CN103446600A - 为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法和相应的生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,包括:用伽马射线照射浸于磷酸盐缓冲溶液中的所述含有葡萄糖氧化酶的膜。本发明也涉及相应的生物传感器。
Description
背景技术
本发明涉及为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法和相应的生物传感器。
装有包含葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器被用于连续及/或自动地监控像糖尿病患者这类人群的体液(例如血液或者间液)中的葡萄糖水平。装有包含葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器也被用于自动及/或连续地检测葡萄糖水平以监控生物反应器中的细胞生长。
为避免细菌、真菌、病毒等生物污染物或病原体的至少潜在的威胁,保证使用者的健康与安全或生物反应器的正常运行,为生物传感器杀菌是十分重要的。
伽马射线照射、高压杀菌处理、和乙撑氧处理是一些杀菌技术。但是,在消除或者灭活有害的、潜在危险的生物污染物或病原体的同时,伽马射线也会损害含有葡萄糖氧化酶的膜,降低生物传感器的灵敏度。所以,人们开发了在为生物传感器和/或含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的同时保护它们免受损害的方法。
例如,美国专利申请第2010/0293892号公开了一项保护酶(葡萄糖氧化酶)传感器并同时保持其无菌状态的包装方法,涉及用射线照射密封的包装之前向包装内充入惰性气体以产生过量的气压,或者将包装抽真空。
也有为其他生物材质杀菌并同时避免过多损害的方法。举例而言,美国专利第7848487号公开了尿激酶、固定抗胰岛素单克隆抗体、和猪心瓣膜尖在非水环境中接受伽马射线的照射依旧能保持活性,但是在水性环境(磷酸盐缓冲溶液)中接受伽马射线后会明显失去活性。另外,美国专利申请第2002/004488号公开在磷酸盐缓冲溶液作为填充液的容器中接受伽马射线,如果没有正电荷的三糖或高糖,抗人类CD4单克隆抗体会失去活性,但是,若有正电荷的三糖或高糖存在,抗人类CD4单克隆抗体会依旧保持活性。
包括在以上专利或专利申请中提及的用伽马射线为生物传感器和/或含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌等现有方法,都不能将灵敏度损失控制在一些特定环境中所要求的合理范围内。
因此,需要提供新的或者改进的为生物传感器和/或含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法及相应的生物传感器。
发明内容
一方面,本发明涉及一种为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,包括:用伽马射线照射浸于磷酸盐缓冲溶液中的所述含有葡萄糖氧化酶的膜。
另一方面,本发明涉及装有通过以上所述方法杀菌的含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器。
另一方面,本发明涉及装有包含葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器。其通过后述方法杀菌:在所述含有葡萄糖氧化酶的膜浸于磷酸盐缓冲溶液中的情况下用伽马射线照射。
结合详细说明并参照附图可以更好地理解本发明的特色,组成以及优点。
附图说明
图1是例1所得到的图表。
图2是例2所得到的图表。
具体实施方式
说明书中的近似用语用来修饰数量,表示本发明并不限定于该具体数量,还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的,用“大约”、“约”等修饰一个数值,意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中,近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。
本发明中所提及的数值包括从低到高一个单元一个单元增加的所有数值,此处假设任何较低值与较高值之间间隔至少两个单元。举例来说,如果说了一个组分的数量或一个工艺参数的值,比如,温度,压力,时间等等,例如从25到40,是想表达30到35,26到39,33到35,28到32等数值都已经明白的列举在此说明书中。对于小于1的数值,0.0001,0.001,0.01或者0.1被认为是比较适当的一个单元。前述只是想要表达的特别示例,所有在列举的最低到最高值之间的数值组合均被视为以类似方式清楚地列在本说明书中。
在以下的说明和权利要求中,除非另有说明,单复数没有特别限定。
在此涉及的“也许”、“可能”、“可”、“可以”表示在某种情况下发生的可能性;某种特定所有权、特点或功能;和/或通过修饰动词来表示一个或多个能力、性能或与被修饰动词相关的可能性。相应地,“也许”、“可能”、“可”、“可以”表示尽管在一些情境下,被修饰词不能合适地、可能地或适当地来说明容量、功能或用处,但是在此被视为合适的、可能的或适当的。例如,在一些情境下,需要某些事项或容量,但是在另外的情境下,它们可能不会出现。这些区别由“也许”、“可能”、“可”、“可以”等词来表示。
本发明中,“杀菌”及其类似表达表示依据本发明方法处理含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器时,存在于待处理的含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器中的至少一种活性生物污染物或病原体的减少。
本发明中,“生物污染物或病原体”指的是在与含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器直接或非直接接触时,会对含有葡萄糖氧化酶的膜或其使用环境产生有害影响的生物污染物或病原体。生物污染物或病原体包括各种细菌、真菌和病毒等。
本发明中提及的“活性生物污染物或病原体”是指能单独或与其他因素一起对含有葡萄糖氧化酶的膜和/或其使用环境产生有害影响的生物污染物或病原体,其他因素的示例如第二生物污染物或病原体、天然蛋白质(野生或变异)或抗体。
在一些实施例中,其使用环境可为生物传感器运行和细胞生长的生物反应器。如果生物传感器未被杀菌,存在于生物传感器和/或含有葡萄糖氧化酶的膜中的“生物污染物或病原体”可能污染生物反应器中培养的细胞并造成细胞培养的失败。
含有葡萄糖氧化酶的膜可能是任何含有葡萄糖氧化酶的膜。在一些实施例中,含有葡萄糖氧化酶的膜是任意一种含有葡萄糖氧化酶并可被用于,例如,测试葡萄糖的水平的生物传感器的膜,这些膜可通过商业渠道从美国马萨诸塞州Waltham的NOVA Biomedical公司、美国俄亥俄州Yellow Springs的YSI Incoporated and Xylem,Inc.公司、中国山东科学院生物研究所等购得。
在一些实施例中,用于检测葡萄糖水平的生物传感器包含复合电极以及含有葡萄糖氧化酶的膜。其中复合电极包含两个电极,以及介于两电极之间的绝缘体。电极可由例如铂和/或银/氯化银制成。可在杀菌之前或之后将含有葡萄糖氧化酶的膜安装于生物传感器中。若在杀菌之前将含有葡萄糖氧化酶的膜安装于生物传感器中,在一些实施例中,可于安装后在含有葡萄糖氧化酶的膜浸入磷酸盐缓冲溶液中的情况下通过用伽马射线照射来对生物传感器进行杀菌。
伽马射线可由钴或铯的同位素产生。施加伽马射线的有效比率可以为:既能有效为含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器杀菌,又能将其对含有葡萄糖氧化酶的膜的损害控制在可接受范围内。合适的伽马射线比率可根据特性作相应调整,例如特定的含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器,和/或要被杀灭的特定的生物污染物或病原体的属性和特征。在杀菌过程中,保持伽马射线的比率稳定更为适宜。若无法达到此要求或并无需要,可以使用可变的或间断的射线。
在一些实施例中,可根据如使用的生物物质而优化伽马射线的施加比率。低(≤3kGy/小时)和高(>3kGy/小时)都能达到效果。降低伽马射线的比率能减少对含有葡萄糖氧化酶的膜的损害,但是它也导致需要更长的放射时间以获取所需的特定总剂量。在一定环境中可能更需要较高的剂量比率,例如用以最小化物流问题和成本,以及在可能情况下,依据本发明所述,用来保护含有葡萄糖氧化酶的膜避免受到放射的损害。根据本发明的一实施例,伽马射线的放射比率为20kGy/小时。
在一些实施例中,对含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器进行的伽马射线放射应保持一段有效时间以达到杀菌目的。与放射比率相应,合适的放射时间由用于含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器上的合适的放射剂量决定。合适的放射时间可依据特定的放射比率和/或含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器的属性和特质来作相应调整。
在一些实施例中,伽马射线放射的有效总剂量为:既能有效为含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器杀菌,又能将其对含有葡萄糖氧化酶的膜的损害控制在可接受范围内。合适的伽马射线的总剂量可根据一定特性作相应调整,例如特定的含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器的属性和特征,所用伽马射线的特定形式,和/或要被杀灭的特定的生物污染物或病原体。在一些实施例中,伽马射线的总剂量为至少约25kGy,在另一些实施例中,则在约25kGy到约40kGy的范围内。
在一些实施例中,伽马射线照射可以在任何不对含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器产生不利影响的温度进行,或者在任何不对含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器产生实质性损害的温度进行。
在一些实施例中,伽马射线的照射是在常温进行的。在一些实施例中,照射是在低温环境进行,例如低于常温的0℃,-20℃,-40℃,-60℃,-78℃或者-196℃。在一些实施例中,照射在高温环境进行,例如高于常温的37℃,60℃,72℃或者80℃。
在一些实施例中,照射在一个温度范围内进行,而不是在一个特定的温度值进行。
在一些实施例中,伽马射线照射可以在任何不对含有葡萄糖氧化酶的膜和/或生物传感器产生不利影响的气压中进行。在一些实施例中,照射在常压进行。
磷酸盐缓冲溶液是以水为基础的盐溶液,包含磷酸钠,在一些情况下,和/或氯化钠、氯化钾和磷酸钾。磷酸钠或磷酸钾可以为磷酸二钠/钾或者酸式磷酸钠/钾。一些磷酸盐缓冲溶液的成分包括钙或镁。在一些实施例中,磷酸盐缓冲溶液的pH值约为7。一种pH为7.4的示例磷酸盐缓冲溶液中的成分在下表1中列出。
表1
盐 | 浓度(mmol/L) | 浓度(g/L) |
氯化钠 | 137 | 8.01 |
氯化钾 | 2.7 | 0.20 |
二水磷酸氢二钠 | 10 | 1.78 |
磷酸二氢钾 | 2.0 | 0.27 |
在一些实施例中,磷酸盐缓冲溶液通过将磷酸盐缓冲粉末溶解于特定剂量,例如100mL,200mL,500mL或1000mL,的去离子水中来制备。在一些实施例中,磷酸盐缓冲粉末的示例成分在下表2中列出。
表2
化学名 | %重量 |
磷酸二钠 | 50-55 |
酸式磷酸钠 | 10-15 |
氯化钠 | 16-22 |
乙二胺四乙酸二钾 | <10 |
苯酸钠 | <10 |
庆大霉素硫酸(盐) | <1 |
从以下示例可以看出,安装有含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器在含有葡萄糖氧化酶的膜受到磷酸盐缓冲溶液的保护下进行杀菌后,其灵敏度高于含有葡萄糖氧化酶的膜未受保护的情况时的灵敏度。
实验示例
以下实验例子可以为本领域中具有一般技能的人实施该发明提供参考。但是,这些例子并不用于限制权利要求的范围。
干燥密封于铝箔袋中的含有葡萄糖氧化酶的膜由美国马萨诸塞州Waltham的NOVA Biomedical公司获得并且在使用前于4°C温度保存。在以下示例中,除非另有说明,都在常温常压下使用钴60放射源,伽马射线的用量为大约25kGy到大约40kGy。磷酸盐缓冲液的pH大约为7。
例1
用伽马射线照射4个铝箔袋中的含有葡萄糖氧化酶的膜以杀菌。其中两个含有葡萄糖氧化酶的膜的放射剂量比率为6kGy每小时,另外两个为20kGy每小时。
每一照射后的含有葡萄糖氧化酶的膜与一个复合电极相组合后获得一个生物传感器。其中复合电极由铂工作电极、银/氯化银参考或反电极,以及介于铂电极和银/氯化银电极之间的绝缘体组成。
将每一生物传感器浸入含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液中,然后通过电缆与电化学工作站相连接。电化学工作站施加于生物传感器的电压为0.6V。
逐渐增加磷酸盐缓冲液中的葡萄糖浓度,同时用电化学工作站读出每一浓度相应的电流。以葡萄糖浓度为横轴,相应电流为纵轴建立二维图表。图表中电流与葡萄糖浓度线的斜率用以表示生物传感器的灵敏度。
用上述所得灵敏度分别除以安装有未经伽马射线照射的含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器的灵敏度,得到如图1所示的归一化灵敏度。从图1可见,含有葡萄糖氧化酶的膜经6kGy每小时伽马射线照射后,与未经伽马射线照射的情形相比较,还剩下大约50%的灵敏度,但是经20kGy每小时伽马射线照射后,与未经伽马射线照射的情形相比较,仅剩不到20%的灵敏度。
例2
将来自中国山东省科学院生物研究所的用于生物传感分析仪(SBA-40C,中国山东省科学院生物研究所)的一包磷酸盐缓冲粉末溶解于500ml的去离子水中以得到磷酸盐缓冲溶液。
用伽马射线照射2份干燥密封于铝箔袋中的含有葡萄糖氧化酶的膜以杀菌。用伽马射线照射分别放置于小塑料容器里浸于1-2滴磷酸盐缓冲液中的另两份含有葡萄糖氧化酶的膜。照射每一含有葡萄糖氧化酶的膜的伽马射线比率为约20kGy每小时。
如上述例1中所述方法获得装有照射后的上述四份膜的生物传感器的灵敏度,并且除以安装有未经伽马射线照射的含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器的灵敏度,得到图2中所示归一化灵敏度。
从图2可看出,装有浸于磷酸盐缓冲液中时伽马射线照射后的含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器,与未经伽马射线照射的情形相比,还剩下大约80%的灵敏度,但是装有干燥密封于铝箔袋中时伽马射线放射后含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器,与未经伽马射线放射的情形相比,仅剩不到20%的灵敏度。
虽然结合特定的实施例对本发明进行了说明,但本发明不局限于这些具体情况,本领域的技术人员可以对本发明作出许多修改和变型。同时,要认识到,权利要求书意图覆盖在本发明真正构思范围内的所有这些修改和变型。
Claims (10)
1.一种为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,其特征在于:其包括:用伽马射线照射浸于磷酸盐缓冲溶液中的所述含有葡萄糖氧化酶的膜。
2.如权利要求1所述为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,其特征在于:伽马射线的剂量为大约25kGy到大约40kGy。
3.如权利要求1所述为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,其特征在于:伽马射线照射比率为大约20kGy/小时。
4.如权利要求1所述为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,其特征在于:浸在磷酸盐缓冲溶液中的所述含有葡萄糖氧化酶的膜位于塑料容器中。
5.如权利要求1所述为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,其特征在于:浸在磷酸盐缓冲溶液中的所述含有葡萄糖氧化酶的膜位于生物传感器中。
6.如权利要求5所述为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法,其特征在于:所述生物传感器包括铂电极和银/氯化银电极。
7.一种生物传感器,其特征在于:其包括以权利要求1中所述为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法杀菌的含有葡萄糖氧化酶的膜。
8.如权利要求7所述的生物传感器,其特征在于:其对于葡萄糖的灵敏度大约为装有未杀菌的含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器的80%。
9.如权利要求8所述的生物传感器,包含铂电极和银/氯化银电极。
10.一种装有含有葡萄糖氧化酶的膜的生物传感器,其特征在于:其通过后述方法杀菌:在所述含有葡萄糖氧化酶的膜浸于磷酸盐缓冲溶液中的情况下用伽马射线照射。
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