CN1034757A - 合成蛋白质的表达载体和用于构建这种载体的质粒复制子及顺序暗盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表达蛋白质,尤其是真核生物蛋白质
的表达载体,还涉及可用于构建这种载体的质粒复制
子和顺序盒。所述粒复制子可以将多基因导入表达
载体中。本发明尤其涉及改进的表达载体,它们可用
于表达选自昆虫和昆虫细胞的蛋白质,还提供了构建
这种表达载体及通过感染昆虫而生产所需蛋白质的
方法。
Description
本发明涉及表达蛋白质,尤其是真核生物蛋白质的表达载体,以及用于构建这种载体的质粒复制子和顺序暗盒。本发明特别涉及可用于表达选择之昆虫和昆虫细胞蛋白质的改良的表达载体。
为了解决分子生物学中某些更具挑战性的课题,例如合成涉及多种蛋白质的产品,研究参予异源性蛋白质-蛋白质相互作用的因子,以及合成涉及连续酶促过程的产物,而需要有能够同时产生几种基因产物的新的表达系统(即所谓“多基因表达”),包括那些能以不同的预期水平重复生产不同蛋白质的表达系统。
这一点尤其适用于乙型肝炎表面及核心抗原。这就是说,如能同时生产乙型肝炎表面和核心抗原,将会特别有利于生产乙型肝炎的诊断试剂及疫苗。乙型肝炎是一种传播于整个世界的重要疾病。受感染者可能只经历急性感染期,或者可能发展成肝硬化、肝细胞癌变、慢性活动性乙型肝炎、慢性迁延性乙型肝炎、肝小叶性乙型肝炎等长期感染。世界上某些地区,尤其是(但不仅限于)东亚和非洲,持续性感染可能占人口总数的15%,而这些病人中死亡人数可多达40%。据统计,全世界有3亿人是该疾病的病毒携带者(即受肝炎病毒的持续性感染者)。得自血浆和rDNA的含HBsAg制剂已被用于接种人体以抵抗这种疾病。
当试图生产新的构建物以在单一表达载体内组合进编码不同蛋白质的基因时,经常遇到这样一个困难,即很难选择既含有功能形式的所需基因,又能使基因产物以预定数量进行表达的重组实体。此外,所获得的构建物可能在遗传上是不稳定的,即自然发生的重组过程可能导致一个或多个被引入的基团从载体或用于产生它们的质粒复制子中丢失。
业已描述了利用得自苜蓿银蚊夜蛾(Autographia californica)核多角体病毒的表达载体生产真核生物蛋白质的方法(见Smith等人“Modification and Secretion of Human Interleukin -2 Produced in Insect Cellsby a Baculovirus Expression Vector”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82NO.24(1985)8404-8408和Matsuura等人“Baculovirus Expression Vectors:The Requirement for High Level Expression of Proteins,Including Glycoproteins”,J.Gen.Virol.(1987)68,1233-1250)。但在现有的棒状病毒表达体系中,还没有办法能够使一个以上的基因产物以可重复的方式得以同时表达。另外,现有的表达载体还缺乏天然病毒的感染能力。据信这是由于天然病毒在其感染晚期产生由蛋白质即多角体蛋白(Polyhedrin)(其为由天然病毒基因组编码的)形成的所谓内含体之故。为了在棒状病毒表达体系中表达所需蛋白质而设计的重组表达载体,一直是为了试图生产人们所期望的多角体蛋白。表达载体很难以内含体的形式产生-而这一形式已知对昆虫幼虫具有特殊感染力。
Chakrabarti等人在“新的牛痘病毒表达载体”一文(Vaccines 86,Publn Cold Spring Harbor Laboratory and Chem Abst.105:166241r,1986)中描述了牛痘系统中的共表达载体,其可共表达大肠杆菌的β-Gal基因和第二外源基因。β-Gal基因的表达是用于筛选重组的牛痘病毒。但是并没有说明可重复表达多种真核生物蛋白质的方法。
本发明提供了质粒复制子、顺序暗盒及表达载体,它们避免了或基本上去除了现有技术中的若干缺陷。
现已发展了能够制得外源基因产物以及多角体蛋白的特殊的多表达载体。如果这种重组病毒被吸留,则它们在对其亲代病毒具有受纳性的毛虫宿主中将具有高度感染性,并能以一种廉价的方式生产外源性基因产物。还发展了由一个重组病毒制造两种外源性基因产物(如HBcAg和HBsAg)的多表达载体,以及制造HBsAg的吸留的重组病毒和高水平制造HBcAg或HBpcAg的单表达载体。
根据本发明的一个方面,提供了用于将多个基因引入一个表达载体内的质粒复制子,其包括下述的双链DNA:
(a)使复制子能在细菌宿主中繁殖的一个或多个顺序;
(b)经修饰过的第一和第二顺序,它们能使位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序引入表达载体中,以及
(c)位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序。
质粒复制子的特征在于其插入顺序包括第一和第二多肽表达顺序(PES),其中每个PES包括:(ⅰ)一个转录启动子;(ⅱ)一个单一的限制性位点,用以将固有或外来基因引入表达载体中以及(ⅲ)一个转录终止位点。就将固有或外来基因导入表达载体来说,最好每个PES含有一个不同的单一限制性位点。
下文所说的“PES”是指“多肽表达顺序”。
为了减少所需之导入基因产生重组消除的可能性,第一和第二PES最好是在不同的DNA链上彼此以相反意义排列。
另外,第一和第二PES也可在同一DNA链上以相同的意义排列。对于这样的构建物,最好是在两个PES之间存在一个选择基因或表达载体的一种基本功能基因,以选择由于(例如)天然重组而消除了任一个PES的衍生物。
为了制备将多基因引入能转染敏感昆虫或昆虫细胞之表达载体的质粒复制子,可在PES的位点(ⅱ)导入表达载体的固有或外来基因。所产生的“装载”的质粒复制子,即装载适于引入表达载体之预期基因的质粒复制子构成了本发明的另一个方面。这种“装载”的质粒复制子包含有下列的双链DNA:
(a)能使复制子在细菌宿主中增殖的一个或多个顺序,
(b)经过修剪的第一和第二顺序,可使位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序引入表达载体中,以及
(c)位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序。
特征在于该插入顺序包括第一和第二多肽表达顺序(PES),其中每个PES包括(ⅰ)一个转录启动子,(ⅱ)一个表达载体的固有或外源基因,以及(ⅲ)一个转录终止位点。转录终止位点对于表达载体可以是固有的或外来的。
本发明的质粒复制子可用来构建能够转染敏感昆虫细胞的载体。例如得自病毒的载体,其野生型或衍生物即可感染这种细胞。在该例子中,存在于PES中的一个或多个基因可编码正常情况下在野生型病毒感染细胞期间表达的病毒蛋白质。
可供选择的另一个可能是,引入至少一个PES中的基因可能代表一种可选择的外源蛋白质或载体的正常基因产物。
这样,一个或多个可选择的或正常的基因产物的生产即可用来作为检测所需重组质粒复制子或表达载体的标记。另外,PES中所述启动子至少有一个可能是在野生型病毒感染细胞时正常表达的病毒蛋白质的启动子。
本发明的质粒复制子(装载的和未装载的)可由所谓“顺序暗盒”构建,这些顺序暗盒本身构成了本发明的另一个方面。这些顺序暗盒包括含有插入顺序的重组DNA分子,而插入顺序包括第一和第二多肽表达顺序(PES),其中各PES正如上面所定义的,可为装载的或未装载的质粒复制子。且侧接了与表达载体同源的臂顺序,这样当被插入载体中后便不会丢失表达载体的基本功能基因。
在第一个优选的顺序暗盒构建物中,臂顺序与载体基因组的顺序同源,该顺序的安排能使插入顺序被引入而不丢失载体的DNA顺序。
在第二个优选的构建物中,臂顺序与载体基因组的顺序同源,该顺序的安排能使插入顺序引入后由顺序暗盒的插入顺序置换载体中的非必需DNA顺序。
在第三个优选的构建物中,臂顺序与载体基因组的顺序同源,该顺序的安排能使插入顺序被引入后置换载体基因组的基因间区或非调节区。
本发明的顺序暗盒可以成组地构建,各组中的每个顺序暗盒的同源区可与载体基因组的不同区域同源,从而使得许多成对的PES能被引入载体基因组内,并且每一对都有不同的定位。
适于转染昆虫细胞的表达载体可由上述的质粒复制子产生。这些表达载体本身是新的,并构成了本发明的另一个方面。这些表达载体具有这样一个被接受的插段,它能在细胞中指导至少一种通常不由该细胞之核DNA编码的多肽的合成。所述插段包括在所述第一和第二顺序之间含有插入顺序的双链DNA。表达载体的特征在于,插入顺序包括第一和第二多肽表达顺序(PES),每个PES包括(ⅰ)一个转录启动子,(ⅱ)一个表达载体的固有或外来基因以及(ⅲ)一个转录终止位点。转录终止位点对于表达载体来说可以是固有的或外来的。
这些表达载体可由一种病毒实体产生,该病毒的野生型能感染昆虫细胞。在这个例子中,所述的结构基因之一可以有利地编码一种在野生型病毒感染细胞时正常表达的病毒蛋白质。在这些优选的表达载体中,可至少有一个所述的启动子是在野生型病毒感染细胞时正常表达之病毒蛋白的启动子。
本发明来自病毒的表达载体的具体实施是其中病毒实体为棒状病毒的那些表达载体。在这个例子中,所述结构基因之一的密码能够方便地编码AcNPV多角体蛋白,且所述启动子中至少有一个是苜蓿银蚊夜蛾核多菌体病毒的多角体蛋白基因的启动子。
本发明的重组质粒复制子和表达载体可仅包括一对所述的PES或者可包括许多这样的PES对。因此,它们可以仅由上述的单一顺序暗盒产生,或可由许多这种顺序暗盒产生。
在后一种情况下,在PES之间最好有一个或多个带有调控元件的基本功能性基因或可选择的基因,这些基本或选择基因的顺序有别于PES的顺序。通过这种方式构建质粒复制子和表达载体,有可能降低或最大限度地减少由于重组而去除基因的可能性。
本文所提的质粒复制子,一般可以是能在有或没有引入基因的细菌宿主中复制的质粒。任何被引入基因均可包括能在细菌宿主中表达的基因,例如在细菌质粒启动子调控下的β-半乳糖苷酶,其可允许选择细菌中的重组质粒;还包括只能在真核生物宿主中表达的基因,例如在真核生物(如病毒)启动子调控下的β-半乳糖苷酶(从而以其在真核宿主中选择重组病毒),或者包括编码真核蛋白质的基因。
本发明质粒复制子/表达载体系统的一个特殊实例是基于昆虫苜蓿银蚊夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白基因启动子的系统,某为一种棒状病毒,并已越来越多地被用作合成大量真核基因产物的表达载体(Smith等人,1983;Pennock等人,1984;Miyamofo等人,1985;Smith等人,1985;Matsuura等人,1986,1987;Possee,1986;Kuroda等人,1986;Estes等人,1987;Inumaru和Roy,1987;Overton等人,1987)。在该系统中,作为表达的基础是使用了AcNPV多角体蛋白启动子,它是野生型AcNPV感染中导致多角体蛋白合成的主要晚期启动子,而此蛋白则装配形成被感染细胞核中吸留病毒粒子的可见的多角形内含体。
在合适的质粒复制子中用外源基因取代多角体蛋白基因顺序,然后用所得质粒在感染性AcNPV DNA存在下转染草地粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞,导致表达外源基因产物而不是多角体蛋白之重组载体(病毒)的产生(Smith,1983)。可借助其多角体蛋白阴性表型或其他性质(如那些因存在外源基因而呈现的性质)来选择该重组体。
尽管已发现外源基因产物的表达水平有所不同,但最近的工作则确证该系统中外源基因的表达水平与多角体蛋白基因转录起始和转译起始位点之间DNA顺序的各元件直接相关,而且只有存在所有这些顺序元件时才能得到高水平表达(Matsuura等,1987)。这些研究已经导致了一种新质粒复制子即pAcYM1的构建,该复制子已被用生产高水平表达淋巴细胞绒毛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis,LCMV)双义s RNA(ambisenses RNA)之基因产物的重组病毒(Romanowski等,1985;即LCMV核衣壳蛋白N或LCMV糖蛋白前体,GPC)。各种重组病毒合成这些蛋白质的水平接近于野生型AcNPV感染中制造多角体蛋白的水平(即占总细胞或昆虫蛋白质的大约25-50%)。
已使用AcNPV棒状病毒表达系统构建了本发明的多表达载体的实例。利用这些系统,我们复制了AcNPV多角体蛋白启动子及其相关的转录终止信号,得到质粒复制子pAcVC2,它含有均处于分开组织之多角体蛋白启动子调控之下的AcNPV多角体蛋白基因和LCMV-N蛋白基因。由于已知两种基因产物都能在单独表达时进行高水平生产(Matsuura等,1987),所以使用pAcVC2质粒分离重组病毒则使我们得以估计棒状病毒系统利用重复的多菌体蛋白启动子排列以同时生产两种不同基因产物的能力。一旦确立了这一研究的可行性,即可产生以一般性目的AcNPV为基础的质粒复制子,这类复制子可含有两个PES顺序暗盒,且有适于插入两个基因的位点。为使重组消除作用减至最低限度,可使两个PES以非交迭顺序的方式相对排列(即作为分开的DNA链)。但本发明并不排除串联组织的可能性(即在同一条链上有或没有插入顺序)。
可用这种通用的目的质粒复制子将基因对插入病毒的表达载体中,将这类基因对或外加的基因对在多个位点插入病毒基因组中,即将相应的暗盒掺入含有AcNPV基因组其他部分之质粒复制子的基因间区域(或非必要基因)中,以进行多基因表达。
下面是一个更为详细的实例,其中是将苜蓿银蚊夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白基因启动子的拷贝,以及相联系之淋巴细胞绒毛膜膜炎病毒N蛋白(LCMV-N)和相关多角体蛋白转录终止信号,一起克隆到质粒(该质粒代表用EcoRI切割AcNPV基因组所产生的片段)的单一EcoRV位点中。克隆位点在所需重组质粒的固有AcNPV多菌体蛋白基因的上游,并选择LCMV-N和多菌体蛋白基因相互对立定向的质粒,以使由天然重组过程导致的基因消除作用降至最低。
因此,产生的重组质粒pAcVC2同时具有正常的多角体蛋白基因和LCMV-N基因,而且它们都有自身多菌体蛋白转录机构的拷贝。
用pAcVC2质粒和感染性多角体蛋白阴性AcNPV DNA一起共转柴草粘虫细胞,致使分离出能制备多角体蛋白以及LCMV-N蛋白的重组病毒。电镜观察证实,在重组病毒感染的细胞核中存在有吸留的病毒颗粒,在相同细胞的胞质内聚集有LCMV-N蛋白。与多角体蛋白阴性AcNPV重组体不同的是,吸留的重组体是毛虫粉蚊夜蛾(Trichoplusia ni)的强感染因子。
以类似的方法,已将编码乙肝表面和核心抗原的DNA顺序克隆到了AcNPV基因组之EcoRI衍生片段的单一EcoRV和Acc11位点中。所产生的重组质粒含有(ⅰ)多角体蛋白基因和乙肝表面抗原基因以及(ⅱ)乙肝表面抗原基因和乙肝核心抗原基因。
用这些质粒与感染性多角体蛋白阴性AcNPV DNA一起共转染草地粘虫细胞,则能分离出制备(ⅰ)多角体蛋白和乙肝表面抗原以及(ⅱ)乙肝表面抗原和乙肝核心抗原的重组病毒。
实施例
下述实施例将更为详细地描述本发明之多表达载体的构建。
实施例1
(ⅰ)方法
A.含有LCMV-N和AcNPV多角体蛋白基因之质粒复制子pAcVC2的构建
制备最终含有两个在必需之调控顺序控制之下的基因产物的棒状病毒质粒复制子时,所选用的方法须使多角体蛋白启动子和转录终止顺序得以重复。已经限定了多菌体蛋白的mRNA分子的转录起始和终止位点,它们分别位于转录起始密码子上游的48核苷酸处和转录终止密码子下游的376核苷酸处(Howard等,1986)。由于转录终止于顺序型主AATAAA的下游(其为对应于正常真核生物多腺苷酸化信号的顺序,Birnstiel等,1985),故有人认为棒状病毒mRNA可被宿主的3′mRNA后加工机机裂解并多聚腺苷酸化(见Rohrmann,1986)。与此相反的是,尚未确定多菌体蛋白基因启动子活性所需要的确切顺序元件,但已鉴别出常挠隦NA聚合酶Ⅱ驱动的转录过程有关的DNA顺序元件系存在于转译起始位点上游的顺序中。因此,我们认为,为了重复合成mRNA及将外源基因置于多角体蛋白转录机构之调控下所需要的信息,而需要一种含右距已知的转录起始位点上游并包括复制子终止信号之顺序下游一定距离的限制性片段。为此目的,利用了一种含有LCMV-N基因的现有质粒复制子(pAcYM1.YM1,Matsuura等,1987)作为“基材”,因该复制子能够产生高水平产生LCMV-N蛋白的重组病毒。用限制性内切酶AccⅡ处理之,并以标准程序(Maniatis等,1982)分离含有与LCMV-N基因结合之相关多菌体蛋白转录起始和终止机构的3052核苷酸片段(图1)。在回收了应当包括多角体蛋白基因启动子和终止密码子顺序的DNA后,需要一个含有真正多角体蛋白基因的质粒。选择出PUC8中的EcoRI “I”片段(Possee,1986)。最初,是将3052碱基对的片段置于多角体蛋白基因的3′非转译区内,并使之与多角体蛋白编码顺序的定向相同,因为我们实验室以前曾利用AcNPV基因组的这一区域插入一个合成的寡核苷酸,以将具有遗传标记的棒状病毒释放到环境中去(Bishop,1986)。然后,在此位置含有AccⅡ片段的质粒并不产生重组病毒。虽然尚不知道出现这一结果的原因,但这种情况可能是由于同源顺序的重组过程使得插入之基因缺失。因此作为一种可供选择的方法,我们在多角体蛋白基因5′上游区域中选择了插入位点。尽管尚不知道关于高水平多角体蛋白启动子活性之重要顺序元件的生化数据,但还是选择了位于AcNPV EcoRI “1”片段中多角体蛋白ATG上游约100核苷酸处之非编码区内的单一EcoRV限制性内切酶位点来插入含有LCMV-N基因之3052核苷酸的AccⅡ片段。由于插入过程涉及平头末端连接,因此AccⅡ和EcoRV位点在这一过程中被破坏。在连接和转化之后,通过限制性内切酶消化分析所得到的重组质粒。选择含有重复之启动子和LCMV-N基因编码区的克隆,但所述基因应与原有的多角体蛋白基因的定向相反(见图1)。这种构型将限制同源顺序遗传重组及从子代病毒中切除某一目的基因的可能性。图1中显示了所得定名为pAcVC2的质粒复制子的特征并显示其具有与多角体蛋白转录机构结合在一起的LCMV-N和多角体蛋白基因。
B.含有LCMV-N和AcNPV多角体蛋白基因之重组棒状病毒的制备
在可得到的重组多角体蛋白阳性辅助病毒DNA的存在下,使质粒复制子pAcVC2共转染到草地粘虫细胞中。转染之后,通过选择显示多角体蛋白阳性表型(频率均为0.1-1%)的子代病毒空斑而从感染细胞中分离出假定的重组病毒(如VC2)。辅助病毒DNA(YM1.BTV-10.2)含有代表蓝舌病毒(Bluetongue virus)血清型10,RNA片段2(P.Roy赠送,参见Inumaru和Roy,1987)之主要中和抗原VP2的核苷酸插段,其在以前已利用载体pAcYM1被插入到多角体蛋白阴性病毒内。选择这样的辅助病毒DNA的原因有二:一是该病毒为多角体蛋白阴性的,所以以多角体蛋白阴性表型的再获得为依据,很容易以YM1。BTV-10.2病毒DNA和含有多角体蛋白基因之质粒复制子参予的共转染中选择出新的重组体;第二个原因是,与以pAcRP为基础的质粒不同,或者说与Smith和Summers(1983)制得的质粒不同,辅助病毒DNA不含有多角体蛋白的编码顺序(见Matsuura等,1987),从而排除了在多角体蛋白编码区内重组的可能性。经连续三次空斑纯化后得到VC2病毒的储备物并用来进行多项生化分析。
c.对重组病毒感染之细胞的免疫荧光分析
用pAcVC2衍生的重组病毒VC2感染草地粘虫细胞并准备用LCMV-N单克隆抗体(M.J.Buchmeier赠送,参见Buchmeier等,1981)进行免疫荧光分析。用YM1.YN1病毒(只含有LCMV-N编码区)感染的细胞或野生型AcNPV作为对照。图2所示结果证明,VC2感染的细胞中LCMV-N蛋白的表达(图2e)与只表达LCMV-N蛋白的重组棒状病毒(YM1,YNYN1,图2C)所观察到的结果差不多。正如所期望的,用野生型AcNPV感染的细胞未显示出阳性免疫荧光(图2a)。
除了紫外显微镜检查外,还使用了光学显微镜检查病毒感染的细胞,结果发现在野生型AcNPV感染的细胞中(图2b)以及VC2重组病毒感染的细胞中(图2g)也都存在有多角形包含体。所有用VC2病毒感染的细胞均显示有LCMV-N免疫荧光及多角形内含体(比较图2e和2g)。在图2f给出的杂合紫外/可见光显微照片中可清楚地观察到这一现象。正如以前证明的那样(Matsuura等,1987),用含有LCMV-N基因而不含多角体蛋白基因的重组病毒(即病毒YM1.YN1)感染的细胞虽然可见到标记颗粒(图2d),但它们并未显示出多角形内含体。总而言之,这些资料清楚地表明,用VC2病毒感染的细胞可同时表达LCMV-N蛋白和多角体蛋白。
D.重组的VC2病毒DNA内LCMV-N蛋白和AcNPV多角体蛋白之基因的定位
虽然图2所示的免疫荧光数据表明LCMV-N和多角体蛋白的基因是在VC2病毒感染的细胞中表达的,但必须证实,基因在其转染过程中是以所需的定向(如在pAcVC2中那样,见图1)而不是随机掺入病毒基因组中的。用限制性内切酶AccⅡ消化重组质粒pAcVC2,可以方便地得到一个5080核苷酸片段,它含有LCMV-N基因和多角体蛋白基因二者。因此,可将该酶用于重组的VC2病毒进行Southern印迹分析。用AccⅡ消化由pAcVC2质粒或纯化的VC2、或AcNPV、病毒颗粒得到的DNA制备物并进行琼脂糖凝胶电泳。利用对AcNPV多角体蛋白或LCMV-N(Matsuura等,1987)基因之编码区特异的放射性标记探针对这些制剂作Southern印迹分析,结果示于图3中。这些资料表明,多角体蛋白和LCMV-N基因特异性探针都与AccⅡ消化的VC2病毒的DNA中的5082核苷酸片段杂交,且该片段与用两探针在质粒复制子pAcVC2中检测到的AccⅡ片段有关。正如所预期的,多角体蛋白探针与野生型AcNPV DNA中包括多角体蛋白基因的2028核苷酸AccⅡ片段杂交,而LCMV-N探针不与任何AcNPV DNA顺序杂交。此结果表明,LCMV和多角体蛋白编码顺序都被掺入到了VC2病毒基因组的合适区域内。
E.VC2病毒中LCMV-N和多角体蛋白基因产物的表达
通过Northern分析来检测重组VC2病毒感染的细胞中是否存在LCMV-N和多角体蛋白的mRNA分子。用AcNPV和YM1.YM1重组病毒(Matsuura等,1987)感染的草地粘虫细胞作为对照。感染24小时后提取细胞的核酸,在寡聚(dT)纤维素柱上层析,以选择带有多腺苷酸顺序的RNA。用羟基甲汞处理poly(A+)和poly(A-)RNA制备物并再次在羟基甲汞存在下经琼脂糖凝胶电泳按大小分离之。转移RNA印迹并固定到Hybond-N上,然后用代表LCMV-N或AcNPV多角体蛋白基因的缺口转译的DNA检测。此分析的结果示于图4中。多角体蛋白探针可与VC2和AcNPV感染的细胞中的1.2Kb mRNA分子杂交,但不与YM1.YN1重组病毒感染的细胞中之任何mRNA分子杂交。与之相反,LCMV-N探针则可与VC2和AcNPV感染的细胞中的长约2.25Kb的mRNA分子杂交。如果其中使用了真正的多角体蛋白转录机构的话,则此mRNA分子的大小相当于预测之LCMV-N mRNA的长度。这些mRNA的大小分析进一步证实并提供了独立的证据,即证明LCMV-N和多角体蛋白基因处于不同的转录调控之下。正如所期望的,多角体蛋白和LCMV-N的mRNA分子均不存在于poly(A-)RNA的泳道中(资料未示出)。就这些分析所能确证的结果而言,图4给出的数据表明VC2病毒感染的细胞中的多角体蛋白和LCMV-NmRNA的水平基本上与单独使用AcNPV或YM1.YN1病毒感染的细胞差不多。
为了测定VC2病毒感染之草地粘虫细胞中合成的LCMV-N蛋白和多角体蛋白的相对量,在感染后的不同时间对细胞进行脉冲标记,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析放射性标记的蛋白质。图5a给出了感染后24和48小时检测用〔35S〕甲硫氨酸脉冲标记的VC2病毒感染之细胞的结果。从中可以看出,在VC2病毒感染的细胞中,有两种主要的〔35S〕标记的蛋白产物。其大小相当于62×103道尔顿和33×103道尔顿。与用多角体蛋白阴性YM1.YN1病毒或用AcNPV病毒感染的昆虫细胞中合成的〔35S〕标记的蛋白质相比,VC2指导合成的蛋白质产物分别相当于LCMV-N蛋白(62×103道尔顿)和AcNPV多角体蛋白(33×103道尔顿)。经凝胶染色分析(图6b)进一步证实了脉冲标记蛋白质分析中所显示之LCMV-N和多角体蛋白基因表达的相对水平。这一结果还提供了这样的证据,即两种蛋白都在VC2病毒感染的细胞中有相当水平的积聚。
如上所述,重组的VC2病毒中的LCMV-N基因,相对于多角体蛋白基因的正常定位来说,系定位于其上游,但方向相反。因此,值得注意的是,VC2病毒中LCMV-N的表达水平与只表达LCMV-N的重组棒状病毒YM1.YN1没有显著差异(图5和6)。重组VC2病毒感染的细胞中多角体蛋白的表达水平在摩尔数上可与所得的LCMV-N蛋白相比较(图5和6)。
F.对VC2病毒感染之细胞的电镜分析
以前已经注意到(Matsuura等,1987),在表达大量LCMV-N蛋白的昆虫细胞的电镜照片中,通过使用LCMV-N单克隆抗体观察致密的细胞荧光,发现在胞质中含有多个内含体,此被认为是LCMV-N蛋白质聚集所致。图7显示了对重组病毒VC2感染的细胞进行类似分析的结果。与未感染的细胞(图7a)、AcNPV(图7b)或YM1.YN1(图7c)感染的细胞相比较,VC病毒感染具有两个明显特点:第一,与YM1.YN1病毒感染的细胞相同,LCMV-N蛋白在胞质内含体中以聚集形式存在;第二,与野生型AcNPV感染相同,核中含有带吸留之病毒颗粒(图7e)的多菌体(图7d)。
G.T.ni幼虫中LCMV-N蛋白和多角体蛋白的表达
由于用VC2病毒感染的草地粘虫细胞的电镜照片揭示了多角体内吸留有VC2病毒颗粒,故回收后者并用以感染第三令期的T.ni毛虫。为了比较,还使用由VC2病毒感染的草地粘虫细胞之上清液中制得的细胞释放的病毒(滴度为8×107pfu/ml)来感染第三令期T.ni毛虫。于感染4天之后及幼虫死亡之前,从各感染组(每组40个毛虫)中随机选择5个毛虫,提取其蛋白质并经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离之。图8给出了这些毛虫提取物的蛋白带染色分析的结果。在接受细胞释放病毒的5个毛虫中(毛虫平均体重97mg),只有第3号毛虫表现出感染并同时产生了少量的LCMV-N蛋白。与此相反,用VC2衍生之多角形内含体感染的毛虫要小得多(平均体重33mg),而且所有5个毛虫都表现出强烈的病毒感染,同时产生大量的LCMV-N和多角体蛋白。通过与幼虫提取物平行电泳的已知量牛血清白蛋白相比较,估计每个幼虫至少含有0.1mg LCMV-N蛋白。
(ⅱ)本实施例中使用的材料和方法
(a)病毒和细胞
按照Brown和Faulkner(1977)所述的方法,在含有10%小牛血清的培养基中培养融合单层的草地粘虫细胞内的AcNPV和重组病毒储备物并检测之。
(b)DNA操作和DNA克隆的构建
质粒DNA的操作基本上按照Maniatis及其同事(1982)总结的方法进行。限制性酶、T4DNA连接酶和DNA聚合酶的Klenow大片段由英国的Amersham公司购得,牛小肠碱性磷酸酶得自Boehringer Mannheim Biochemicals公司(Mannheim,联帮德国)。
(c)pAcVC2的构建
用AccⅡ完全消化含有完整LCMV-N基因的质粒复制子pAcYM1.YN1(Matsuura等,1987;Possee,1986),通过在0.8%琼脂糖上的凝胶电泳分离3052核苷酸片段,该片段含有LCMV-N基因及其相连的多角体蛋白启动子和转录终止顺序。将AccⅡ片段连接到EcoRV消化并脱磷酸的质粒pAcEcoRI“I”中,其含有在修饰的pUC8质粒中的7.3Kb AcNPV片段(Possee,1986)。转化并用缺口转译的LCMV-NDNA筛选后,将所得质粒(图1,pAcVC2)通过限制性酶和顺序分析确定其特征(Chen和Seeburg,1985)。选择具有图1所示之pAcVC2结构的质粒以产生重组病毒VC2。
(d)重组病毒VC2的转染和选择
利用改进的Smith等人所述的方法(1983),用质粒pAcVC2 DNA和代表多角体蛋白阴性病毒之DNA的混合物转染草地粘虫细胞,所述病毒DNA来自含有蓝舌病毒血清型10片段22DNA的pAcYM1(YM1.BTV-10.2,由美国阿拉巴马大学伯明翰分校的P.Roy教授赠送,见Inumaru和Roy,1987)。使用Smith和Summers(1978)的方法纯化YM1.BTV-10.2DNA(1μg),与不同浓度的质粒DNA混合(25-100μg),并用Hepes缓冲的盐溶液(20mM Hepes,1mM Na3HPO4,5mM KCl,140mM NaCl,10mM葡萄糖,pH7.05)调到950μl。用50μl 2.5M CaCl沉淀后,将DNA接种到35mm组织培养皿中的1×106个单层草地粘虫细胞上并于室温下培养1小时。弃去上清液,加入1.5ml含有10%小牛血清的培养基。28℃下保温3天后,收集上清液并测定融合的草地粘虫单层细胞的滴度。回收具有吸留体(病毒多角形体,由透射光学显微镜可检出之)的空斑,再在草地粘虫细胞上滴定以得到重组的多角体蛋白阳性病毒。经三次纯化空斑之后,得到高滴度的重组病毒储备物(VC2,107-108pfu/ml)。
(e)病毒和细胞核酸的提取及定性
按前述方法(Matsuura等,1986)制备病毒DNA和感染细胞的mRNA。为进蠸outhern分析,用AccⅡ完全消化病毒DNA,在0.8%琼脂糖(BRL,Madison,W.I.)凝胶上电泳分离消化产物,然后将印迹转移到Hybond-N上(英国Amersham公司)。干燥后用紫外光照射膜片5分钟,然后与得自克隆Y-1-A(Matsuura等,1986)的缺口转译的LCMV-WE DNA或缺口转译的AcNPV多角体蛋白DNA(英国牛津病毒学研究所R.D.Possee博士赠送)杂交(Southern,1975)。洗涤膜片后进行放射性自显影。用10mM羟基甲汞处理细胞mRNA制剂(Bailey和Davidson,1976),用含有甲基汞的1%琼脂糖凝胶进行电泳分离,然后将印迹转移到Hybond-N上。印迹转移(Alwine等,1977)后,干燥膜片并用紫外光照射5分钟,然后如Denhardt(1966)所述使之与代表多角体蛋白基因和LCMV-N基因之32P标记的缺口转译产物杂交。洗涤膜片后进行放射自显影。
(f)蛋白质分析
在35mm组织培养皿中以10pfu/细胞之感染复数用病毒感染草地粘虫细胞,然后使用不含甲硫氨酸的培养基在指定的时间以100μCi〔35S〕-甲硫氨酸(Amersham,1131Ci/mmol)标记1小时。标记之前,使细胞在不含甲硫氨酸的培养基中保温1小时,以降低细胞内的前体库。标记期间过后,去除培养基,将细胞单层用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,用100μl RIPA缓冲液(1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.5M NaCl,0.05M Tris-HCl,0.01M EDTA,0.1%SDS,pH7.4)溶解细胞。如Laemmli(1970)所述,将蛋白样品的等分试样在解离缓冲液(2.3%SDS,10%甘油,5%β-巯基乙醇,62.5mM Tris-HCl,0.01%溴酚兰,pH6.8)中煮沸5分钟并在10%聚丙烯酰胺不连续凝胶中电泳。电泳之后,在乙酸(10%,V/V)中固定凝胶并用Amplify(Amersham,英国)浸渍,然后于-70℃下对X光胶片曝光。另外,凝胶亦可用Kenacid Blue(Overton等,1987)染色。
(g)用重组病毒VC2感染T.ni
用细胞释放的非吸留VC2病毒(经差速离心纯化,8×104p.f.u/毛虫)或VC2多角形内含体(以相同方法纯化,4×104多角形内含体/毛虫)经口服感染生长于半合成培养基(Hoffman等,1966)上的第三令期T.ni毛虫。保温4天后收获毛虫,称重后选择随机个体在含有0.02%二乙基二硫氨基甲酸钠的PBS(200μl)中制成匀浆。从匀浆中制备等分样品(5μl)进行凝胶电泳分析。
(h)重组病毒感染之细胞的免疫荧光分析
用VC2重组病毒感染草地粘虫细胞,感染后36小时利用LCMV-N单克隆抗体进行免疫芝光分析(Buchmeier等,1981)。用YM1.YN1病毒(Matsuura等,1987;只含有LCMV-N编码区)或野生型AcNPV感染的草地粘虫细胞作为对照。为了进行免疫荧光分析,将36小时前以10pfu/细胞之感染复数感染的草地粘虫细胞等分试样(5μl)在载波片上点样并用冷丙酮固定10分钟。用PBS洗细胞,于37℃下与10μl32倍稀释的LCMV-N特异性单克隆抗体(M.Buchmeier博士赠送,Scripps Clinic and Research Institute,La Jolla,Ca.,USA)保温1小时。用PBS洗玻片,于37℃下用与猪抗小鼠IgG抗体偶联的荧光素对细胞染色1小时,再次用PBS洗涤并检测荧光。
(j)pAcVC3的构建
用限制性酶BamHI消化质粒pAcYM1,在所有四种脱氧核苷三磷酸存在下用DNA聚合酶的Klenow片段修复3′端。然后用碱性磷酸酶处理使DNA脱磷酸,并与BglⅡ人工接头(S′GAAGATCTTC3′)连接。用BglⅡ消化后再连接,则回收到新质粒pAcYM2,该质粒含有单一的BglⅡ位点以代替原来的BamHI位点(图8)。
为了产生能插入两个外源基因,且每个都在其自身的多角体蛋白启动子拷贝调控下的质粒,将用AccⅡ消化pAcYM2得到的1.3Kb DNA片段克隆到预先用EcoRV消化的质粒pAcYM1中(图8)。连接后不再产生在这些消化过程中使用的AccⅡ或EcoRV位点。回收的片段在新的重组质粒中有两种可能的定向,从中选择出多角体蛋白转录起始位点彼此相邻位反向排列的质粒,即pAcVC3(图8)。在这种定向中,两个假设的转录终止信号AATAAA被BglⅡ和BamHI位点分离开(图8)。质粒pAcVC3的构建可使一个外来基因能在BamHI位点插入质粒中,另一个则插入Bg1Ⅱ位点。通过这种方式,每个基因都有自己的非交迭的多角体蛋白转录启动子和终止子顺序拷贝(即代表两个PES);蛟诓煌珼NA链上的定向,应当使由于重组过程而造成的基因切除之可能性降至最低。
(k)重组病毒VC4的制备
利用上述生产病毒VC2的程序,但使用含有Hantaan N蛋白(此蛋白相应于Hantaan S(小)RNA-Schmaljohn,C.S.;Jennings,G.B.;Hay,J.和Dalrymple,J.M.“Hataan病毒S-基因组片段的编码战略”;Virology 155:633-643,1986)之编码基因的现有质粒,从而制得重组病毒VC4。用该病毒感染下。ni毛虫,使得这些昆虫能够同时生产多角体蛋白和Hantaan蛋白。
利用类似技术,可产生能够同时表达多角体蛋白和乙型肝炎S和C蛋白的重组病毒。
实施例2
(ⅰ)方法
A.表达单基因之重组转移载体的构建
用StyⅠ和HinpⅠ分别从质粒pSCK102(C.-Y.Kang提供,University of Ottawa,Canada,其代表HB病毒的adw血清型)中切割两个片段,一是含有HB病毒C基因编码区的581碱基对的片段,一是含有前C和C基因编码区的1005碱基对的片段。各片段均用DNA聚合酶的Klenow片段修复,然后克隆到棒状病毒pAcYM1载体的BamHI位点中(Matsuura等,1987)。所产生的重组转移载体分别为pAcYM1KTc和pAcY1KTpc(图9)。HB病毒的完整S基因如下制备:用AccⅡ消化质粒pAcRP6-HBsYH14(Kang等,1987),连接到pAcYM1的BamHI位点中,然后用BamHI消化并将所得含有S基因之725碱基对的DNA片段插入到pAcYM1载体的BamHI位点中,以构建成重组的转移载体pAcYM1KTs(图10)。
B.表达双基因之重组转移载体的构建
用AccⅡ消化质粒pAcYM1KTs,将含有S基因及其相关多角体蛋白启动子和转录终止顺序的片段与质粒pAcYM1KTc之脱磷酸化的EcoRV消化产物连接,以产生双表达的重组转移载体pAcVCKTsc(图11),或与pAcYM1KTpc的EcoRV消化产物连接,以产生双表达载体pAcVCTspc(图11)。将同样的HBS基因片段插入AcNPV的7.3Kb EcoRI“I”片段中(在一种修饰过的PUC8质粒中,Possee,1986),产生重组的转移载体pAcVCKTs(图12)。
C.重组病毒的转染和选择
为了得到表达外来基因的重组病毒,基本上按照Overton及其同事(1987)所述的方法用感染性AcNPV DNA和代表个别重组转移载体的质粒DNA的混合物转染草地粘虫细胞。从与pAcYM1KTc质粒DNA的共转染过程中得到重组病毒YM1KTc,同样从pAcYM1KTpc得到重组体YM1KTpc,从pAcYM1KTs得到重组体YM1KTs,从pAcVCKTspc得到重组体VCKTspc,以及从pAcVCKTsc得到重组体VCKTsc。为了产生表达HBS抗原和AcNPV多角体蛋白二者的吸留的重组病毒,用质粒pAcVCKTs DNA和代表多角体蛋白阴性病毒之DNA的混合物转染草地粘虫细胞(所述的阴性病毒DNA得自于含有蓝舌病毒血清型10片段DNA2的pAcSI.10.2,参见Immumaru和Roy,1987)。回收含有可见吸留体的重组病毒(VCKTs)的空斑。
D.病毒DNA的提取和定性
依前已述及的方法(Overton等,1987)制备病毒DNA。按照Matsuura及其同事(1986)所述的方法用AccⅡ完全消化DNA样品并对消化产物作Southern印迹分析。
E.感染的细胞多肽的标记和分析
在35mm组织培养皿中以10pfu/细胞的感染复数用病毒感染草地粘虫细胞,在28℃下保温48小时。在指定的时间,用不含甲硫氨酸的培养基将细胞处理1小时,然后在同样培养基中用15μCi的〔35S〕-甲硫氨酸(Amersham International,1131 Ci/mmol)标记3小时。有时或可不标记细胞。将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,然后在150μl RIPA缓冲液(1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.5M NaCl,0.5M Tris-HCl,0.01M EDTA,0.1%SDS,pH7.4)中溶解之。按Laemmli(1970)所述方法将部分蛋白样品在解离缓冲液(2.3%SDS,10%甘油,5%β-巯基乙醇,62.5mM Tris-HCl,0.01%溴酚兰,pH6.8)中煮沸5分钟,然后在含有SDS的10-20%聚丙烯酰胺不连续凝胶中电泳(SDS-PAGE)。电泳之后,用乙酸(10%,V/V)固定凝胶并用Kanacid Blue染兰,然后于-70℃下对X光胶片曝光。
F.免疫印迹分析
在SDS-PAGE之后,以150mA经4小时将蛋白质电泳转移到硝酸纤维素滤膜上。将滤膜置于TBS(20mM Tris-HCl,pH7.4,0.15M NaCl,10%小牛血清)中于4℃下浸泡过夜。用TBS再洗涤一次后,于20℃在含有5%小牛血清和0.05%Tween20的TBS(TTBS)中将滤膜用免抗HBcAg血清处理1小时。进一步用TTBS洗涤后,用羊抗免疫球蛋白检测结合的抗体,其中所述的免疫球蛋白上偶联有碱性磷酸酶(Sigma)并以Fast Blue BB盐和β-萘基磷酸酯(Sigma)作为底物。
G.经梯度离心纯化HBcAg和HBsAg
用含有HBsAg基因的重组棒状病毒(YM1KTs)感染细胞并于感染后4或5天回收上清液。用60%硫酸铵沉淀以浓缩含有HBsAg的细胞培养物上清液。将沉淀物再悬浮于TNE(10mM Tris-HCl,50mM NaCl,0.1mM EDTA,pH7.4)中,加到溶于TNE缓冲液中之20-60%(W/W)蔗糖梯度上,用SW41Ti转子(Bechman)于4℃以150,000Xg离心15小时。离心之后分离梯度,通过RIA法(见上述)鉴定出含有HBsAg的峰值组分,合 峰值部分并离心(Ti50转子,100,000Xg,4℃15小时)沉淀之。将产物再悬浮于水中并用电镜检验样品。于感染4天后经超声处理或冻融三次以提取含HBcAg的重组病毒感染的细胞,离心产物以除去细胞碎片,使用42.1转子(Beckman)以106,000Xg将所得上清液通过30%蔗糖垫层离心16小时,重新悬浮于TNE中,再用SW41转子以160,000Xg经CsCl等密度离心36小时以纯化之。分级分离梯度并用SDS-PAGE法鉴定出含有HBcAg的峰值部分,合 、离心沉淀并重新悬浮于水中。
H.用表达HBsAg的重组病毒感染粉蚊夜蛾
每组10-20只第四令期的粉蚊夜蛾生长于半合成培养基(Hoffman等,1966),经口服用非吸留的重组病毒YM1KTs(5×105pfu/幼虫)或代表重组病毒VCKTs的多角形内含体(PIBS)(4×104PIBS/毛虫)感染之。外在保留4-5天后,收获可见感染和濒死的毛虫,在200μl含有0.02%二乙基二硫氨基甲酸钠的10mM Tris-HCl(pH7.4)中制成匀浆。取部分匀浆(5μl)以进行SDS-PAGE检测。
I.对HBsAg进行检测和定量分析的RIA
用生产厂家提供的HBsAg(20mg/ml)作为标准品,经固相放射免疫法(AUSTRIAⅡ;Abbott Laboratories)检测重组病毒产生的HBsAg。
J.血清学
用免疫荧光法检测被感染之细胞中由重组病毒产生的HBsAg和HBcAg。
用市售的RIA试剂盒(AUSAB,Abbott Laboratories)和两种固相“夹心”ELISA试验程序检测人血清中的抗HBsAg抗体(抗HBs)。1号ELISA使用了由人血浆制得的HBsAg来俘获和检测抗体。2号ELISA使用了由重组病毒产生的HBsAg来俘获抗体并使用由人血浆制得的HBsAg检测抗体。用两种固相竞争RIA方法测定HBcAg抗体(抗HBc)。1号RIA使用了由人肝脏制得的HBsAg,而2号RIA则使用重组病毒产生的HBcAg。
K.免疫荧光分析
在35mm组织培养皿中以1pfu/细胞的感染复数用病毒感染草地粘虫细胞。感染后72小时将5μl等分样品滴加在PTFE包被的多点显微镜载玻片上,用冷丙酮固定10分钟。以类似方法处理未感染的对照细胞。血清和腹水均用PBS稀释10倍。每种制剂各吸取10μl点加在感染细胞区域和对照细胞区域上。在高温度密封箱内将玻片37℃保温30分钟。用PBS洗去玻片上余留的抗体,将玻片吹干并除去所有的残留液体。用含有0.005%伊文氏兰的PBS稀释合适的结合物以掩盖非特殊性(本底)荧光。稀释羊抗人免疫球蛋白异硫氰酸荧光素(FITC)(Wellcome Diagnostics,Dartford,UK)和羊抗小鼠IgG及IgM-FlTC(TAGO公司,Burlingame,California,USA),以使阳性血清产生清晰的荧光,而阴性血清和对照细胞上只有很低的本底染色。吸取10μl稀释的结合物点加于各细胞区域并在密封箱内湿环境下将玻片37℃保温30分钟。按前述方法冲洗和洗涤染色的玻片并且最后在蒸馏水中冲洗1分钟。将玻片风干后用荧光显微镜检查之。
L.检测抗HBs的RlA法
用市售的RlA试剂盒(AUSAB)检测HBcAg抗体使之与WHO的参考抗HBs制剂相比较,其中用阴性人血清将参考制剂稀释至含有100,50和10个国际单位(IV)/L。
M.检测抗HBs的ELlSA法
用于检测抗HBs的固相“夹心”ELlSA法包括使用一种由微生物学试剂和质量控制中心(CDHL,Colindale)开发的新的增效系统。用Samuel及其同事(1988)所述的单克隆抗FlTC抗体的过氧化物酶结合物检测FlTC结合的抗原和抗体。在该抗HBs检测法中,试验抗体被夹在HBsAg包被的小井和HBsAg-FlTC结合物之间。依照Samuel及同事(1988)所述的方法,用在0.5ml含0.1M NaCl之0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.3)中的1mg HBsAg和37.5μg FlTC,使人血浆中制得的HBsAg与FlTC结合。依照Wilson和Nasane(1978)的过碘酸盐法制备抗FlTC过单化物酶结合物,用于检测结合的抗原-FlTC。
以亲合层析法,使用蛋白A Sepharose CL 4B(Pharmacia,Uppsala,Sweden)柱从人血清中纯化由人血浆得到的HBsAg,从细胞培养物上清液中纯化重组病毒产生的HBsAg,其中亲合柱上通过二甲基辛二酸亚氨酸酯(dimethylsuberimidate)交联有单克隆抗HBs(Davies和Stark,1970;Parkhouse,1984)。回收抗原并稀释到含有0.1%迭氮钠的0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH7.5)中,使其浓度为1μg/ml并用以包被聚苯乙烯微量滴定板(Nunc-Immuno Plate Maxisorp F96,A/S Nanc,Kampstrup,Denmark)。向各小井内加入100μl抗原悬液,在室温下保温3天。然后洗涤并用含有0.1%迭氮钠和1%BSA,0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)封闭未结合的位点。将平极保存于4℃下备用。在HBsAg包被的小井内加入100μl病人血清(采自HBsAg疫苗接种者或具有乙肝感染病史者)以及适当的阳性和阴性对照样品,于37℃保温1小时。洗涤小井除去未结合的物质,加入100μl人血浆中得到的HBsAg-FlTC结合的缓冲液(含有0.05%Tween,20.5%阴性人血清人1%BSA的PBS)。37℃保温1小时后洗涤小井,然后使100μl单克隆抗TlTC-过氧化物酶结合物(在结合物缓冲液中稀释的)与结合的HBsAg-FlTC反应。37℃保温1小时并进行最后一次洗涤后,加入含过氧化氢和原四甲基联苯胺(TMB)的底物溶液(0.001g TMB〔溶于100μl二甲亚砜中〕以及7.5μl6%〔W/V〕过氧化氢〔溶于100ml0.1M柠檬酸二乙酸缓冲液pH6.0中〕)。30分钟后加入100μl2MH2SO4以终止酶反应。在450nm处检测对照和试验样品吸光率。
N.检测抗HBc的RlA法
所用的固相竞争RlA法为Cohen及其同事(1981)所述方法的改进。用含有0.1%迭氮钠的0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)将人肝中得到的HBcAg稀释1.4×107倍,并将重组病毒产生的HBcAg稀释2×105倍,各取35ml稀释的抗原置于小烧瓶中,向其中加入210个酸洗的聚苯乙烯小球(Northumbria Biologicals公司,Cramlington,UK),室温振荡2小时,然后于室温下在暗处继续保温2-3天。用PBS洗HBcAg-小球3次,于4℃下存放在含0.5%BSA和0.1%迭氮钠的PBS中备用。向检测平板的各小井中加入20μl试验血清,再加入180μl稀释于含10%FCS之PBS中的125I标记的抗HBc。用阴性血清、强阳性和弱阳性血清作为对照,并进行类似处理。经吸印除去HBcAg-小球上的过量缓冲液,每小井内加入一个小球。封闭小井并在室温下于湿环境中保温过夜。借助Qwikwash(Abbott Laboratories公司)用蒸馏水洗各小井,然后将小球移入计数管中,用16小井r计数器(NE1600,Nuclear Enterprises,Edinburgh,Scotland,UK)计数放射活性,同时检测本底(Bkgd)幅射。依下式计数125I-抗HBc结合之百分抑制率:
100-〔「计数-本底」×100÷「平均阴性计数-本底」〕
在这些检测中,“强”阳性对照血清产生94%抑制率,“弱”阳性对照血清产生76%抑制率。重组病毒产生的和肝脏中得到的抗原给出相近的数值。阳性的临界值为67%抑制,阴性的临界值为50%抑制。
(ⅱ)结果
A.HB病毒C和前C基因的顺序分析
按上述方法制得含HB病毒adw血清型之C和前C抗原的DNA亚克隆。根据对这些克隆的DNA分析推测出HBcAg和HBpcAg基因产物的顺序(图13)。图中标出了甲硫氨酸密码子(加有方框)(其为前C和C基因产物的起始密码子),为与Dao及其同事(1983)发表的HB病毒adw顺序相比较,图中还标示了核苷酸(空心三角)和氨基酸(实心三角)的差异。所指出的基因产物的序列可与已公布的HB病毒之其他分离物的顺序相比较,(见Galibert等,1979;Pasek等,1979;Valenzuela等,1980;Fujiyama等,1983;Ono等,1983;Bichko等,1985)。
B.表达HBcAg或HBpcAg或HBsAg的重组棒状病毒
依上述方法将HB病毒的前C和C抗原编码顺序插入AcNPV转移载体pAcYM1(Matsuura等,1987)中(图9)。经限制性核酸内切酶消化以分析所得的重组转移载体(pAcYM1KTpc,pAcYM1KTc)并测定出图9所示的接合顺序。用感染性AcNPV DNA共转染后得到重组的棒状病毒(YMlKTpc,YM1KTc),纯化空斑并得到高滴度的病毒储备物。经掺入标记的甲硫氨酸(图14,左手栏)及Western分析(图14,右手栏),鉴定24.6千道尔顿HBpcAg和21.4千道尔顿HBcAg并测定其水平。基本上所有的HBcAg和HBpcAg抗原均可与细胞结合。图15A给出了由感染之细胞中提取并经CsCl梯度离心纯化的HBcAg的电镜照片。根据对梯度纯化之HBcAg的染色蛋白凝胶带的分析并与已知量牛血清白蛋白比较,确定纯化之HBcAg的产率为每升(1×109个感染的细胞)5mg。
使用小体积细胞培养物(如35mm培养皿)时,据报导由重组棒状病毒HBsYK14(Kang等,1987)合成之HBsAg的水平为每109个感染的细胞1.5mg。在使用大体积培养物时(100-1000ml),用同种病毒所得到的表达水平为每109个感染的细胞0.3-0.5mg。表达水平上这种差异的原因尚不明了。为了改善这一状况,将HBs基因从pAcRP6载体转移到pAcYM1载体中,因为已观察到后者对各种基因产物有较高的表达水平(见Matsuura等,1987)。在最初的研究中,经用BamHI消化从转移载体pAcRP6-HBsYK14(Kang等,1987)中回收HBsAg基因,然后直接插入转移载体pAcYM1的BamHI位点中。用所得转移载体制备重组病毒并检测HBsAg的合成水平。所获数据表明(未示出)表达水平相当于每109个感染的细胞0.3mg,且与平行检测的重组体HBsYK14的表达水平相近。
表达水平低的原因之一可能是在HBsAg编码上游存在HB基因组的约100个核苷酸(即在HB的Bam HI位点和HBsAg转译起始ATG之间)。基于这一认识,制备了转移载体pAcYM1KTs(图10)。用该载体产生一重组病毒(YMlKTs)。测知上清液(含有分泌的22nm HBsAg颗粒)中存在HBsAg,而且细胞溶解物中存在残留的HBsAg。由RlA法估计的HBsAg(细胞结合的并存在于上清液中的)产率为到感染后5天时每升1×109个感染的细胞0.3mg(图16)。HBsAg的这一表达水平与用其他重组体(如HBsYK14)所得表达水平相同。还测知标记的甲硫氨酸掺入到了细胞结合的HBsAg中(图14,见Kang等,1987)。图15B中示出了由上清液中经蔗糖梯度离心纯化的HBsAg的电镜照片。
C.共表达HBcAg和HBsAg的重组棒状病毒
经用AccⅡ消化HBsAg转移载体pAcYM1KTs,回收到一含有多菌体蛋白启动子、HBsAg基因和多角体蛋白转录终止信号的顺序(图11)。为了制备双重组载体,将其插入转移载体pAcYMKTpc和pAcYM1KTc的EcoRV位点(图3)。鉴定重组载体的性质并将具有与C基因呈相反定向之HBsAg基因的载体(pAcVCKTspc,见图11)用于在感染性AcNPV DNA存在下共转染草地粘虫细胞以产生重组病毒。回收重组病毒VCKTsc,纯化空斑并生长成高滴度的病毒储备物。分析由VCKTsc重组体制得的抗原。根据标记之甲硫氨酸的掺入及Western分析证明VCTsc重组体的HBcAg合成(图14)。其HBcAg的合成水平基本上与使用重组体YM1KTc所获得的合成水平相似。
以ELlSA法检测用双重组VCKTsc感染之细胞的HBsAg合成和分泌,以及残留的细胞结合之HBsAg(图14)。基于RlA法检测,估计感染后5天时HBsAg的总产率为每升1×109个感染的细胞0.4mg(图16),平行检测表明比用单表达重组病毒YM1KTs所得产率稍高。分泌之HBsAg的水平(图16)几乎为用重组体YM1KTs所得水平的两倍,但细胞结合之HBsAg则基本相同。不过总的说来,HBsAg合成的水平只代表了HBcAg合成量的一小部分。
D.共表达HBsAg和AcNPV多角体蛋白的重组棒状病毒
用AccⅡ消化HBsAg转移载体pAcYM1KTs,以回收含有多角体蛋白启动子、HBsAg基因和多角体蛋白转录终止信号的顺序(图12)。为了得到除含有AcNPV多角体蛋白基因外还含有HBsAg基因的双重组载体而将其插入到EcoRI“I”片段的EcoRV位点中,鉴定重组载体的性质并将在与多角体蛋白基因上相反定向上具有HBsAg基因者(pAcVCKTs,图12)用于在感染性AcNPV DNA存在下共转染草地粘虫细胞以产生重组病毒。图14显示了感染的草地粘虫细胞中由重组体VCKTs制得的蛋白质并与AcNPV感染相比较,从而可鉴定AcNPV多角体蛋白。虽然后者只制得少量的多角体蛋白(大多小于1pfu/细胞),但所得数据可用于鉴别VCKTs感染的细胞中的多角体蛋白。与其他含有HB S基因的重组体一样,HBsAg的合成是标记之蛋白质中的一个次要组分。根据RlA检测,感染后5天时每升1×109个感染细胞的产率约为0.4mg。
E.重组病毒感染的草地粘虫细胞中HB蛋白质合成的水平
图17中显示了自单表达重组体病毒YM1KTpc和YM1KTs,或双表达重组体病毒VCKTsc和VCKTs感染之细胞中回收的经过染色的蛋白图形,并与AcNPV感染及模拟病毒感染的细胞进行比较。AcNPV和VCKTs感染是以大约1pfu/细胞的感染复数开始的(此解释了多角体蛋白的代表达水平),而其他病毒感染复数在10pfu/细胞,并且于感染后2天回收蛋白质。很显然,对于含有HB C基因的病毒来说,细胞提取物中存在着相当量的HBcAg(目测估计约为细胞提取物中总蛋白的40%)。感观到前C抗原量较低(估计占染色之蛋白质的5-10%)。对于含有HB C或HBpC基因的重组体,当感染复数为1-10pfu/细胞时,基本上得到了与图17中所示者相似的结果。
尽管HBsAg在胶带上的位置正好位于一种细胞蛋白的泳动处(见图17,模拟泳道),但仍可以将它看作是染色胶带上的一个增强带,不过其数量比HBcAg的量少得多。当感染复数为1-10pf pfu/细胞时,感染后2天观察到的与细胞结合的HBsAg水平基本上相似,但对于VCKTs病毒,在更高的倍数下多角体蛋白的水平增强(估计为细胞蛋白的大约40%,见图14)。即使在较高感染复数时,估计与细胞结合的HBsAg所占比例不会超过染色蛋白的大约2%。
F.重组病毒感染的表达HBcAg和HBsAg的细胞的免疫荧光,以鉴别针对这些抗原的人抗体
人血清是由Virus Reference Laboratory(CPHL,Colindale)提供的。8份人血清在放射免疫检测中针对HBcAg是强阳性抗体,而针对HBsAg是阴性抗体,用它们使玻片染色。在重组病毒VCKTcs感染的昆虫细胞上,每一份血清都产生较好的荧光(图18,左图),但对于对照和未感染细胞没有反应(图18,右图),表明在此程序中,感染细胞中的抗原对于检测人的HBcAg抗体来说是合适的底物。
被接种者的血清含有高水平的HBsAg抗体(每升高达500国际单位〔IU〕),但通过合适的RIA检测不含有抗-HBcAg,这种血清在同样的重组病毒感染的细胞上不产生荧光。但证实了这些病毒感染的细胞中存在有HBsAg,利用小鼠单克隆抗HBsAg产生较好的荧光(图18,中图)。因此可以认为,病毒感染的细胞中与细胞结合的HBsAg不足以鉴别出这种水平的针对HBsAg的人抗体。
G.利用纯化的重组病毒产生的HBsAg进行ELISA检测以鉴别针对HBsAg的人抗体
通过RIA和ELISA测试88份送至Virus Referencl Laboratory作抗-HBsAg测定的血清和91份来自HBsAg阴性血液捐赠者(North London Blood Transfusion Cenfer,Edgware,UK)的血清。RIA利用得自Abbott Laboratories的非重组体HBsAg。1号ELISA检测法使用人血浆产生的HBsAg进行抗体捕获和检测。2号ELISA检测法使用如方法部分所述纯化的重组HBsAg进行抗体捕获,人血浆产生的HBsAg进行检测。将结果与阳性对照血清进行比较,此对照血清是用正常人血清稀释世界卫生组织的抗-HBsAg参考血清(RIA)或Blood Products Laboratory(BPL,ELstree,UK)的抗-HBsAg参考血清(ELISA)而制备的。对照血清含有10、50和100IU/升的抗-HBsAg抗体。如表1所示,用两种不同的抗原源所进行的抗体捕获测试之间有很好的一致性。
H.利用纯化的重组病毒产生的HBcAg进行竞争性RIA以鉴别针对HBcAg的人抗体。
利用重组病毒产生的HBcAg或人肝脏产生的HBcAg,通过竞争性RIA测试150份送至Virus Reference Laboratory(Colindale)作抗-HBcAg检测的血清。
测试血清中有6份在一种试验中产生“弱阳性”反应,但在另一试验中产生“阴性”反应(见上面和表2)。两份血清在使用肝脏产生的物质的RIA中产生阳性反应,使用重组抗原则给出阴性反应。已知在竞争性RIA中使用人肝脏产生的HBcAg时有时会产生假阳性结果-可能是由于血清与肝脏蛋白质发生了反应。从这一观点看来,认为两种测试间的一致性是相当好的,但是,必须用重组病毒产生的HBcAg通过RIA(或ELISA)测试更多的血清,以确定这种试验的合适性和专一性。
I.HBsAg在粉蚊夜蛾T.ni幼虫中的表达
用HBsAg的单表达载体(重组体YMIKTs)感染第四龄期的T.ni幼虫时(1-2×105pfu/幼虫),发现在濒死幼虫中的HBsAg的数量在1-2μg/幼虫的数量级。但在这样的幼虫发育晚期,只有30%的幼虫受到感染。使用较早龄期的幼虫可得到复制性感染,但抗原产率却相应较低(小于0.1μg/幼虫)。使用高滴度的病毒以克服利用四龄期幼虫的这一问题,也只有在对病毒进行浓缩后才是可行的。储备病毒的滴度的数量级一般在107-7.7pfu/ml组织培养液。
已经证实,吸留的AcNPV在感染T.ni幼虫时比非吸留的AcNPV更加有效和能够复制(见实例1)。因此,用代表吸留重组体VCKTs的4×104PIBS感染单个的四龄期T.ni幼虫(见上)。所有的幼虫都受到感染。在这些幼虫中得到的HBsAg的水平在2-4μg/幼虫的数量级。
J.用表达HBcAg的重组体感染的细胞的电子显微镜分析
根据在用重组病毒YM1KTc感染的草地粘虫细胞中合成的HBcAg的数量,对用此病毒感染的细胞进行电镜照片的检查(图19)。在细胞中可见到若干园形颗粒,主要是在细胞核附近。颗粒大小与梯度纯化的HBcAg(见图15)差不多。
总结
为了证实构建能在同一细胞中大量制备不同外源蛋白的多表达载体的可行性,我们制备了一种棒状病毒质粒复制子pAcVC2,它含有AcNPV多角体蛋白基因和LCMV-N基因的完整编码区。所构建的每个基因使它具有自己的AcNPV多角体启动子和转录终止顺序的拷贝,但LCMV-N基因位于与多角体蛋白基因相反的方向上。将产生的质粒与多角体蛋白阴性病毒DNA共转染进草地粘虫细胞,分离具有多角体素阳性表型的重组病毒。通过多种生化方法分析表明,重组病毒(如VC2)同时和以受控方式(即作为主要晚期蛋白)生产LCMV-N蛋白和多角体蛋白。两种基因产物占总细胞蛋白的相当一部分。这一结果十分重要,因为它们表明,如图1所示从含有复制的多角体素启动子的质粒复制子产生的重组棒状病毒(例如pAcVC2),能够大量制备两种基因产物。通过构建其中的pAcVC2多角体基因由另一外源基因取代的新载体,及用产生的质粒在VC2 DNA存在下共转染细胞,应该能够得到同时表达两种外源蛋白的重组的多角体蛋白阴性病毒。由于多角体蛋白转录机构的表达水平与多角体蛋白ATG上游顺序的安排相关(Matsuura等,1987),因此有可能通过操作这些顺序而调节不同外源基因的表达水平。
就实验所能确定的而言(在VC2病毒感染细胞中的LCMV-N和多角体蛋白基因mRNA水平的Northern分析),两种基因间的mRNA水平或摩尔水平上的表达没有显著的差别,而且就由平行的分析所能确定者而言,在用VC2病毒和用AcNPV作比较感染的细胞之间,多角体蛋白mRNAA水平没有显著差异。
VC2病毒感染的草地粘虫细胞的电镜照片表明,胞内多角体蛋白集合形成核内含体,它和野生型AcNPV感染中发现的那些没有差别,而且LCMV-N蛋白聚集形成胞质内含体。另外可见,VC2病毒颗粒被吸留在多角形内含体内。一些研究人员已经证实(Maeda等,1985,Overto等,1987),可以使用对棒状病毒感染敏感的昆虫(具体说是毛虫T.ni)生产重组病毒蛋白。在自然界,多角形内含体的溶解在昆虫中肠的碱性pH下对敏感毛虫进行感染,释放出能再感染敏感中肠细胞的病毒颗粒。在毛虫感染的随后阶段,非吸留病毒颗粒通过中肠细胞的质膜植入血淋巴中,亦因此将感染扩增到昆虫的其他细胞和组织。此系统感染随后产生大量吸留病毒,它们对于棒状病毒在环境中的持留是很重要的(以及在其他昆虫代中的随后的感染循环)。因此,多角形内含体在棒状病毒对毛虫的天然感染中起重要作用。多角体蛋白阴性病毒的作用没有达到这样的效率,利用非吸留的VC2病毒产生的幼虫感染率较低就说明了这一点。用VC2产生的多角体感染T.ni毛虫产生强力感染作用,并同时产生大量的LCMV-N蛋白。
所制备的能同时产生多角体蛋白和一种(或更多)外源基因产物的重组棒状病毒,应当克服一些感染性太低的问题,这些问题是由于使用多角体蛋白阳性重组棒状病毒在毛虫中高效而廉价地生产大量蛋白质所产生的。与此相似,通过基因工程构建的能表达多角体蛋白和一种对毛虫具毒性的基因产物(或一种对动物产生其他毒害效应的基因)的棒状病毒的可得性,可能导致生产出更为有效的棒状病毒杀虫剂,其感染性水平和环境持久性与天然野生型病毒近似,从而能提供长期的害虫防治作用(见Bishop,1986)。以本文所述结果为基础,制备和利用以棒状病毒(或其他载体)为基础的其他多表达系统的可能性是显而易见的,或者根据本文所述的路线进行,或者将同样的或遗传相容性生物(或病毒)的必需的调控基因机构置于基因组的其他区域。
对质粒复制子pAcVC2进行了修饰。用单一的限制性酶切位点取代LCMV-N基因和多角体蛋白基因,此位点可以插入任何两个外源基因,并最终能在重组病毒水平上同时表达。所产生的一般目的性复制子pAcVC3带有两个PES,它们位于对立DNA链的非复盖顺序上,此复制子能通过单一的Bg1Ⅱ和Bam HI限制顺序将外源基因插入质粒中(见图8和实例1(ⅱ)材料和方法(j)pAcVC3的构建)。
编码前C或C抗原(HBpcAg,HBcAg)的乙肝(HB)病毒顺序已被插入棒状病毒质粒转移载体pAcYM1中,使得HB病毒顺序在Autographa Californica核多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白启动子的调控下。用产生的任一种多组质粒在感染性AcNPV DNA的存在下感染。草地粘虫细胞,产生分别表达高水平HBpcAg或HBcAg(分别占染色的细胞蛋白的大约5-10%〔HBpcAg〕和大约40%〔HBpcAg〕)的多角体蛋白阴性重组病毒。通过密度梯度离心,从感染细胞的提取物中纯化至均一性的27mmHBcAg颗粒。还已经构建了含有HBcAg基因顺序和HB病毒S抗原(HBsAg)(每个基因都有自己的多角体蛋白启动子的拷贝)编码顺序的双表达转移载体,用它产生重组病毒。具有HBVC和S基因的重组体表达高水平的HBcAg(占细胞蛋白的大约40%),同时表达低水平的HBsAg(占染色细胞蛋白的大约2%)。已经制备了能产生HBsAg及AcNPV多角体蛋白的吸留的双表达重组棒状病毒,它对于Trichoplusia ni毛虫具有强感染性,从而能以廉价的方式复制制备抗原。
利用放射性免疫检测(RIA)和ELISA,重组的HBcAg(RIA)和HBsAg(ELISA)已被用来鉴别人抗HB病毒的抗体,所得结果与用非重组抗原得到的数据相比较更为有利。
微生物寄存
一个在大肠杆菌MC1061中的质粒pAcVC3的样品已于1987年8月7日以NCIBl 2516的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,PO Box 31,Aberdeen AB 9 8DG)。
一个重组病毒VC4的样品已于1987年8月10日以87081001的序号寄存于国立动物细胞培养物收集中心PHLS(Cenfer for Appled Microbiology.& Research,Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 09G)。
一个在大肠杆菌JM105中的质粒pAcYM1KTs的样品已于1988年7月25日以NCIB40033的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,PO Box 31,Aberdeen AB9 8DG)。
一个在大肠杆菌JM105中的质粒pAcVCKTs的样品已于1988年7月21日以NCIB 40028的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,PO Box 31,Aberdeen AB9 8DG)。
一个在大肠杆菌JM105中的质粒pAcVCKTsc的样品已于1988年7月21日以NCIB 40029的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,PO Box 31,Aberdeen AB9 8DG)。
一个在大肠杆菌JM105中的质粒pAcVCKTspc的样品已于1988年7月21日以NCIB40030的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,PO Box 31,Aberdeen,AB9 8DG)。
一个在大肠杆菌JM105中的质粒pAcYM1KTc的样品已于1988年7月21日以NCIB40031的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,,PO Box 31,Aberdeen,AB9 8DG)。
一个在大肠杆菌JM105中的质粒pAcYMIKTpc的样品已于1988年7月21日以NCIB40032的序号寄存于国立工业及海洋细菌收集中心(135 Abbey Road,PO Box 31,Aberdeen AB9 8DG)。
表1.RIA及ELISA测试的人血清中的抗-HBs水平
RIA〔ELISA〕1号〕
利用人血浆产生HBsAg作抗体捕获(及检测)测定人抗体对HBsAg的滴度,在RIA检测中使用世界卫生组织的抗-HBs参考,在〔1号ELISA〕中用来自BPL(ELstree,UK)的抗-HBs参考。所得数据与用重组HBsAg作抗体捕获(以及用人血浆产生的HBsAg作检测)及在2号ELISA检测中用BPL的参考抗体测定的人抗体滴度相比较。
表2.用RIA和肝脏或重组体产生的抗原分析人血清的抗-HBs
1号RIA
利用肝脏(1号RIA)或重组体产生的HBcAg(2号RIA)测定人抗体对HBcAg的滴度。
附图说明
图1.构建质粒复制子pAcVC2的概图。
图2.重组棒状病毒感染的草地粘虫细胞的免疫荧光。细胞是在36小时前用AcNPV(a,b)或重组体YM1,YN1(Matsuura等,1987;C,d),或重组病毒VC2(例如来自重组复制子pAcVC2)感染的。在图片a、c和e中,细胞用丙酮固定,用LCMV-N专一性单克隆抗体检查其免疫荧光(M.Buchmeier,Scripps Institute,La Jolla CA,USA)。为了观察多角形内含体,用光学显微镜检查同样的细胞(b,d,g)。用AcNPV感染的细胞含有多角形内含体(b)。用重组体YM1.YN1感染的细胞没有(d)。用重组体VC2感染的细胞既表现出阳性免疫荧光(e),又含有多角形内含体(g)。重组体VC2病毒感染的细胞的杂合的紫外/光学显微图片(f)清楚地显示出免疫荧光和多角体二者。
图3,重组棒状病毒VC2 DNA的Southern印迹分析。从AcNPV、重组病毒VC2和从重组复制子pAcVC2中回收VC2病毒DNA的AccⅡ消化产物。DNA产物由琼脂糖凝胶电泳分离,用缺口转译的多角体蛋白DNA的编码区(上图),或用缺口转译的LCMV-NDNA的编码区(下图)进行探测。两种DNA探针都鉴别到了VC2 DNA的AccⅡ消化产物中的5082核苷酸片段,它相应于重组复制子pAcVC2中存在的AccⅡ片段。正如所期望的,多角体蛋白探针在野生型AcNPV中鉴别到了2028核苷酸的AccⅡ片段,而LCMV-N探针不与AcNPV DNA中的任何顺序杂交。
图4.由重组病毒VC2感染的S.frugiperda细胞中提取的总细胞RNA的Northorn印迹分析。如方法部分所述收集多聚(A+)RNA分子并作处理。使转移的RNA与代表多角体蛋白基因(左图)或LCMV-N基因(右图)编码区的缺口转译探针杂交。对用野生型AcNPV或表达LCMV-N蛋白的重组病毒YM1.YN1感染的S.frugiperda细胞进行相似处理,并用作阳性杂交对照。多角体蛋白探针与VC2感染细胞的细胞RNA中的1.2Kb mRNA分子杂交,它对应于AcNPV感染细胞中存在的多角体蛋白mRNA分子。LCMV-N探针与VC2感染细胞的细胞RNA中的2.25Kb mRNA分子杂交,它对应于YM1.YN1重组病毒感染细胞中存在的LCMV-N mRNA分子。
图5.对重组棒状病毒VC2感染期间产生的蛋白质进行代谢标记。草地粘虫细胞用病毒VC2或野生型AcNPV、或重组病毒YM1.YN1(只含有LCMV-N基因)感染。感染后24小时,回收〔35S〕标记的蛋白质,通过凝胶电泳分离并作荧光图。未感染细胞作相似处理(U)。标出了LCMV-N和AcNPV多角体蛋白的位置。
图6.重组棒状病毒VC2对LCMV-N和多角体蛋白的表达。感染方法的细节与图5中所述相同,只是用Kenacid Blue对蛋白胶带染色。标出了LCMV-N和多角体蛋白的位置。
图7.未感染或病毒感染的S.frugiperda细胞的电镜照片。图片(a)显示为未感染的S.frugiperda;(b)AcNPV感染的S.frugiperda,说明核中的多角形内含体;(c)用重组病毒YM1.YN1感染的S.frugiperda,注意致密的胞质LCMV-N蛋白内容体;(d)和(e)用重组病毒VC2感染的细胞,表明核内的多角形内含体及胞质LCMV-N蛋白内含体。
图8.构建质粒复制子pAcVC3的概图。
图9.如方法部分所述构建转移载体pAcYM1KTpc和pAcYM1KTc的概图。在所给出的顺序中,在插入位点下面用线条标出了BamHI位点和HBpcAg和HBcAg的起始密码子。
图10.如方法部分所述构建转移载体pAcYM1 KTs的概图。在给出的顺序中,下面用线条标出了BamHI位点和HBsAg的起始密码子。
图11.如方法部分所述构建转移载体pAcVC KTspc和pAcVCKTsc的概图。
图12.如方法部分所述构建转移载体pAcVC KTs的概图。
图13.HBcAg和HBpcAg基因和氨基酸顺序。起始前C和C基团产物的甲硫氨酸密码用方框标出。空心和实心三角分别表示与Ono及其同事(1983)发表的顺序相比较的核苷酸和氨基酸差别。
图14.重组棒状病毒表达蛋白质的代谢标记(左)和Western印迹分析(右)。用重组病毒或野生型AcNPV感染S.frugiperda细胞。感染后48小时用〔35S〕甲硫氨酸标记蛋白质3小时,回收35S标记的蛋白质,由凝胶电泳分离,印迹转移至硝化纤维素膜上作荧光图(左),或用抗-HBcAg血清进行免疫学检测(右)。未感染细胞进行类似处理(模拟)。标出了HBcAg(c)、HBpcAg(pc)、HBsAg(S)和AcNPV多角体蛋白(P)的位置。左边标出了分子量标记蛋白质(12.5-92千道尔顿)的位置。
图15.重组病毒感镜腟.frugiperda细胞产生的HBcAg和HBsAg颗粒的电镜照片。(A)从YM1KTc病毒感染的细胞中通过声波处理提取HBcAg(或有时通过冻融细胞),如方法部分所述用CsCl等密度离心纯化,然后用1%乙酸双氧铀染色。(B)由YM1KTs病毒感染细胞的上清液中收集HBsAg,用7%PEG处理后通过离心(2000xg)分离,用9%PEG调节上清液后使抗原沉淀,然后用1%乙酸双氧铀染色。
图16.用重组体YM1KTs(A)或VCKTsc(B)感染的S.frugiperda细胞合成HBsAg的动力学。感染细胞(5×108)在500ml培养基中进行搅拌培养。每天收集样品(5ml),通过低速离心分离培养基和细胞。细胞用PBS轻轻冲洗后通过声波处理溶解。通过固相RIA(AUSTRIAⅡ,Abbott Laboratories)测量细胞溶解液或澄清的培养基中的病毒HBsAg,用人产生的HBsAg作为阳性对照并定量测定其产率(见方法部分)。所得数据表达为每毫升原初培养基中的抗原。
图17.重组棒状病表达的HBcAg、HBpcAg、HBsAg和多角体蛋白。在感染后2天从重组体或AcNPV感染的细胞中收集细胞提取液。通过SDS-PAGE分离后,胶带用Kenacid Blue染色。标出了HBpcAg、HBcAg、HBsAg和多角体蛋白的位置。
图18.重组棒状病毒感染的S.frugiperda细胞的免疫荧光。72小时前用重组棒状病毒VCKTsc感染的S.frugiperda细胞用丙酮固定,然后如方法部分所述,利用(A)人抗-HBc血清或(B)小鼠单克隆抗-HBs腹水通过间接的免疫荧光检测法检查。未感染的S.frugiperda细胞进行类似处理,用小鼠单克隆抗-HBs(c)进行检查。
图19.病毒感染的S.frugiperda细胞的电镜照片。(A)显示了重组体VCKTsc感染细胞的薄切片,(B)是更高放大倍数的另一细胞。实心三角标出了HBcAg的聚集位置。
Claims (33)
1、一种用于将多基因导入表达载体的质粒复制子,包括含有下述的双链DNA。
(a)一个或多个使复制子能在细菌宿主中复制的顺序,
(b)第一和第二顺序,它们被修饰成能使插入顺序位于所述第一和第二顺序之间并被导入表达载体中,以及
(c)位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序,
其特征在于插入顺序含有第一和第二多肽表达顺序(PES),其中每个PES包括(i)一个转录启动子(ii)让表达载体的天然或外源基因导入的单一限制性位点和(iii)一个转录终止位点。
2、根据权利要求1的质粒复制子,其中的第一和第二PES在不同DNA链上以相互对立的方向排列。
3、根据权利要求1的质粒复制子,其中的第一和第二PES在同一DNA链上以同样方向排列。
4、根据权利要求3的质粒复制子,其中在两个PES之间有一个选择基因或一个表达载体的基本功能基因。
5、根据前述权利要求任一项的质粒复制子,其中每个PES含有不同的单一限制性位点,以让表达载体的天然或外源基因导入。
6、根据前述权利要求中任一项的质粒复制子,其中包括多对所述的第一和第二PES。
7、一种用于将多基因导入表达载体的质粒复制子,它能够转染敏感昆虫或昆虫细胞,包括含有下述的双链DNA
(a)一个或多个使复制子能在细菌宿主中复制的顺序
(b)第一和第二顺序,它们被修饰成能使插入顺序位于所述第一和第二顺序之间并被导入表达载体中,以及
(c)位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序,
其特征在于插入顺序含有第一和第二多肽表达顺序(PES),其中每个PES包括(ⅰ)一个转录启动子(ⅱ)一个表达载体的天然或外源基因和(ⅲ)一个转录终止位点。
8、根据权利要求6的质粒复制子,其中的第一和第二PES在不同DNA链上以相互对立的方向排列。
9、根据权利要求6的质粒复制子,其中的第一和第二PES在同一DNA链上以同样方向排列。
10、根据权利要求8的质粒复制子,其中在两个PES之间有一个选择基因或一个表达载体的基本功能基因。
11、根据权利要求7-10中任一项的质粒复制子,其中所述的PES之一包含一个编码AcNPV多角体蛋白的结构基因。
12、根据权利要求7-11中任一项的质粒复制子,其中所述的PES之一至少含有一个乙肝表面抗原的抗原部分。
13、根据权利要求7-12中任一项的质粒复制子,其中所述的PES之一至少含有一个乙肝核心抗原的抗原部分。
14、根据权利要求7-10中任一项的质粒复制子,其中所述的PES之一含有的结构基因至少编码乙肝表面抗原的一个抗原部分,另一个所述的PES至少编码乙肝核心抗原的一个抗原部分。
15、一种用于构建权利要求1-14中任一项的质粒复制子的顺序暗盒,它包括含有第一和第二多肽表达顺序(PES)的插入顺序,每个PES都如所述定义的权利要求所定义,并由与表达载体的顺序同源的臂顺序相邻接,使得将它插入载体中时,不会使表达载体丢失基本功能基因。
16、根据权利要求15的顺序暗盒,其中的手臂与载体基因组的顺序同源,该顺序的排列使得插入顺序导入时不会丢失载体DNA顺序。
17、根据权利要求15的顺序暗盒,其中的手臂与载体基因组的顺序同源,该顺序的排列使得插入顺序导入时取代载体DNA中的次要顺序。
18、根据权利要求15的顺序暗盒,其中的手臂与载体基因组的顺序同源,该顺序的排列使得插入顺序导入时取代载体基因组中的基因间区域或非调节区域。
19、根据权利要求15-19中任一项的顺序暗盒组成的一套顺序盒,其中的每个顺序暗盒的同源区同源于载体基因组的不同区域,使得多对PES都能被导入载体基因组中,而每一对都位于不同的位置。
20、一种适于转染昆虫细胞的病毒表达载体,它具有一个修饰成能在细胞中直接合成至少一种通常不由该细胞的核DNA编码的多肽的插段,所述插段包括含有位于所述第一和第二顺序之间的插入顺序的双链DNA,其特征在于插入顺序包括第一和第二多肽表达顺序(PES),每个PES包括(ⅰ)一个转录启动子(ⅱ)一个表达载体的天然或外源基因和(ⅲ)一个转录终止位点。
21、根据权利要求20的病毒表达载体,其中所述结构基因之一编码一种在野生型病毒感染昆虫细胞期间正常表达的病毒蛋白质。
22、根据权利要求20?1的病毒表达载体,其中所述启动子中至少一个是在野生型病毒感染昆虫细胞期间正常表达的病毒蛋白的启动子。
23、根据权利要求22的病毒表达载体,其中的昆虫病毒是棒状病毒。
24、根据权利要求20-23中任一项的病毒表达载体,其中所述的启动子至少有一个是Autographa californica核多角体病毒的多角体基因启动子。
25、根据权利要求20-24中任一项的病毒表达载体,其中所述的PES之一含有一个编码AcNPV多角体蛋白的结构基因。
26、根据权利要求20-25中任一项的病毒表达载体,其中所述的PES之一至少含有乙肝表面抗原的一个抗原部分。
27、根据权利要求20-26中任一项的病毒表达载体,其中所述的PES之一至少含有乙肝核心抗原的一个抗原部分。
28、根据权利要求20-24中任一项的病毒表达载体,其中所述的PES之一含有的结构基因至少编码乙肝表面抗原的一个抗原部分,另一个所述的PES至少编码乙肝核心抗原的一个抗原部分。
29、根据权利要求20-28中任一项的表达载体,它是通过将权利要求15-18中任一项的顺序暗盒导入合适的接受载体中,或将权利要求19的一套顺序暗盒导入合适的接受载体中而产生的。
30、一种构建权利要求20-29中任一项的表达载体的方法,包括使用如权利要求6-14中任一项所定义的质粒复制子去转化缺乏所述插段的载体。
31、一种制备一种或多种所需多肽的方法,包括用根据权利要求20-29的或根据权利要求30的方法构建的表达载体感染敏感昆虫或昆虫细胞,并回收所述的所需多肽。
32、根据权利要求31的方法,其中包括感染能够受到病毒感染的昆虫种的个体。
33、根据权利要求32的方法,其中的个体是毛虫形式的个体。
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