CN103449533B - 一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种采用超临界二氧化碳法从趋磁细菌中萃取分离磁小体的方法。该方法主要包括有机溶剂预处理、超临界二氧化碳萃取分离、有机溶剂和水溶性残留物去除过程。采用此方法在最佳超临界二氧化碳流体的温度、压力条件和萃取次数下从趋磁细菌中萃取分离了磁小体，萃取分离获得的磁小体具有粒径小、单分散性好、稳定性高、无残留有机溶剂、饱和磁化强度高、萃取分离效率高等特征。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地讲，涉及一种从趋磁细菌中提取纳米磁小体的一种新方法。
背景技术
趋磁细菌是能够沿着地球磁场，或者外加磁场方向定向运动或排列的一类水生生物细菌。这类细菌能够合成具有生物膜包被、单磁畴级晶体的磁性颗粒，这种颗粒被称为磁小体。磁小体具有成分纯、形态独特、细小均匀、有外膜包被等特点。由于其具有巨大的表面积和体积比、无细胞毒性、不易发生团聚以及独特的生物学特性，使得该纳米级的磁性颗粒在生物工程、磁记忆材料、化工、医药卫生等方面有着广阔的应用前景。
有关这种磁性颗粒的提取纯化方法的文献较少，到目前为止，已经报道的提取分离磁小体的方法有以下几种：（1）用溶菌酶或NaOH溶解（参见Noriyuki Nakamura, Kohji Hashimoto, and Tadashi Matsunaga. Immunoassay Method for the Determination of Immunoglobulin G Using Bacterial Magnetic Particles. Anal.Chem.1991, 63: 268–272）；（2）用细胞压榨仪破壁；（3）过滤离心法（参见申请号为CN02115867.3的中国专利申请，一种淤泥趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法，和申请号为CN02115868.1的中国专利申请，一种铁矿趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法）；（4）反复冻融法（参见申请号为CN200510019607.5的中国专利申请，一种兼性厌氧趋磁细菌及其分离、纯培养方法和磁小体的提取、纯化方法）；（5）超声波破壁（参见申请号为CN03153488.0的中国专利申请，趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法）；（6）破壁后采用磁场分离的方法收集磁性颗粒。
上述几种方法都无法除去有免疫原性的一些物质，再者用溶菌酶和NaOH破壁提取的磁性颗粒的外膜已被破坏，容易引起团聚；而用超声波破碎提取磁小体后，超声波打击可能会使磁小体膜上的结合蛋白脱落（参见付刚，姜伟，李颖等，磁螺菌磁小体形成的电镜观察及其纯化，China Journal of Modern Medicine.2004，14(5)：45–49）。传统生物方法提取的磁小体存在生产周期长、单分散性差、稳定性不好、残留杂质不容易去除、产量较低等问题。
超临界二氧化碳流体是一种环境友好型溶剂，不仅具有液体的高密度、强溶解性、优良的溶剂特性和高传热系数的性质，而且有近似于气体的粘度和扩散系数，在临界点附近，超临界二氧化碳流体的物性随温度和压力的变化十分敏感。由于超临界二氧化碳的特殊性质，在完成溶剂功能后易于与产物分离且不造成环境污染，使得超临界二氧化碳流体技术在萃取分离、化学反应工程、生物工程、石油化工、环境保护等领域都有广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种采用超临界二氧化碳法从趋磁细菌中萃取分离磁小体的方法，采用此方法萃取分离获得的磁小体具有粒径小、单分散性好、稳定性高、无有机溶剂残留、饱和磁化强度高、萃取分离效率高等特征。
为了解决上述问题，本发明提供了一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，包括以下步骤：
（1）有机溶剂预处理：离心收集菌体，将菌体细胞转移至烧杯中，用体积比为2:1的氯仿和甲醇溶液溶解菌体细胞，振荡摇匀，待样品颜色由淡黄色变为乳白色；
（2）超临界CO2萃取和有机溶剂的去除：加入重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入35—60℃的恒温水浴中稳定，在反应釜中通入二氧化碳气体，在反应釜温度为35—60℃和压力为10—25Mpa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体；
（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清，用重蒸水洗涤至少3次。
步骤（2）中通过缓慢释放二氧化碳气体使有机溶剂和菌体细胞的有机残留物一同除去，步骤（3）中通过纯化将水溶性残留物去除。
作为一个优选，最佳的超临界二氧化碳流体的温度、压力条件为：步骤（2）恒温水浴的温度为60℃，反应釜的温度为60℃，压力为20Mpa。
作为一个优选，步骤（1）结束之后，重复多次操作步骤（2），然后再进行步骤（3），所述多次是指2—7次；更优选重复操作步骤（2）7次。
本发明的有益效果在于：
（1）实现高效萃取分离：该方法结合有机溶剂溶解以及超临界二氧化碳萃取，一方面使有机溶剂破坏细菌的外层细胞壁并溶解菌体；另一方面，二氧化碳的超临界状态特点能够更好地使细菌内含物释放出来，并提取有机溶剂和细胞残体，达到从趋磁细菌中萃取分离磁小体的目的。克服了单纯化学试剂溶解菌体外层生物膜，使菌体发生团聚的缺点；也克服了传统生物方法提取的磁小体提取周期长、产量低的不足，为磁小体超临界流体萃取的工业化生产奠定了实验基础。
（2）无残留有机溶剂：利用超临界二氧化碳流体具有高的溶解有机溶剂的能力，将有机溶剂通过气体排放除去，避免了有机溶剂的残留，提高了磁小体的回收率。且有机溶剂溶解的细胞残体在放气过程中随有机溶剂一同排出，纯化了磁小体。
（3）萃取获得的磁小体具有稳定性高和单分散性好的特点：通过选择超临界二氧化碳的萃取条件（温度、压力、萃取次数），使趋磁细菌的外膜通过超临界二氧化碳流体去除，而保持趋磁细菌中磁小体表面膜，克服了膜上蛋白容易脱落的不足，使萃取分离获得的磁小体具有稳定性高，单分散性好的特点。克服了传统方法提取的磁小体由于团聚造成的粒径大、单分散性差、粒径大小不一的不足。
（4）萃取的磁小体仍保持高的饱和磁化强度且更接近超顺磁性：用超临界二氧化碳方法萃取获得的磁小体仍保持较高的饱和磁化强度且更接近超顺磁性。
附图说明
图1为用超临界二氧化碳法萃取出的磁小体形貌图(透射电子显微镜)。
图2为趋磁细菌在300K下的磁滞回线图。
图3为采用超临界二氧化碳法萃取的磁小体在300K下的磁滞回线图。
图4为不同温度条件下萃取的磁小体粒径分布图（动态光散射法）。
图5为不同萃取次数条件下萃取的磁小体粒径分布图（动态光散射法）。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的超临界二氧化碳法从趋磁细菌中萃取分离磁小体的具体实施方式做详细说明。
实施例1
（1）有机溶剂预处理：将培养至稳定期的趋磁细菌培养液在离心机中分离（4000 rmp，20 min），弃去上清液，收集菌体，将菌体细胞转移至50 mL烧杯中，用0.3ml体积比为2:1的氯仿和甲醇混合溶剂溶解菌体细胞，振荡摇匀5 min，样品颜色由淡黄色变为乳白色。
（2）超临界CO2萃取和有机溶剂的去除：加入5mL重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入一定温度的恒温水浴中稳定一段时间。在反应釜中通入二氧化碳气体，在一定的反应釜的温度35℃和压力10Mpa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体。
（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入50mL烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置20-30min，或更长时间，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清，用重蒸水洗涤，洗涤至少3次，洗去萃取之后附着在磁小体上的水溶性杂质。
实施例2
（1）有机溶剂预处理：将培养至稳定期的趋磁细菌培养液在离心机中分离（4000 rmp，20 min），弃去上清液，收集菌体，将菌体细胞转移至50 mL烧杯中，用0.3ml体积比为2:1的氯仿和甲醇混合溶剂溶解菌体细胞，振荡摇匀5 min，样品颜色由淡黄色变为乳白色。
（2）超临界CO2萃取和有机溶剂的去除：加入5mL重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入一定温度的恒温水浴中稳定一段时间。在反应釜中通入二氧化碳气体，在一定的反应釜的温度40℃和压力25Mpa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体。
（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入50mL烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置20-30min，或更长时间，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清，用重蒸水洗涤，洗涤至少3次，洗去萃取之后附着在磁小体上的水溶性杂质。
实施例3
（1）有机溶剂预处理：将培养至稳定期的趋磁细菌培养液在离心机中分离（4000 rmp，20 min），弃去上清液，收集菌体，将菌体细胞转移至50 mL烧杯中，用0.3ml体积比为2:1的氯仿和甲醇混合溶剂溶解菌体细胞，振荡摇匀5 min，样品颜色由淡黄色变为乳白色。
（2）超临界CO2萃取和有机溶剂的去除：加入5mL重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入一定温度的恒温水浴中稳定一段时间。在反应釜中通入二氧化碳气体，在一定的反应釜的温度60℃和压力20Mpa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体。
（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入50mL烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置20-30min，或更长时间，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清，用重蒸水洗涤，洗涤至少3次，洗去萃取之后附着在磁小体上的水溶性杂质。
实施例4
（1）有机溶剂预处理：将培养至稳定期的趋磁细菌培养液在离心机中分离（4000 rmp，20 min），弃去上清液，收集菌体，将菌体细胞转移至50 mL烧杯中，用0.3ml体积比为2:1的氯仿和甲醇混合溶剂溶解菌体细胞，振荡摇匀5 min，样品颜色由淡黄色变为乳白色。
（2）超临界CO2萃取和有机溶剂的去除：加入5mL重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入一定温度的恒温水浴中稳定一段时间。在反应釜中通入二氧化碳气体，在一定的反应釜的温度60℃和压力20Mpa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体。重复此步骤，共萃取7次。
（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入50mL烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置20-30min，或更长时间，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清，用重蒸水洗涤，洗涤至少3次，洗去萃取之后附着在磁小体上的水溶性杂质。
实施例5、萃取获得的磁小体性能测定
如图1所示，萃取获得的磁小体颗粒具有形貌完整、粒径均匀、单分散性好、稳定性好等特点。
如图2、图3所示，图2为趋磁细菌在300K下的磁滞回线图，图3为采用超临界二氧化碳法萃取的磁小体在300K下的磁滞回线图，萃取分离后的磁小体保持了趋磁细菌原有的饱和磁化强度且更接近超顺磁性。
在室温条件下，趋磁细菌的饱和磁化强度为0.038emu/g，磁小体的饱和磁化强度为0.042emu/g；趋磁细菌的矫顽力为119.1Oe，磁小体的矫顽力为21.2Oe，磁小体的矫顽力比趋磁细菌的低，更接近超顺磁性。研究结果表明用超临界二氧化碳法萃取的磁小体仍保持了趋磁细菌原有的饱和磁化强度且更接近超顺磁性。
图4为不同温度条件下萃取的磁小体粒径分布图，随着温度的升高，分布最多的磁小体的粒径逐渐减小，且变化较显著。由于温度的升高，CO2达到超临界状态后，其溶解力增强，能更好的穿透趋磁细菌，将磁小体萃取出来。数据显示，温度为60℃时，萃取效果最佳。
图5为不同萃取次数条件下萃取的磁小体粒径分布图，随着萃取次数的增加，磁小体粒径逐渐减小，超临界二氧化碳萃取磁小体更加完全，可以使磁小体更好地释放出来，以达到最佳萃取效果。萃取次数为7次的时候，萃取效果最佳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）有机溶剂预处理：离心收集菌体，将菌体细胞转移至烧杯中，用体积比为2:1的氯仿和甲醇溶液溶解菌体细胞，振荡摇匀，待样品颜色由淡黄色变为乳白色；
（2）超临界CO2萃取和有机溶剂的去除：加入重蒸水于上述烧杯中，磁力搅拌使其形成混悬液，将上述混悬液加入到超临界二氧化碳反应釜中，并将反应釜放入35—60℃的恒温水浴中稳定，在反应釜中通入二氧化碳气体，在反应釜温度为35—60℃和压力为10—25MPa条件下，搅拌萃取一个小时，然后将恒温水浴温度降至室温，缓慢释放二氧化碳气体使体系压力降为常压，在反应釜中获得磁小体；
（3）水溶性残留物的去除：将萃取出的磁小体倒入烧杯中，将一磁铁固定在烧杯一侧，静置，待磁性颗粒的黑色沉淀全部聚集在放磁铁的一侧后，弃去上清液，用重蒸水洗涤至少3次。
2. 根据权利要求1所述的一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，其特征在于，所述步骤（2）恒温水浴的温度为60℃，反应釜的温度为60℃。
3. 根据权利要求1所述的一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，其特征在于，所述步骤（2）的压力为20MPa。
4. 根据权利要求1所述的一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，其特征在于，步骤（1）结束之后，重复多次操作步骤（2），然后再进行步骤（3），所述多次是指2—7次。
5. 根据权利要求4所述的一种提取分离趋磁细菌中磁小体的超临界二氧化碳方法，其特征在于，所述多次是指7次。
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