类型的再生产物，有利于重组融合子的选择构建，提高了筛选效率（热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究。王燕（2008）。中国酿造。13:42-44）。在双亲灭活方法中，双亲分别采用不同的方法灭活更能得到较高的重组率，被称为损伤互补原则（Fodor K ,et al.Journal of Bacteriology,1978;135 (1):68-70. Wright W E. Exp Cell Res,1978;112:395.）。灭活细胞通过双亲原生质体的融合、再生，得到的重组融合子可具有双亲性状，并且为机能完整的菌株。 

本发明采用双亲灭活法，首次将具有防病作用的生防菌株TL2和具有杀虫作用的生防菌株B7216分别进行热灭活和紫外灭活，利用损伤互补的原理进行原生质体融合，构建同时具有杀虫、防病和促生长特性的新型工程菌株，将为农业病虫害的的生物防治提供重要技术手段。 

发明内容

针对现有技术的不足，提供一种利用热-紫外灭活双亲构建杀虫防病促生长的工程菌株及其构建方法。 

本发明提供一株杀虫防病促生长的多功能工程菌株TLB15。发明利用的两个亲本菌株分别是TL2和B7216。TL2是从福建茶园铁观音叶片内分离的的一株枯草芽孢杆菌，能够防治蔬菜多种病害且对蔬菜具有促生长作用。B7216是本实验室保存的具有杀鳞翅目害虫的一株苏云金芽孢杆菌。本发明应用热-紫外灭活两亲本后，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内，使构建的新菌株同时具有杀虫防病促生长的多重功能，用于农业病虫害的生物防治。 

本发明所述的杀虫防病促生长的工程菌株构建方法，包括下列步骤： 

（1）两亲本菌体的制备

将枯草芽孢杆菌TL2和苏云金芽孢杆菌B7216接种到斜面完全培养基，活化后立即取菌一环转接至30mL液体完全培养基，于30℃恒温摇床中培养24h，制得两亲本菌体。

（2）两亲本原生质体的制备 

取步骤（1）培养的两亲株24h培养液将其培养至两亲本的对数生长期。镜检后将两亲本用SMM高渗缓冲液制成10³个/ml细菌的菌悬液。B7216菌悬液加入1.0mg/ mL的溶菌酶后酶解70min制得B7216原生质体。TL2菌悬液加入1.25mg/ mL的溶菌酶后酶解50min制得TL2原生质体。

（3）两亲本原生质体的融合 

 取步骤（2）中制备的TL2原生质体悬浮液5ml置于小试管，在60℃水浴条件下水浴35min，使TL2原生质体的完全被灭活。取步骤（2）中制备的B7216原生质体悬浮液5ml置于小试管，在15W紫外灯下照射25min，垂直照射距离为30cm，使B7216原生质体的完全被灭活。

取灭活的两亲株原生质体各2ml混合,4000rpm离心15min，弃上清液，再向沉淀液中加入40%（w/v）PEG6000(在SMMD高渗液中加入40%的PEG6000，pH=7.0。用于原生质体的融合。)的SMMD溶液(SMM缓冲液中加DNA酶5ug/mL，临时配制备用。在原生质体的融合过程中排除亲本的转化。)4ml与0.4ml的新生磷酸钙溶液混合均匀，37℃水浴保温10min得到融合的原生质体。 

（4）融合子的再生与传代培养 

取步骤（3）中融合后的原生质体用SMM高渗缓冲液将融合液稀释10倍，取0.1ml涂布于高渗基本再生培养基上，置于30℃恒温箱中培养3天，得到了17个融合子。将获得的17个融合子（简称为TLB1，TLB2，TLB3…………TLB17.）用牙签点接于完全培养基平板上，放于30℃恒温箱中培养24h后再影印到再生培养基平板上，传代10次，镜检后用试管斜面保存。

（5）融合子的初筛 

初筛采用平板拮抗试验测定17个融合子对辣椒疫霉病和黄瓜枯萎病的抑菌作用。平板拮抗采用菌块对峙培养法对已纯化的17株内生细菌融合子进行筛选，初步选出TLB1，TLB2和TLB15三个菌株与亲本的防病效果相当。

（6）融合子的复筛 

复筛采用镜检晶体（因为晶体关系到融合菌株是否具有杀虫作用）及对小菜蛾的杀虫试验。显微镜下观察到只有TLB15产生晶体，且晶体量变少，不及亲本B7216的晶体量。采用浸叶法测定生防菌株对小菜蛾的室内毒力测定。根据杀虫试验，复筛最后选出TLB15为稳定融合子。

（7）稳定融合子TLB15对辣椒的促生长作用 

分别用TL2、B7216、TLB15（活菌计数在10⁸cfu/mL）和清水CK浸泡辣椒种子24h，然后播种于无菌土盆钵，播种40粒，每处理3次重复；出苗后每盆定植取10株苗，从播种到第45天后调查苗并计算根的平均长度、苗平均株高、苗平均株重，最后得出融合子TLB15（和清水对照相比）对辣椒具有明显的促生长作用。

（8）TLB15对黄瓜的促生长作用 

采用种子发酵液浸泡和出苗后发酵液浇灌的方法。生长20天后调查黄瓜苗并计算黄瓜根的平均长度、黄瓜苗平均株高、黄瓜苗平均株重。根据黄瓜的促生长试验总结出TLB15的幼根长、平均株重和平均株高均介于两亲本之间，而且和清水对照相比促生长作用显著。

附图说明

图1 为再生的17个融合子菌落形态。    

图2 为TLB15的菌体、孢子、晶体。

图3 为小菜蛾健康虫体。               

图4 为24h小菜蛾死虫体。

图5 为48h小菜蛾死虫体。              

图6 为72h小菜蛾死虫体。

图7 为TLB15对辣椒的促生长作用。 

图8 为TLB15对黄瓜的促生长作用。 

具体实施方式

   （1）两亲本菌体的制备 

将枯草芽孢杆菌TL2和苏云金芽孢杆菌B7216接种到斜面完全培养基（蛋白胨1%；酵母粉0.5%；牛肉膏0.5%；氯化钠0.5%，pH=7.0，121℃灭菌25min。（固体加琼脂2%）），活化后立即取菌一环转接至30mL液体完全培养基，于30℃恒温摇床中培养24h，制得两亲本菌体。

（2）两亲本原生质体的制备 

1）两亲本最适酶解浓度的筛选

TL2和B7216酶解浓度设定为0.5，1.0，1.25，1.5mg/ml，2.0mg/ml共五个浓度的溶菌酶。 酶解2h。采用平板计数法观察原生质体的形成率和再生率。

取0.1mL新鲜的菌悬液分别涂完全培养基平板,30℃下培养24h,计数未经酶处理的总菌数A。取1mL菌悬液10000rpm离心2min，去掉上清，加入0.5mL的SMM高渗缓冲液，振荡均匀，再离心，重复3次，洗去细胞表面的附作物，便于酶解。 

加入0.5mg/ml(5mg/m母液0.1ml)，1.0mg/ml(母液0.2ml)，1.25mg/ml(母液0.25ml)，1.5mg/ml(母液0.3ml)，2.0mg/ml(母液0.4ml)共五个浓度的溶菌酶。混匀后立即加入预热的EDTA溶液37度水浴酶解2h。 

分别取原生质体悬浮液0.1ml,放于0.9ml无菌水中,静置10min,使原生质体裂解,取0.1ml涂完全培养基平板,每种菌株涂两个平板,30℃下培养24h,计数经酶处理后的剩余菌数B。 

取两亲株的原生质体悬浮液各0.1ml,用SMM溶液(蔗糖0.5mol/L，氯化镁0.02mol/L，顺丁烯二酸0.02mol/L，pH=7.5，121℃灭菌20min作为原生质体的悬浮稳定液。)作适当稀释,涂布在高渗再生培养基的平板上,每种菌株涂两个平板,30℃培养3天后,进行菌落计数,即可获得原生质体再生数C。 

原生质体形成率%=（A-B）/A×100% 

再生菌数=C-B

再生率%=（C-B）/（A-B）×100%

酶解液用SMM稀释10⁴后，200ul中统计的数据

    从上表1中可以看出B7216原生质体的形成率随着酶浓度的增加而增加，而再生率总体上是随着酶浓度的升高而降低。从上表1中可以看出对B7216最合适的酶解浓度为1.0mg/ml，此时B7216原生质体形成率和再生率分别为69.0%和13.77%。

酶解液用SMM稀释10⁴后，500ul中统计的数据 

从上表2中可以看出TL2原生质体的形成率随着酶浓度的增加而增加，而再生率总体上是随着酶浓度的升高而降低。从上表2中可以看出对TL2最合适的酶解浓度为1.25mg/ml，此时TL2原生质体形成率和再生率分别为78.33%和12.34%。

2）两亲本最适酶解时间的筛选 

TL2和B7216在各自最佳酶解浓度下，设置五个不同的酶解时间分别为10，30，50，70，90min。 采用平板计数法观察原生质体的形成率和再生率（公式同具体实施方式（2）中的1））。

酶解液用SMM稀释105后，200ul中统计的数据 

    从上表3中可以看出B7216原生质体的形成率随着酶解时间的延长而增加，但在酶解70min以后原生体质形成率变化不大，趋于稳定。从原生质体的再生率来看，酶解70min以后再生率是随着酶解时间的延长而开始降低。从上表3中可以看出对B7216最合适的酶解时间为70min，此时B7216原生质体形成率和再生率分别为85.0%和29.41%。

酶解液用SMM稀释104后，100ul中统计的数据 

从上表4中可以看出TL2原生质体的形成率随着酶解时间的延长而增加，在酶解50min以后原生质体的形成率变化不大，趋于稳定。而原生质体的再生率总体上是随着酶解时间延长先升高后降低。在酶解50min以后原生质体形成率开始降低。从上表4中可以看出对TL2最合适的酶解时间为50min，此时TL2原生质体形成率和再生率分别为80.00%和25.00%。

3）两亲本原生质体的制备 

新鲜菌液培养8h.，活菌计数。TL2未经酶处理菌数5×10⁷cfu/mL，B7216未经酶处理菌数2.0×10⁸cfu/mL。取0.1mL新鲜的菌悬液分别涂完全培养基平板,30℃下培养24h, 计数未经酶处理的总菌数A。取1mL菌悬液10000rpm离心2min，去掉上清，加入0.5mL的SMM高渗缓冲液，振荡均匀，再离心，重复3次，洗去细胞表面的附作物，便于酶解。B7216中溶菌酶解浓度为1.0mg/ml，酶解时间为70min制得B7216原生质体；TL2中溶菌酶酶解浓度为1.25mg/ml，酶解时间为50min制得TL2原生质体。

（3）两亲本原生质体的融合 

1）TL2原生质体热灭活的时间筛选

将上述制备的TL2原生质体悬浮液5ml置于小试管，在60℃水浴条件下设置不同水浴时间，水浴后用SMM缓冲液进行梯度稀释。第一次水浴时间设置了2 min，4 min，6 min,8 min,10 min，2次重复。在第一次实验结果的基础上，第二次水浴时间设置了15 min,20 min,25 min,30 min,35 min,5次重复。将上述灭活好的原生质体涂再生平板，观察统计灭活效果。

  

从表5中可以看出TL2原生质体热灭活到30min以后，原生质体的死亡率均为100%，为了保证原生质体的完全被灭活，决定选取TL2原生质体的热灭活时间为35min。

2）B7216紫外灭活的时间筛选 

将按上述方法制备的B7216原生质体悬浮液5ml置于小试管，在15W紫外灯下照射不同时间，垂直照射距离为30cm。第一次紫外灭活时间设置为1 min,2 min,3 min,4 min,5 min，2次重复。在第一次实验结果的基础上，第二次紫外灭活时间设置了6 min,10 min,15 min,20 min,25 min,5次重复。将上述灭活好的原生质体涂再生平板，观察统计灭活效果。

从表6中可以看出B7216原生质体紫外灭活到20min以后，原生质体的死亡率均为100%，为了保证B7216原生质体的完全被灭活，决定选取B7216原生质体的热灭活时间为25min。 

取灭活的两亲株原生质体各2ml混合,4000rpm离心15min，弃上清液，再向沉淀液中加入40%（w/v）PEG6000的SMMD溶液4ml与0.4ml的新生磷酸钙溶液混合均匀，37℃水浴保温10min得到融合的原生质体。 

（4）融合子的再生与传代培养 

取（3）中融合后的原生质体用SMM高渗缓冲液将融合液稀释10倍，取0.1ml涂布于高渗基本再生培养基(完全培养基中加入0.5mol/L甘露醇，0.02mol/L六水氯化镁，0.02mol/L顺丁烯二酸，pH =6.7，115℃灭菌20min。（固体加琼脂2%）各培养基按以上成分称量熔化一调节pH值一过滤一灭菌一分装(灭菌试管和平皿)，培养基经灭菌后放在28℃恒温箱培养24h，无菌生长后方可使用。)上，置于30℃恒温箱中培养3天，得到了17个融合子，其平板形态各异，有的与亲本菌落形态一样，有些菌落边缘粗糙，形态与亲本发生变化，例如2、5、8、10、12、13、16。17个融合子菌落形态见附图中的图1。

继代培养10次，每代在30℃恒温箱中培养2天，最后长出的菌落可视为稳定的融合菌株.。镜检后用试管斜面保存。 

（5）融合子的初筛 

初筛的对峙培养法：分别从培养平板上取菌龄一致直径为5mm的致病病原菌菌块接种到距离PDA平板培养基中央1.5cm处，然后对峙方向距离平板中央1.5cm处点接生防菌，即致病菌和生防菌之间间距为3cm，然后置于30℃生化培养箱中培养，以只接致病病原菌的平板（点接位置与对峙平板中病原菌位置相同）和只接TL2（点接位置与对峙平板中生防菌位置相同）的生防菌平板为对照，每处理三次重复， 5d后测量各处理的菌落半径，计算平均抑菌率。

平均抑菌率 (%) =（对照病原菌菌落半径平均值-处理病原菌菌落半径平均值）/对照病原菌菌落半径平均值×100 

注：同列数据后附相同字母者表示经Duncan’s新复极差法检验在0.05水平上差异不显著。

从平板拮抗试验结果（见表7）可以看出各供试菌株和亲本TL2（62.50%）相比较，TLB15（68.00%）对黄瓜枯萎病拮抗效果最好。而在对辣椒疫霉病的拮抗试验中，TLB1，TLB2，TLB15三个菌株的抑菌率在62.79%-67.79%之间，和亲本TL2的抑菌率65.12%相当。所以初步筛选出TLB1，TLB2和TLB15三个菌株与亲本的防病效果相当。 

（6）融合子的复筛 

根据显微镜检结果采用浸叶法测定TLB15对小菜蛾的室内毒力效果。TLB15，TL2，Bt7216采用LB液体摇培36h到活菌数为10⁸cfu/mL备用。将不接触任何药剂、无虫卵的甘蓝叶片剪成 4cm×4cm 大小, 在配制好的药液中浸渍 10s后取出, 在阴凉处晾干后放入纱布封口的组培瓶内，瓶底放入保湿滤纸，每瓶接入20头小菜蛾 2龄幼虫, 每处理重复 3次。每隔24h后检查死虫数,计算死亡率和校正死亡率。

死亡率＝死虫数量/(死虫数量 + 活虫数量)×100% 

校正死亡率＝(处理死亡率 - 对照死亡率)/ (1- 对照死亡率) ×100%

杀虫试验结果（见表8）表明在药后72h TLB15对小菜蛾的校正死亡率（65.93%）要高于亲本TL2（14.99%）和亲本B7216（60.82%）。说明TLB15对小菜蛾具有杀虫活性，复筛最后选出TLB15为稳定融合子。

（7）稳定融合子TLB15对辣椒的促生长作用 

分别用TL2、B7216、TLB15（活菌计数在10⁸cfu/mL）和清水CK浸泡辣椒种子24h，然后播种于无菌土盆钵，播种40粒，每处理3次重复；出苗后每盆定植取10株苗，从播种到第45天后调查苗并计算根的平均长度、苗平均株高、苗平均株重。对辣椒的促生长试验结果（见表9）表明TLB15的幼根长、平均株重和平均株高均好于两亲本。TLB15与清水对照及两亲本相比促生长作用非常显著。

（8）TLB15对黄瓜的促生长作用 

采用种子发酵液浸泡和出苗后发酵液浇灌的方法。先用水清洗种衣剂，再分别用TL2、B7216、TLB15（三个菌液活菌计数在10⁸cfu/mL）和清水CK浸泡黄瓜种子6 h，然后播种于无菌土盆钵，播种20粒，每处理3次重复；出苗后每盆定植取10株苗，每盆苗浇灌100mL的菌液，生长20天后调查苗并计算根的平均长度、苗平均株高、苗平均株重。对黄瓜的促生长试验结果表明（见表10）TLB15的幼根长、平均株重和平均株高均高于两亲本，说明TLB15对黄瓜的促生长作用非常显著。

（9）TLB15 固态发酵工艺及可湿性粉剂的制备 

TLB15 固态发酵工艺：氮源（豆饼粉）、碳源（麸皮)、含水量（25 ml）、接种量（4%）、培养温度（35 ℃）和初始pH7.0。

优选的可湿性粉剂的载体：木质素磺酸钙（润湿分散剂），糊精（紫外保护剂），硅藻土（载体）。 

TLB15可湿性粉剂：将固态发酵粉碎后的制得孢子粉（4.0×10⁹cfu/g）与硅藻土载体、润湿分散剂木质素磺酸钙和紫外保护剂分别按1∶10、5∶1 和 50∶1 的比例混合均匀。 

（10 ）TLB15可湿性粉剂在田间对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有较好的防治效果，防效达65%，比亲本TL2防效高15.00%，比亲本B7216防效高45.33%，与对照药剂多菌灵的防治效果相当。TLB15可湿性粉剂在田间对白菜小菜蛾具有较好觉得防治效果，防效达86.67%，比比亲本B7216防效高13.33.00%，比亲本TL2防效高60.00%，比对照药剂2%的阿维菌素防效高30.00%。 

Claims (7)

1.一种杀虫防病促生长的工程菌株TLB15，其特征在于由能够防治蔬菜多种病害且对蔬菜具有促生长作用的枯草芽孢杆菌TL2和具有杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌B7216构建的新菌株。

2.如权利要求1所述杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的构建方法，其特征在于应用热-紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内 ， 获得新的具有杀虫防病促生长的多重功能的工程菌株TLB15。

3.如权利要求2所述杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的构建方法，其特征在于方法，包括下列操作步骤：

（1）两亲本菌体的制备

将枯草芽孢杆菌TL2和苏云金芽孢杆菌B7216接种到斜面完全培养基，活化后立即取菌一环转接至30mL液体完全培养基，于30℃恒温摇床中培养24h，制得两亲本菌体；

（2）两亲本原生质体的制备

取步骤（1）培养的两亲株24h培养液将其培养至两亲本的对数生长期，镜检后将两亲本用SMM高渗缓冲液制成10³个/ml细菌的菌悬液，B7216菌悬液加入1.0mg/ mL的溶菌酶后酶解70min制得B7216原生质体，TL2菌悬液加入1.25mg/ mL的溶菌酶后酶解50min制得TL2原生质体；

（3）两亲本原生质体的融合

    取步骤（2）中制备的TL2原生质体悬浮液5ml置于小试管，在60℃水浴条件下水浴35min，使TL2原生质体的完全被灭活，取步骤（2）中制备的B7216原生质体悬浮液5ml置于小试管，在15W紫外灯下照射25min，垂直照射距离为30cm，使B7216原生质体的完全被灭活；

取灭活的两亲株原生质体各2ml混合,4000rpm离心15min，弃上清液，再向沉淀液中加入40%（w/v）PEG6000(在SMMD高渗液中加入40%的PEG6000，pH=7.0，用于原生质体的融合，)的SMMD溶液(SMM缓冲液中加DNA酶5ug/mL，临时配制备用，在原生质体的融合过程中排除亲本的转化，)4ml与0.4ml的新生磷酸钙溶液混合均匀，37℃水浴保温10min得到融合的原生质体，

（4）融合子的再生与传代培养

取步骤（3）中融合后的原生质体用SMM高渗缓冲液将融合液稀释10倍，取0.1ml涂布于高渗基本再生培养基上，置于30℃恒温箱中培养3天，得到了17个融合子，将获得的17个融合子（简称为TLB1，TLB2，TLB3…………TLB17，）用牙签点接于完全培养基平板上，放于30℃恒温箱中培养24h后再影印到再生培养基平板上，传代10次，镜检后用试管斜面保存；

（5）融合子的初筛

初筛采用平板拮抗试验测定17个融合子对辣椒疫霉病和黄瓜枯萎病的抑菌作用，平板拮抗采用菌块对峙培养法对已纯化的17株内生细菌融合子进行筛选，初步选出TLB1，TLB2和TLB15三个菌株与亲本的防病效果相当；

（6）融合子的复筛

复筛采用镜检晶体（因为晶体关系到融合菌株是否具有杀虫作用）及对小菜蛾的杀虫试验，显微镜下观察到只有TLB15产生晶体，且晶体量变少，不及亲本B7216的晶体量，采用浸叶法测定生防菌株对小菜蛾的室内毒力测定，根据杀虫试验，复筛最后选出TLB15为稳定融合子。

4.如权利要求3所述的杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的构建方法,其特征在于所述步骤(2）中，B7216最合适的酶解浓度为1.0mg/ml，酶解时间为50min;TL2最合适的酶解浓度为1.25mg/ml, 酶解时间为50min。

5.如权利要求3所述的杀虫防病促生长的工程菌株TLB15及其构建方法,其特征在于所述步骤(3）中，TL2原生质体热灭活的时间为35min，B7216原生质体热灭活时间的25min。

6.如权利要求1所述杀虫防病促生长的TLB15的应用，其特征在于工程菌株TLB15经固态发酵后，经加工制得用于农业病、虫害生物防治的可湿性粉剂。

7.如权利要求1所述杀虫防病促生长的工程菌株TLB15的应用，其特征在于用于防治小菜蛾、黄瓜枯萎病、辣椒疫霉病及促进辣椒和黄瓜的生长。

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