KR102393642B1 - 크로마토그래피 컬럼 살균 - Google Patents

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Abstract

예비-패킹된 플라스틱 크로마토그래피 컬럼을 적절한 수준의 감마선 조사로 살균한다면, 결과적인 살균된 크로마토그래피 컬럼은 충분한 패킹 매체 기능을 유지하며 또한 컬럼 기계적 특성 및 정격 압력을 유지한다.

Description

크로마토그래피 컬럼 살균{STERILIZING CHROMATOGRAPHY COLUMNS}
본 발명은 크로마토그래피 컬럼의 살균에 관한 것이다.
컬럼 크로마토그래피는 패킹된 매체의 정지형 "베드(bed)"가 단단한 튜브 또는 컬럼 내에 포함되는 분리 및/또는 정제 기술이다. 상기 패킹 매체는 고체["정지상(stationary phase)"] 또는 액체 정지상으로 코팅된 고체 지지 재료의 입자의 형태일 수 있다. 어느 쪽이든, 상기 패킹 매체는 전형적으로 컬럼 튜브의 내측 용적을 충전한다.
분리 크로마토그래피에 있어서, 액체 샘플["운동 상태(mobile phase)"]이 컬럼을 통과함에 따라, 샘플의 상이한 화합물은 이들이 운동 상태에 대해 느려지고 또한 상이한 속도로 컬럼을 통해 이동하도록, 상기 정지상과는 상이하게 연관될 수 있다. 따라서 상기 정지상과 더욱 연관되는 이들 화합물은 덜 관련된 것보다는 컬럼을 통해 더욱 서서히 이동하며, 이 속도 차이는 이들이 컬럼을 통과하여 컬럼을 빠져나갈 때 서로 분리되는 화합물로 나타난다.
친화성 크로마토그래피에 있어서, 패킹 매체는 액체 샘플에서 하나 또는 그 이상의 원하는 화합물 또는 분자에 특정하게 결합하는 항원, 항체, 또는 리간드(ligand)와 같은 결합체를 포함한다. 따라서 액체 샘플이 패킹 매체를 흐를 때, 오직 원하는 화합물 또는 분자만 컬럼에 남는다. 용출액(eluting liquid)의 패킹 매체를 통한 후속의 유동은 패킹 매체에 부착된 결합제로부터 원하는 화합물이나 분자를 분리시키거나, 또는 패킹 매체로부터 결합제를 분리시킨다. 어느 쪽이든, 원하는 화합물 또는 분자가 컬럼으로부터 세척되어, 용출액에 수집된다. 친화성 크로마토그래피는 무세포 추출액으로부터의 핵산 정제, 단백질 정제 및 혈액으로부터의 정제를 포함하는 많은 용도로 사용될 수 있다.
연속적인 처리 및 다품종 처리와 같은 바이오처리(bioprocessing)의 새로운 발전은 미생물 제어에 증가된 엄중함을 요구한다. 오염의 위험성을 감소시키기 위해, 세포 배양으로부터 하류 정제까지 살균 유동 경로가 요구된다. 따라서 높은 수준의 성능을 유지하는 1회용 살균 컬럼을 제조할 수 있다면, 큰 유용성을 가질 것이다.
본 발명은 어떤 범위의 감마선으로, 예를 들어 8.0 내지 35 또는 40 kGy로 플라스틱 크로마토그래피 컬럼을 조사(照射)(irradiate)하였다면, 이들 컬럼은 살균 보증 수준(Sterility Assurance Level)(SAL)으로 살균되는 반면에, 여전히 상당히 유용한 기능을 유지하고 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초하고 있다. 예를 들어, 35 내지 40 kGy까지의 높은 수준의 조사 하에서도, 플라스틱 컬럼은 조사에 이어 그 초기의 예비-감마선 압력 정격 및 기계적 특성을 유지한다. 또한, 공유결합된 친화성 리간드, 예를 들어 고정화된 단백질 A를 포함하는 패킹 매체를 내장한 컬럼은, 여기에 기재되는 살균법으로 처리된 후 적절한 성능을 유지한다. 여기에 기재된 방법은 조사 중 패킹 매체를 보호하기 위해 컬럼 내에 충전되는 보호 용액에, 특정 첨가제를 포함함으로써, 전형적으로 조사에 의해 유발될 수 있는, 패킹 매체를 수정하는데 사용되는 결합제의, 예를 들어 단백질 A의, 친화성 포착 성능의 임의의 감소를 억제하거나 피한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 크로마토그래피 컬럼을 제조 및 패킹하고, 그 후 여기에 인용되는 특정 기술 및 매개변수를 사용하여 이들 컬럼을 살균하는 방법을 특징으로 한다. 이들 방법은 (a) 예를 들어, 패킹 매체의 원하는 용적을 수용하기 위해 적절한 내경 및 길이를 갖는, 플라스틱 재료 또는 다른 적절한 탄성 재료의 컬럼 튜브를 선택하는 단계; (b) 예를 들어 아가로스(agarose) 또는 실리카 비드와 같은 패킹 매체, 또는 예를 들어 전체-길이 야생형 포도상구균 단백질 A(Staphylocuccus protein A)(SpA) 또는 단백질 A의 재조합 형태인, 예를 들어 단백질 A와 같은 기능화제(functionalizing agent) 또는 결합제에 공유결합된 임의의 다른 적절한 크로마토그래피 패킹 매체를 추가하는 단계; (c) 매체의 밀봉된 패킹된 베드를 얻기 위해, 튜브 내에 예를 들어 "압입(press fit)" 또는 "억지 끼워맞춤(interference fit)"으로서 적용될 수 있는 캡이나 밀봉부로 튜브를 폐쇄함으로써, 패킹된 매체를 튜브 내의 패킹된 베드로서 둘러싸는 단계; (d) 예를 들어 플라스틱 백(bag), 실린더, 또는 박스와 같은 기밀성 및 수밀성 용기 내에 패킹된 컬럼을 선택적으로 둘러싸거나 또는 밀봉하는 단계; 및 (e) 적어도 8 kGy로부터 약 35 또는 40 kGy, 예를 들어 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 33, 35, 또는 40 kGy의 감마선 투여량(dose)으로 용기 내의 컬럼을 조사하는 단계를 포함한다.
그 후, 선택적으로 여전히 기밀형 용기 내에 있는 컬럼은 조사원으로부터 제거되고, 또한 밀봉된 용기 내로 이송될 수 있으며, 이에 따라 컬럼의 내부 살균 및 외부 살균을 유지한다. 상기 기밀형 또는 수밀형 용기는 컬럼의 외면이 살균으로 유지될 필요가 있는 경우에만 요구된다. 이런 용기가 없더라도, 컬럼의 입구 및 출구가 밀봉된 상태로 유지된다면, 살균된 컬럼의 내부 및 패킹 매체는 살균된 상태로 유지될 것이다.
이러한 수준의 조사는 살균 보증 수준(SAL)의 관점에서 기재될 수 있는 살균 패킹된 컬럼을 생산한다. 상기 SAL 은 단일 유닛, 즉 단일의 패킹된 컬럼이 살균에 노출된 후 비-살균될 가능성이며, 또한 상기 SAL 은 조사 전에 조사 투여량 및 재료의 고유의 바이오버든(bioburden)에 의존한다. 여기에 기재되는 컬럼 성분과 같은 낮은 바이오버든을 갖는 물품은, 25 kGy의 투여량을 사용할 때, 10-6 유기체/유닛의 살균 보증 수준을 달성할 것이며, 이는 비교적 높은 수준의(살균된 100만 개의 유닛 중 오직 하나의 유닛, 예를 들어 하나의 컬럼만 비-살균되는) 살균이다. 조사 전에 패킹된 컬럼 상에 높은 초기 바이오버든이 있다면, 이와 동일한 SAL 을 달성하기 위해 높은 수준의 감마선, 예를 들어 30 내지 40 kGy가 사용될 수 있다. 다소 낮은, 여전히 유용한 수준의 살균은 8 kGy의 투여량을 사용할 때 달성될 수 있다(단일-사용 시스템의 조사 및 살균 검증에 대한 가이드, 바이오프로세스 인터내셔널, 2008, 및 그 내용물 참조). 다른 수준은 10-4 유기체/유닛 및 10-5 유기체/유닛을 포함한다.
이들 방법의 다양한 실시에 있어서, 플라스틱 재료는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 아세탈, 유리-충전된 플라스틱, 탄소 충전된 플라스틱, 유리-섬유 플라스틱, 또는 탄소-섬유 플라스틱을 포함할 수 있다. 패킹 매체는 아가로스, 실리카, 세라믹, 또는 아크릴레이트나 셀룰로오스 기반 재료의 폴리머를 포함할 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 패킹 매체는 이온 교환 그룹; 소수성 및 하전된(charged) 특성을 지는 다모드(multimodal) 그룹; 금속 킬레이트(chelate) 그룹; 소수성 그룹; 또는 면역글로불린 IgG과 결합할 수 있는 포도상구균 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 중 하나 또는 그 이상으로 기능화될 수 있다. 예를 들어, 상기 이온 교환 그룹은 4급 아민, 황산염, 카르복실레이트 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 또한 소수성 그룹은 프로필, 옥틸, 및 페닐 그룹 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
또한, 다양한 실시에 있어서, SpA 폴리펩티드는 전체-길이(full-length) 야생형 SpA, 재조합물 SpA, SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 SpA 도메인을 포함하는 모노머 SpA 폴리펩티드, 또는 SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 SpA 도메인을 임의의 조합으로 포함하는 멀티머(multimer) SpA 폴리펩티드, 또는 그 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, SpA 폴리펩티드는 멀티머 SpA 폴리펩티드일 수 있으며, 예를 들어 멀티머 SpA 폴리펩티드는 SpA 도메인 B, C, 및 Z로부터 선택되는 4개 또는 5개의 SpA 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 모든 SpA 도메인은 동일할 수 있으며, 모두 3개, 4개, 또는 5개의 SpA 도메인은 C 도메인일 수 있다.
다양한 실시에 있어서, 여기에 기재된 살균 컬럼 생산 방법은 적절한 크기의 제1 및 제2 유동 분배기를 선택하는 단계; 제1 유동 분배기를 튜브의 제1 단부에 영구적으로 고정하는 단계; 패킹 매체를 컬럼 튜브 내에 추가한 후, 컬럼 튜브 내로 제2 유동 분배기를 구동시켜 예를 들어 억지 끼워맞춤을 설정하고, 그에 따라 제1 및 제2 유동 분배기 사이의 튜브 내에 밀봉된, 예를 들어 유체 정역학적으로 밀봉된, 챔버를 형성하는데 충분히 효과적인 후프 텐션(hoop tension)을 유도하도록 축방향 힘을 적용함으로써 튜브의 제2 단부 내로 제2 유동 분배기를 삽입하는 단계; (ⅰ) 컬럼 튜브 내의 원하는 위치에 도달할 때까지 제2 유동 분배기에 추가적인 축방향 힘을 적용함으로써, 또는 (ⅱ) 유압력을 적용하여 제2 유동 분배기를 다시 튜브의 제2 단부를 향해 이동시키도록 챔버 내로 액체를 가압함으로써, 또는 상기 (ⅰ)와 (ⅱ)의 임의의 조합에 의해, 튜브 내에서 제2 유동 분배기의 길이방향 위치를 조정하는 단계; 및 상기 제2 유동 분배기가 적절히 위치되었을 때, 제2 유동 분배기를 튜브 내로 영구적으로 고정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 적어도 제2 유동 분배기(또는 제1 및 제2 유동 분배기 모두)는 튜브의 내경 보다 큰, 예를 들어 튜브의 내경 보다 약 0.25 내지 5.0% 큰 직경을 갖는다.
어떤 실시에 있어서, 패킹 매체는 적절한 버퍼(buffer)로 약 40% 내지 약 70% 고체를 포함하는, 슬러리일 수 있다. 일단, 패킹 매체가 컬럼 내로 패킹되면, 보호 용액이 추가될 수 있다. 상기 보호 용액은 패킹된 매체의 기능적 특성에 영향을 끼칠 수 있는 버퍼 또는 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기에 기재되는 바와 같이, 보호 용액에 낮은 퍼센트(V/V)로 추가된 방향족 알코올은 단백질 A와 같은 결합제로 기능화된 감마선 살균 패킹된 매체의 친화성 포획 성능을 보존할 수 있다.
다양한 실시에 있어서, 컬럼의 패킹 매체에 추가된 보호 용액은 알코올의 0.1 내지 25.0 퍼센트(용적/용적)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에 있어서, 상기 보호 용액은 알코올의 0.1 내지 5.0 퍼센트(용적/용적)를 포함하며, 상기 알코올은 벤질 알코올과 같은 방향족 알코올을 포함한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 보호 용액은 알코올의 2.0 내지 25.0 퍼센트(용적/용적)를 포함하며, 상기 알코올은 에탄올과 같은 지방족 1급 알코올을 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 살균 크로마토그래피 컬럼 자체를 특징으로 한다. 이들 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼은 (a) 2개의 단부를 갖는 살균 중공 튜브; (b) 상기 튜브 내의 살균 패킹된 크로마토그래피 매체를 포함하며, 상기 패킹된 컬럼은 10-3 유기체/컬럼의 살균 보증 수준(SAL)을 갖는다. 일부 실시에 있어서, SAL 은 10-6 유기체/컬럼이다.
이들 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼에 있어서, 크로마토그래피 컬럼은 튜브, 제1 유동 분배기, 및 제2 유동 분배기를 포함하며, 또한 이들 부품들은 동일한 또는 상이한 플라스틱 재료로 각각 제조될 수 있다. 플라스틱 재료는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 아세탈, 유리-충전된 플라스틱, 탄소 충전된 플라스틱, 유리-섬유 플라스틱, 또는 탄소-섬유 플라스틱 중 하나 또는 그 이상, 또는 탄소-섬유 플라스틱을 포함할 수 있다.
다양한 실시예에 있어서, 컬럼의 패킹 매체는 아가로스, 실리카, 세라믹, 또는 아크릴레이트나 셀룰로오스-기반 재료의 폴리머를 포함할 수 있다. 어떤 실시에 있어서, 패킹 매체는 이온 교환 그룹; 소수성 및 하전된 특성을 지는 다모드 그룹; 금속 킬레이트 그룹; 소수성 그룹; 또는 면역글로불린 IgG과 결합할 수 있는 포도상구균 단백질 A(SpA) 폴리펩티드 중 하나 또는 그 이상으로 기능화될 수 있다. 예를 들어, 상기 이온 교환 그룹은 4급 아민, 황산염, 및 카르복실레이트 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있으며, 또한 소수성 그룹은 프로필, 옥틸, 및 페닐 그룹 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시예에 있어서, SpA 폴리펩티드는 전체-길이 야생형 SpA, 재조합물 SpA, SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 SpA 도메인을 포함하는 모노머 SpA 폴리펩티드, 또는 SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 SpA 도메인을 임의의 조합으로 포함하는 멀티머 SpA 폴리펩티드, 또는 그 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, SpA 폴리펩티드는 예를 들어 SpA 도메인 B, C, 및 Z로부터 선택되는 4개 또는 5개의 SpA 도메인을 포함하는, 멀티머 SpA 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, SpA 도메인은 모두 동일할 수 있으며, 예를 들어 멀티머 SpA 폴리펩티드는 3개, 4개, 또는 5개의 SpA 도메인 C를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에 있어서, 튜브의 2개의 단부는 억지 끼워맞춤을 제공하기 위해 튜브의 내경 보다 미세하게 큰 외경을 갖는 유동 분배기에 의해 폐쇄된다. 또한, 여기에 기재되는 임의의 실시예 및 실시에 있어서, 컬럼은 여기에 기재되는 바와 같이 조사 전에 기밀성 및 수밀성 용기 내에 밀봉될 수 있다. 또한, 컬럼은 감마선 조사 전에 포위체(enclosure)의 이중층을 제공하기 위해 제2 기밀성 및 수밀성 용기 내에 추가로 밀봉될 수도 있다. 따라서 최종 제품은 기밀성 및 수밀성 용기 내에 밀봉되는, 살균 예비-패킹된 플라스틱 크로마토그래피 컬럼이다. 이들 고-기능성 및 경제적인 컬럼은 1회용으로 간주될 수 있지만, 그러나 복수회 재사용될 수 있는 기능적 일체성을 갖는다.
일부 실시에 있어서, 본 발명은 제1 단부 및 제2 단부를 갖는 살균 중공 튜브; 튜브의 제1 단부에 고정되는 살균성 제1 유동 분배기; 튜브의 내경 보다 큰 외경을 갖는, 살균성 제2 유동 분배기; 및 제1 및 제2 유동 분배기 사이에서 튜브에 충전되는 살균 패킹 매체를 포함하며, 상기 제2 유동 분배기는 패킹 매체로 충전되는 제1 및 제2 유동 분배기 사이에서 중공 튜브 내에 챔버를 형성하기 위해 튜브의 제2 단부 내에 고정되며, 상기 패킹된 크로마토그래피 컬럼은 10-3 또는 10-6 유기체/컬럼의 살균 보증 수준(SAL)을 갖는, 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼을 특징으로 한다.
이들 살균 크로마토그래피 컬럼의 패킹 매체는 감마선으로 조사되지 않은 컬럼에서 동일한 타입의 패킹 매체의 특정한 흡착 수준의 적어도 60%의 특정한 흡착 수준을 가질 수 있다. 또한, 다양한 실시예에 있어서, 패킹 매체는 방향족 알코올의 0.5 내지 5.0 퍼센트(용적/용적) 또는 지방족 1급 알코올의 2.0 내지 25 퍼센트(용적/용적)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 패킹 매체는 벤질 알코올의 0.5 내지 3.0 퍼센트(용적/용적) 또는 에탄올의 2.0 내지 20 퍼센트를 포함할 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 플라스틱 튜브는 제1 단부에 모따기(chamfer)를 형성하기 위해 증가된 단부 직경(DTe)을 추가로 가지며, 제1 유동 분배기는 DTi 보다 큰 외경(Dfd)을 가지며, 상기 제1 유동 분배기는 충분히 유도된 후프 텐션으로 나타나는 억지 끼워맞춤으로 직접적으로 튜브의 제1 단부 내에 고정된다. 어떤 실시예에 있어서, 제1 유동 분배기는 튜브에 영구적으로 접합되거나, 또는 제1 및 제2 유동 분배기 모두는 용접 조인트와 같은 영구적 접합부로 튜브의 내벽에 고정될 수 있다.
어떤 실시예에 있어서, 컬럼 또는 튜브의 챔버 내에 패킹 매체를 포함하는 신규한 크로마토그래피 컬럼은, 유체 정역학적으로 밀봉될 수 있다. 어떤 실시예에 있어서, 챔버는 평방 인치 당 적어도 50 파운드의 내압에 견디도록 구성된다. 일부 실시예에는 이들 특징 3개 모두가 제공된다. 일부 실시예에 있어서, 플라스틱 튜브 및 제2 유동 분배기는 동일한 타입의 플라스틱으로 제조되며, 그리고 제1 유동 분배기는 튜브의 일체형 특징부이다.
여기에 사용되는 바와 같이, "플라스틱(plastic)"이라는 용어는, 열경화성 플라스틱[예를 들어, 에폭시 수지 및 섬유[예를 들어, 유리, 금속(예를 들어, 스테인리스 스틸), 또는 탄소 섬유)] 보강된 플라스틱]뿐만 아니라, 열가소물[예를 들어 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS)], 아크릴[예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리올레핀, 폴리프로필렌(PP), 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리카보네이트], 및 2개 또는 그 이상의 상이한 타입의 플라스틱 및/또는 폴리머 재료로 제조되는 다양한 플라스틱 합성물과 같은 다양한 폴리머 재료로 제조되는 크로마토그래피 컬럼 또는 크로마토그래피 컬럼의 성분을 지칭한다.
여기에 사용되는 바와 같이, "베드 높이(bed height)"라는 용어는 완성된 크로마토그래피 컬럼 내에 포함되는 패킹 매체의 베드의 선형 높이를 지칭한다.
여기에 사용되는 바와 같이, "패킹 매체(packing medium)"는 나중에 컬럼에 "패킹 베드(packing bed)"를 형성하는 불규칙형 또는 구형 입자의 형태인 고체 재료의 슬러리 또는 현탁액이다. 상기 패킹 매체는 실리카, 세라믹, 아가로스, 아크릴, 또는 셀룰로오스 폴리머와 같은 다양한 재료로 제조될 수 있다. 상기 고체 재료는 예를 들어 이온성, 소수성, 또는 특정한 친화성 특징부를 제공하는 분자형 특징부로(예를 들어, 항체 또는 단백질 A와 같은 결합제로) 기능화될 수 있다.
여기에 사용되는 바와 같이 "패킹된 베드(packed bed)"는 크로마토그래피 컬럼 내의 크로마토그래피 패킹 매체의 최종 상태를 지칭한다. 이런 최종 상태는 다양한 방법으로 달성된다. 예를 들어, 하나의 방법은 베드의 축방향 압축에 의해 이어지는 유체 유동을 하나 또는 2개의 유동 분배기에 의해 조합하는 것이다. 본 기술분야에 알려진 다른 방법은 입자의 중력 침전, 진동 침전, 및/또는 기계적 축방향 단독 압축을 포함한다. 패킹에 이어, 패킹된 베드는 전형적으로 항균성 첨가제를 포함하는 보호 용액에서 수화된 상태로 존재한다. 여기에 기재되는 바와 같이, 이런 보호 용액은 하나 또는 그 이상의 버퍼 또는 감마선 조사의 치명적인 효과에 대해 기능화된 고체 지지의 일체성 또는 성능을 보호하는 것을 도울 수 있는 다른 첨가제도 포함할 수 있거나 또는 대안적으로 이들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 보호 용액은, 조사 후 매체의 크로마토그래피 성능의 보존을 강화하기 위해, 에탄올 또는 벤질 알코올과 같은 지방족 또는 방향족 알코올, 또는 당 알코올과 같은 폴리올의 낮은 퍼센트(V/V)를 포함할 수 있다.
여기에 사용되는 바와 같이, "베드 지지체(bed support)"는 패킹된 베드를 포함하는 패킹 매체의 작은 입자를 아직 보유하고 있는 다양한 액체의 통과를 허용하는, 네트, 스크린, 메시, 또는 프릿(frit)이다.
여기에 사용되는 바와 같이 "영구 접합제(permanent bond)" 및 "영구적으로 접합되는(permanently bonded)"이라는 용어는, 2개의 부품 사이의 이런 접합이 접합을 파괴하거나 또는 접합된 부품(예를 들어, 튜브와 유동 분배기) 중 하나 또는 모두를 파괴하는 것 이외는 분리될 수 없는 것을 나타내는데 사용된다.
여기에 기재된 신규한 방법 및 시스템은 많은 이점 및 이익을 제공한다. 예를 들어, 신규한 방법은 완전히 주문제작 가능하고 또한 가변형 베드 높이 및 직경을 구비하며 또한 원하는 SAL 을 구비한 예비-패킹된 1회용 컬럼의 준비를 가능하게 하며, 완전히 기능적인 패킹 매체를 여전히 갖고 있다. 여기에 기재된 감마선 조사 방법은 패킹 매체 또는 결합제의 성능을 상당히 감소시키지 않으며 또한 임의의 오염물을 생성하거나 추출하지 않으며 또는 표준 수성 버퍼에 사용한 후 이런 오염물이 크로마토그래피 컬럼을 조립하는데 사용되는 재료로부터 침출되게 하지 않는다는 것은 놀라운 일이다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기재된 바와 유사하거나 또는 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 아래에 기재된다. 여기에 언급된 모든 간행물, 특허 출원서, 특허, 및 다른 참조물은 그 전체가 참조 인용된다. 분쟁의 경우에, 정의를 포함하는 본 발명이 제어할 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 하나 또는 그 이상의 실시예의 세부사항은 이하의 첨부한 도면 및 상세한 설명에 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명, 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 여기에 기재되는 크로마토그래피 컬럼 중 하나의 개략적인 도면이다.
도 2a는 도 1의 컬럼의 개략적인 횡단면도이다.
도 2b는 도 1의 컬럼의 개략적인 분해 횡단면도이다.
도 3a는 컬럼 튜브의 개략적인 도면이다.
도 3b는 횡단면으로 도시된 컬럼 튜브의 개략적인 도면이다.
도 4a-4c는 여기에 기재된 신규한 크로마토그래피 컬럼에 사용될 수 있는 유동 분배기의 일 예의 평면도, 정면도, 및 저면도의 각각의 개략적인 도면이다.
도 5는 횡단면으로 도시된 컬럼 튜브 내로 삽입 직후 유동 분배기의 개략적인 도면이다.
도 6은 상부 유동 분배기에 축방향 힘을 적용하고, 이를 컬럼 튜브 내로 구동시켜, 횡단면으로 도시된 타이트한 억지 끼워맞춤을 제공하는데 사용되는 압력 내의 컬럼 튜브의 개략적인 도면이다.
도 7은 상부 유동 분배기가 제 위치에 용접된 후, 크로마토그래피 컬럼의 개략적인 도면이다.
도 8은 여기에 기재되는 크로마토그래피 컬럼 중 하나의 제조 시 기본적인 단계의 흐름도이다.
도 9a는 억지 끼워맞춤을 형성하기 위해, 모따기된 단부를 구비한 튜브 내로 유동 분배기를 가압할 때 발생되는 힘의 개략적인 도면이다.
도 9b는 억지 끼워맞춤을 형성하기 위해, 모따기를 구비한 튜브 내로 O-링을 구비한 유동 분배기를 가압할 때 발생되는 힘의 개략적인 도면이다.
도 10a는 억지 끼워맞춤이 형성된 후, 튜브 내로 유동 분배기를 가압할 때 발생되는 힘의 개략적인 도면이다.
도 10b는 억지 끼워맞춤이 형성된 후, O-링을 구비한 유동 분배기를 튜브 내로 가압할 때 발생되는 힘의 개략적인 도면이다.
도 11은 억지 끼워맞춤을 형성하기 위해, 유동 분배기를 튜브 내로 가압할 때 발생되는 힘의 예를 도시한 도면이다.
도 12는 튜브 내로 구동되는 유동 분배기의 개략적인 도면이다.
도 13은 감마선 조사된 폴리프로필렌과 비-조사된 폴리프로필렌의 물리적 외관을 도시하고 있다.
도 14a-14j는 물 및 에탄올에 노출 후, 비-조사된 부품과 조사된 부품에 대한 유지 시간 및 피크 영역을 도시한 도면이다.
도 15는 순수 폴리프로필렌과 조사된 폴리프로필렌의 인장 응력 스트레인 곡선을 도시한 도면이다.
도 16은 순수 폴리프로필렌과 조사된 폴리프로필렌의 인장 응력 스트레인 곡선(감소된 스트레인 범위)을 도시한 도면이다.
도 17은 순수 폴리프로필렌과 조사된 폴리프로필렌의 굴곡 응력 스트레인 곡선을 도시한 도면이다.
도 18은 순수 폴리프로필렌과 조사된 폴리프로필렌의 인장 응력 스트레인 곡선을 도시한 도면이다.
다양한 도면의 유사한 도면부호는 유사한 요소를 나타낸다.
여기에 기재되는 살균된 크로마토그래피 컬럼은 비교적 비싸지 않은 플라스틱 재료로 제조될 수 있으며, 따라서 1회용으로 간주될 수 있으며, 사용 시, 심지어 복수회 사용 시에도 충분히 강건하게 특별히 설계된다. 여기에 기재된 신규한 살균 방법은 원하는 살균 보증 수준(SAL)을 제공하며, 따라서 요구된 정격 압력 및 기계적 특성뿐만 아니라 패킹된 매체의 적절한 기능성을 유지하면서, 크로마토그래피 컬럼을 현재 유용한 크로마토그래피 컬럼 보다 더욱 유용하게 한다. 따라서 신규한 살균된, 예비-패킹된, 1회용 컬럼은 무균 또는 살균 제조 공정, 예를 들어 단백질 정제 공정에 사용할 준비가 되어 있다. 일반적으로 이온화 방사선이 히드록실 라디칼 또는 일중항 산소(singlet oxygen)와 같은 방사성 산소 종을 통해 폴리펩티드를 포함하는 재료를 열화시킬 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 이들 성능 결과는 놀라운 것이다.
본 발명의 실시예는 컬럼에 크로마토그래피 매체의 패킹된 베드를 포함하는 조성물 및 살균인 단백질 정제 시스템에 사용하기 위한 적절한 연결부를 포함하며, 또한 정제 공정에 사용될 수 있다. 예는 감마선 조사에 의한 살균 후라도 크로마토그래피 성능을 유지하는 크로마토그래피 컬럼을 위한 재료를 나타내고 있다. 예는 예를 들어 살균성을 달성하기에 충분한 감마선 조사 후, 적절한 분리 성능을 유지하는 친화성 기반 분리를 달성하도록 기능화된, 실리카 및 아가로스와 같은 복수의 고체 지지 타입의 컬럼 패킹 매체를 추가로 나타낸다. 다른 예는, 컬럼 재료로부터 추출 가능하거나 또는 침출 가능한 오염물을 증가시키기 위해, 컬럼 구성 재료가 감마선 조사에 의해 악영향을 받지 않음을 나타내고 있다. 또한, 예는 생물 약제학적 정제 공정에 통상적으로 사용되는 바이오로직 분리에 사용하기 적합한 형태로 살균된 조성물을 달성하는 수단을 제공한다.
크로마토그래피 컬럼 살균
신규한 살균된 크로마토그래피 컬럼은 여기에 정의되는 바와 같은 플라스틱으로 제조되며, 따라서 광범위하게 사용 가능한 플라스틱/열가소물 및/또는 조성물[폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 폴리아미드(다양한 나일론과 같은), 아세탈, 유리-충전된, 금속-충전된, 또는 탄소-충전된 플라스틱, 예를 들어 유리-섬유, 강철-섬유, 및 탄소-섬유 플라스틱과 같은] 또는 엘라스토머 부품으로부터 완전히 제조될 수 있으며, 또한 감마선에 의해 원하는 SAL로 살균될 수 있다. 물론, 이들 재료는 잠재적으로 너무 많은 감마선 투여량에 의해 손상될 수 있다. 또한, 패킹 매체 및 기능화 재료, 예를 들어 결합제는 부적절한 조사 수준에 의해 손상될 수도 있다. 따라서 컬럼 패킹 매체의 기능적 성능, 컬럼 기계적 특성, 및 정격 압력을 여전히 유지하면서, SAL 가이드라인에 부합하도록 충분히 살균된 예비-패킹된 1회용 크로마토그래피 컬럼이 제조될 수 있다는 것이 놀라웠다. 또한, 조사는, 표준 수성 버퍼에 사용 후, 통상적으로 사용되는 유동 분배기 솔벤트에 의해 상당한 오염물이 추출되게 하지 않거나 또는 재료로부터 침출되지 않게 하는 것이 놀라웠다.
일반적으로, 컬럼은 실리카, 아가로스, 세라믹, 또는 다른 폴리머 백본(backbone)을 구비한 임의의 다양한 패킹 매체로 패킹되며, 이들은 예를 들어 친화성 리간드 또는 결합제(예를 들어, 재조합물 자연 구조, 또는 가공된 기능적 도메인과 같은 단백질 A 리간드), 이온 상호작용 리간드, 혼합 모드 리간드, 및 소수성 리간드 중 하나 또는 그 이상의 타입으로 기능화될 수 있다. 일반적으로, 단백질 A 리간드는 전체-길이 야생형 포도상구균 단백질 A(SpA), 단백질 A의 재조합물[예를 들어 페이서(Peyser) 등에 허여된 미국 특허 제7,691,608호에 기재된 바와 같은], 또는 예를 들어 도메인 A, B, C, D, E, 또는 단백질 Z[예를 들어, 스펙터(Spector)에 허여된 미국 특허 제8,592,555호 및 홀(Hall) 등에 허여된 미국 특허 제8,329,860호에 기재된 바와 같이] 중 임의의 하나 또는 조합으로부터 선택되는 SpA 중 임의의 하나, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상을 포함하는 모노머 또는 멀티머 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 멀티머 폴리펩티드는 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 도메인으로부터 제조될 수 있으며, 이들 모두는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어 멀티머 단백질은 펜타 C 폴리펩티드를 형성하기 위해 5개의 SpA C 도메인을 포함할 수 있다.
컬럼 및 패킹 매체에 대한 추가적인 세부사항 및 크로마토그래피 컬럼의 어떤 실시예를 조립하는 방법이 이하에 제공된다.
일단 컬럼이 패킹되면, 패킹 매체는 보호 용액으로 보호하기 위해 수화된 상태로 유지되며, 이는 여기에 기재되는 바와 같이 예를 들어 티올 그룹(예를 들어, 시스테인) 및 지방족 탄소 상의 히드록시 그룹(예를 들어, 에탄올)과 같은 화학 그룹을 포함하는 어떤 성분을 포함하도록 설계된다. 또한, 상기 보호 용액은 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 화합물을 포함하는 다른 알코올을 포함할 수 있다.
지방족 화합물이 때로는 방사선 증감제(radiosensitizer)로 되어 방사선 손상을 증가시키는 것으로 밝혀졌지만, 지방족 알코올, 벤질 알코올을 사용하는 본 방법은 크로마토그래피 매체 상에 부동화된 단백질 A 폴리펩티드에 대해 매우 보호되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 낮은 퍼센트(V/V), 예를 들어 지방족 알코올(예를 들어, 에틸 및 이소프로필), 방향족 알코올[예를 들어, 벤질, 트립토폴, 티로솔, 및 펜틸 알코올(페닐레탄올)]과 같은 알코올, 또는 당 알코올(소르비톨 및 만니톨)과 같은 폴리올과 같은, 알코올의 낮은 퍼센트(V/V), 예를 들어 1 내지 25%, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 23, 또는 25%를 포함하는 보호 용액에 조사되었을 때, 임의의 기능화제, 예를 들어 단백질 A와 같은 여기에 기재되는 결합제 또는 리간드뿐만 아니라, 패킹 매체의 기능적 성능이 보존될 수 있다.
일단 알코올이 패킹 매체 및 보호 용액으로 충전되고 또한 유동 분배기가 컬럼 튜브에 고정되었다면, 전체 예비-패킹된 컬럼은 기밀성 및 수밀성 용기, 예를 들어 백, 실린더, 또는 플라스틱, 고무, 또는 가요성이거나 단단할 수 있으며 또한 살균된 컬럼 내측으로 용이하게 이송될 수 있는 다른 재료의 박스 내로 선택적으로 포위된다. 상기 용기는 파열 없이 이송을 허용하도록, 살균된 예비-패킹된 컬럼을 용기 내에 살균 상태로 유지하도록 충분히 강건하게 설계된다. 일부 경우에 있어서, 컬럼은 용기의 추가 없이 살균된 상태로 남아 있다.
일단 용기에 포위되었다면, 전체 용기 및 예비-패킹된 컬럼 내측은 원하는 SAL 을 제공하기 위해 감마선의 투여량으로 조사된다. SAL의 일반적인 개념은 그 전체가 여기에 참조 인용된 바이오프로세스 인터내셔널, 10-22(2008년 5월)의 "단일-사용 바이오프로세스 시스템의 조사 및 살균 확인에 대한 안내(Guide to Irradiation and Sterilization Validation of Single-Use Bioprocess Systems"에 기재되어 있다. 감마선 투여량은 흡수된 방사선 에너지를 계량화하는 킬로그레이(kilogray)(kGy) 유닛에서 측정된다. 1 그레이(gray)는 1 킬로그램의 물질에 의한 1 주울의 방사선 에너지의 흡수이다(1 kGy = 1 joule/gram). 낮은 바이오버든 수준을 제거하고 10-3 유기체/유닛의 살균 수준을 제공하기 위해서는, 적어도 8 kGy의 투여량이 일반적으로 적절하다. 10-6 유기물/유닛의 수준은 전형적으로 적어도 25 kGy의 투여량을 사용하여 얻어질 수 있다. 그러나 너무 많은 감마선 투여량은 컬럼 패킹 매체의 기능성, 및 심지어 컬럼 자체를 파괴할 수 있다. 따라서 예비-패킹된 컬럼을 위한 감마선의 수준은 적어도 8.0 kGy이어야 하며, 또한 약 35 kGy 또는 그 이상까지 일 수 있으며, 예를 들어 조사 수준은 약 8 내지 40 kGy, 예를 들어 8, 12, 15, 17.5, 20, 22.5, 25, 27.5, 30, 32.5, 33, 35, 38, 및 40 kGy의 투여량으로부터 선택된다.
이런 방사선 투여량은, 예를 들어 조사된 제품 전체를 통해 이온화(전자 붕괴)를 생산하는 동위원소 소스(예를 들어, 코발트 60)로부터 방출되는 고주파 광자(photon)로 달성될 수 있다. 예를 들어, 패킹된 컬럼이 밀봉되는 용기는 원하는 SAL 을 달성하기 위해 충분한 시간 동안 방사선 소스에 노출되는 챔버 내에 위치될 수 있다. 그 후, 여전히 기밀성 용기 내에 있는 컬럼은 방사선 소스로부터 제거되어, 밀봉된 용기 내로 이송될 수 있으며, 이에 따라 컬럼의 살균성을 유지한다. 제조 공정에 사용되는 다른 설비에 살균 연결 포트를 제공하는 밀봉된 배관 및 유로의 사용에 의해, 컬럼 유로(flow path)의 살균성이 박스 또는 백 용기의 외측에 유지될 수 있다. 컬럼 내의 살균성은, 부분적으로는 살균된 컬럼을 저장하는데 사용되는 용기의 특성에 따라, 장시간 사용, 예를 들어 1달, 2달, 또는 그 이상에 대해서도 유지된다. 이하의 예는 다양한 수준의 감마선 조사에 따라 컬럼 물리적 특성에 최소한의 변화가 있고, 또한 기계적 및 구조적 특성은 비-조사된 컬럼의 기계적 및 구조적 특성과 유사하다는 것을 나타내고 있다. 다른 예는 감마선 조사에 따라 크로마토그래피 매체의 기능적 성능이 매우 미세하게 변하고, 또한 상기 크로마토그래피 매체가 바이오로직 제조에 사용하기 적합한 방식으로 여전히 기능하고 있음을 나타내고 있다.
크로마토그래피 컬럼 및 패킹 매체
여기에 기재되는 크로마토그래피 컬럼은 주로 컬럼 튜브와 한 쌍의 유동 분배기(또는 하나의 유동 분배기 및 하나의 단부 캡)로 구성된다. 상기 유동 분배기는 원통형 디스크, 및 액체가 상기 디스크 내로 또한 디스크를 통해 흐를 수 있게 하는 하나 또는 그 이상의 입구/출구 파이프를 포함한다. 또한, 유동 분배기는 베드 지지체, 스크린, 및/또는 유동 분배기 디스크의 패킹 매체측에 부착되는 필터를 포함할 수 있다.
유동 분배기의 유로는 표준 관행 및 알려진 설계에 따라 설계될 수 있으며, 상기 유동 분배기 자체는 예를 들어 튜브와 동일하거나 상이한 재료로 제조될 수 있지만, 그러나 컬럼을 통해 흐를 리간드 및 반응물에 불활성인 금속, 세라믹, 다른 재료로 제조될 수도 있다.
튜브는 유체(예를 들어, 액체)가 제1 단부(예를 들어, 상단부)로부터 제2 단부(예를 들어, 하단부)로 흐르는 것을 허용하는, 중공의, 전형적으로 둥근, 실린더이다. 튜브의 내경은 유체를 튜브로 전달하고 또한 튜브로부터 유체를 제거하기 위해 유동 분배기를 수용하는 크기 및 구성을 갖는다. 다양한 크로마토그래피 컬럼 성능 사양에 기초하여, 상기 튜브는 다양한 상이한 크기 및 구성으로 제조될 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 튜브는 약 185 psi(예를 들어, 20, 30, 40, 50, 또는 60 psi) 정도까지의 내부 압력에 견딜 수 있으면서, 시스템의 유도된 내부 작동 압력 하에 구조적 일체성을 유지하는 크기 및 구성을 갖는다. 일부 실시예에 있어서, 튜브는 전형적으로 원통형이며, 또한 약 5 cm 내지 약 100 cm인 내경을 가지며, 또한 약 5 내지 90 cm의 길이를 갖는다.
일반적으로, 다양한 요소에 기초하여, 튜브의 전체적인 유도된 후프 텐션은 크로마토그래피 컬럼이 노출될 예상 내부 압력과 같은 최종 사용자의 사양에 기초하여 변할 수 있다. 컬럼의 조립 및 패킹 방법의 세부사항은 그 전체가 여기에 참조 인용된 US 2013/0193052호(WO 2013/116367호에 대응하는)에 기재되어 있다.
도 4a-4c는 일부 실시에 있어서 유동 분배기(24)가 제1 측부(28)를 따라 중심 영역에 형성된 피팅 구멍(26) 및 제2 측부(32)를 따라 형성된 복수의 홈 및 채널(30)의 시스템을 갖는 디스크형 부재인 것을 도시하고 있다. 상기 피팅 구멍(26)은 피팅을 수용하는 크기 및 구성을 갖는, 막힌 구멍이다. 피팅 구멍(26)은 피팅을 수용하기 위한 하나 또는 그 이상의 특징부를 포함한다. 특정한 일 실시에 있어서, 상기 피팅 구멍(26)은 나사형 피팅(예를 들어, M30×3.5 나사형 피팅)을 수용하도록 나선이 형성된다. 일부 실시예에 있어서, 피팅은 접착제, 용접, 바요넷 또는 루어(luer) 연결부, 또는 다른 충분한 연결 기술과 같은 다양한 다른 방법으로 유동 분배기(24)에 연결된다. 일부 실시예에 있어서, 피팅은 유동 분배기(24)의 일체형 부품으로서 제조된다. 또한, 유동 분배기(24)는 피팅 구멍(26)을 유동 분배기(24)의 제2 측부(32)에 유압식으로 연결하기 위해 유체 통로(34)를 포함하므로, 유체는 유동 분배기(24)의 제2 측부(32)와 상기 피팅 구멍(26) 내로 삽입된 피팅 사이를 통과할 수 있다.
유동 분배기(24)는 성형, 주조, 가공, 또는 다른 방법과 같은 다양한 제조 기술로 형성될 수 있으며, 또한 상용으로 얻어질 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 유동 분배기(24)의 일반적인 형상은 주조되거나 성형되며, 홈 및 채널(30)은 일반적인 형상으로부터 가공된다. 튜브의 내경과 밀착되어 결합하기 위해, 일부 실시예에 있어서, 유동 분배기의 외경은 외측 엣지가 둥글어서 견디는 것을 보장하고 또한 견디기 위해 선반(lathe)을 사용하여 형성된다.
상기 피팅은, 유체를, 유동 분배기 또는 상기 유동 분배기가 배치되는 튜브로 전달하거나 또는 유동 분배기 및 튜브로부터 유체를 제거하기 위해, 상기 유동 분배기에 부착되거나 고정될 수 있는 기계적 부착부이다. 유체를 전달하기 위해, 피팅은 그 중심 축선을 따라 피팅을 통해 형성되는 유체 전달 구멍을 갖는다. 또한, 상기 피팅은 피팅을 유지하기 위해 유동 분배기의 피팅 구멍에 수용될 하나 또는 그 이상의 특징부를 포함한다. 도 1, 2a, 및 2b에 도시된 바와 같이, 이 예에서, 피팅(38)은 피팅 구멍(26)에 결합하기 위해 나사형 단부(40)[예를 들어, M30×3.5 나사형 단부]를 갖는다. 또한, 상기 피팅(38)은 피팅(38)을 회전시키고 피팅 구멍(26) 내에 고정하기 위한 툴(예를 들어, 토오크 렌치)에 의해 파지될 수 있는 너트 부분(42)을 갖는다. 일부 실시예에 있어서, 피팅(28)은 접착제, 용접, 바요넷 또는 루어 연결부, 또는 다른 충분한 연결 기술과 같은 다른 타입의 연결 기구를 포함한다.
피팅(38)은 그 설치된 위치에 기초하여 상이한 추가적인 특징부를 가질 수 있다. 예를 들어, 상부 유동 분배기(24a)에 설치된 입구 피팅(38a)은 나사형 단부의 반대쪽인 피팅의 단부에 연결 특징부를 가질 수 있다. 호스 연결부와 같은 연결 특징부는 호스 또는 배관이 용이한 방식으로 피팅에 연결되는 것을 허용한다. 이 예에 있어서, 입구 피팅(24a)은, 위생적인 피팅(예를 들어, 3-클램프 연결부 또는 캠 록) 스타일 호스 피팅과 같은 호스 피팅에 수용되는 크기 및 구성을 갖는 오목부(44)를 형성한다.
대안적으로, 바닥 유동 분배기(24b)에 연결되는 출구 피팅(38b)은 입구 피팅과는 상이한 스타일의 연결부를 가질 수 있다. 이런 예에 있어서, 출구 피팅(38b)은 출구 피팅(38b)을 원격의 신속 분리 출구 피팅(48)에 유압식으로 연결하기 위해 호스(46)에 고정된다. 상기 원격의 신속 분리 출구 피팅(48)은 출구 피팅(38b) 보다 사용자에 의해 더욱 편리하게 접근될 수 있는 영역에 장착되거나 배치될 수 있다.
크로마토그래피 컬럼 부품[예를 들어, 튜브(20), 유동 분배기(24a, 24b), 피팅(38a, 38b), 및 다른 부품]은 구조적으로 그리고 화학적으로 안정한 다양한 플라스틱 재료로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 부품은 하나 또는 그 이상의 열가소물[예를 들어, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS), 아크릴(예를 들어, PMMA), 폴리프로필렌(PP), 폴리비닐 클로라이드(PVC), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 다른 열가소물, 또는 복합물] 및 열가소성 플라스틱[예를 들어, 에폭시 수지 및 섬유(예를 들어, 유리 또는 탄소) 보강된 플라스틱]으로 제조될 수 있다. 재료 선택 고려사항은, 재료가 시스템의 유도된 내부 작동 압력에 견딘다면, 재료의 특정한 기계적 특성을 포함한다.
상부 및 바닥 유동 분배기(24a, 24b)는, 컬럼의 제조 및 패킹 중, 튜브(20)의 상부 및 바닥 내에 설치된다(예를 들어, 압입). 일부 실시예에 있어서, 튜브(20)와 유동 분배기(24a, 24b) 중 하나 또는 모두는, 상부 유동 분배기(24a)의 삽입 및 튜브(20)의 패킹 전에, 매체 재료로 영구적으로 접합된다. 컬럼의 만족스러운 테스트에 이어, 제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기(24a)가 제 위치에 영구적으로 접합된다.
이런 영구적인 접합은 접합부 또는 접합된 부재[예를 들어, 튜브(20) 및 유동 분배기(24a, 24b)]를 파괴하는 것 이외는 용이하게 분리될 수 없다. 상단부에서, 추가적인 캡(예를 들어, 상부 캡)(54)이 튜브(20)에 작동 가능하게 안착되어 고정되며, 그리고 컬럼의 상부에서 유동 분배기(24a) 상에 설치된 입구 피팅(38a)이 추가적인 상단부 캡(54)의 입구 피팅 구멍(56)을 통과하도록 정렬된다. 주로 심미안적 특징부인 이런 추가적인 상부 캡(54)은 파스너, 접착제, 튜브와 상부 캡 사이의 마찰, 또는 다른 기구와 같은 다양한 고정 기구를 사용하여 튜브(20)에 고정될 수 있다.
여기에 기재된 크로마토그래피 컬럼의 튜브는, 최종 사용자에 의해 특정되는 바와 같이, 컬럼 크로마토그래피에 사용되는 임의의 고체 상태 컬럼 패킹 매체로 패킹될 수 있다. 잠재적 매핑 매체의 이런 다양성은 그 기능성 화학적 성질(예를 들어, 친화성, 이온 교환, 및 소수성 상호작용)뿐만 아니라, 베이스 입자의 조성물까지 연장한다. 컬럼 패킹 매체는 용리제(溶離劑)(eluent) 솔벤트에 추가되는 정지상 입자의 슬러리를 포함할 수 있다. 정지상 입자는 아가로스, 실리카겔(SiO2), 알루미나(Al2O3), 셀룰로오스, 및 다양한 메시 크기의 다른 적절한 재료를 포함할 수 있다. 용리제는 탈이온수, 에탄올, 또는 아세톤과 같은 다양한 솔벤트 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
패킹 매체의 예는 아가로스(예를 들어, 지이 헬스 케어로부터의 Sepharose® Fast Flow 및 Capto™) 제어된 기공 유리(밀리포어로부터의 ProSep®), 세라믹 수산화 인회석(hydroxyapatite), 폴리메타크릴레이트(예를 들어, 토소 바이오사이언스로부터의 ToyoPearl® media), 및 다른 합성 폴리머 수지(예를 들어, 이엠디로부터의 Life Technologies' Poros™ media 및 Fractogel™ media)를 포함하지만, 그러나 이에 제한되지 않는다.
패킹된 크로마토그래피 컬럼의 제조 방법
어떤 플라스틱/열가소물의 하나의 알려진 특징은 힘의 적용에 의한 파열 없이 변형하는 그 고유의 순응성 또는 능력이다. 신규한 크로마토그래피 컬럼은 컬럼 튜브(20)를 제조하는데 사용되는, 유도된 후크 텐션에 의해 정의되는 바와 같은 플라스틱의 "유동도(flow-ability)", 예를 들어 탄성의 이점을 취하는 조립 공정을 사용하여 제조된다. 컬럼 튜브(20)는 압출된, 주조된, 성형된[사출, 로토(roto), 등], 또는 가공된 플라스틱/열가소물 또는 특정된 내부 및 외부 치수의 테이프 레이드 복합물로 제조된다. 유동 분배기(24)를 위해 여기에 기재된 디자인 및 방법은 이하에 억지 끼워맞춤으로서 기재되는, 컬럼 튜브(20)의 공칭 내경 보다 큰 외경을 포함한다.
원통형 컬럼 튜브(20)에 사용될 때, 튜브(20) 내로 압입될 때 튜브(20)의 내벽의 표면에 대해 균일한 유도된 후프 텐션 및 충분한 액체-기밀성 결합 및 밀봉을 보장하기 위해, 유동 분배기(24)는 외면 상에 가능한 한 불균일성이 적은(예를 들어, 없는) 라운드형이어야만 한다. 충분한 정도의 균일한 진원도(roundness) 또는 원형도(circularity)는 선반 상에서 유동 분배기(24)를 회전시킴으로써 용이하게 달성될 수 있지만, 그러나 이런 정도의 균일한 진원도를 달성하는 다른 방법이 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
허용 가능한 억지 끼워맞춤의 정도는 튜브(20) 및 유동 분배기(24)를 둘러싸는 특별한 플라스틱/열가소물 또는 복합 성분의 기계적 특성, 예를 들어 탄성도 또는 유동도에 의해 결정되며, 폴리프로필렌인 경우에, 모든 경우는 아니지만, 따라서 튜브(20) 벽의 두께, 유동 분배기(24)의 외경은 유동 분배기(24)가 튜브(20) 내로 구동될 때 요구된 억지 끼워맞춤을 생산하여 만족스러운 유도된 후프 텐션을 보장하도록, 튜브(20)의 공칭 내경을 초과한다.
이 조립 공정은 신규한 크로마토그래피 컬럼에 독특한 이점을 제공한다. 치수적으로 더욱 안정한 재료(강철, 유리 등)로 구성되는 전형적인 컬럼은, 유동 분배기(24)가 컬럼 튜브 보다 미세하게 작도록 설계되며, 이는 조립 중 이 부품이 컬럼 튜브 내의 원하는 위치로 용이하게 삽입되고 이동되는 것을 허용하는데 필요하다. 유동 분배기(24)와 튜브(20) 벽 사이의 액체-기밀 밀봉을 달성하기 위해, O-링 또는 유사한 밀봉 기구가 유동 분배기(24)의 둘레에 사용된다. 이들 전형적인 디자인에 있어서, 튜브 내경 보다 작은 외경을 갖는 유동 분배기와 O-링을 포함할 필요성의 조합은, 필연적으로 O-링이 안착되는 지점까지 유동 분배기(24)와 튜브(20) 벽 사이의 "사공간(dead space)"으로서 지칭되는 영역으로 나타난다. 이들 "사공간"은 컬럼 유동에 노출시키는 것이 어렵고, 이에 따라 컬럼 세척능 및 결과적인 세척에 대한 위험을 초래한다. 억지 끼워맞춤 디자인은 전형적인 컬럼의 "사공간"을 제거하거나 또는 상당히 감소시키며, 이에 따라 컬럼 사용 사이에 이월(carry-over) 오염의 위험성을 최소화한다. 일부 실시예에 있어서, 억지 끼워맞춤은 전체적으로 O-링의 제거도 허용하며, 이에 따라 컬럼 복잡성, 비용, 및 밀봉 파괴로 인한 일체성에 대한 위험을 최소화한다. 이 특징부의 다른 이점은 추출 가능물 및 침출 가능물의 연구의 형태인, 비용이 많이 소요되고 또한 시간 소모적인 위험 평가를 요구하는 상기 O-링(전형적으로, 엘라스토머)으로부터 방출될 수 있는 오염물에, 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되는 가치 있는 제품의 노출을 감소시키는 것이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 신규한 크로마토그래피 컬럼(50)을 제조하는 방법은 여러 단계를 포함한다.
먼저, 여기의 어딘 가에 기재되는 바와 같이 적절한 탄성도뿐만 아니라, 최종 컬럼에 요구되는 중간재의 용적을 수용하기 위해 적절한 직경 및 길이를 갖는 플라스틱 컬럼 튜브(20)를 특정한다[단계(802)]. 튜브의 길이는 최종 컬럼에서 중간재의 길이 또는 "베드 높이"의 적어도 2배 이어야만 한다. 튜브(20)의 최종 길이는 내경, 예를 들어 200 및/또는 199.90 mm 내경과 대략 동일할 수 있으며, 튜브(20)는 약 150 내지 250 mm, 예를 들어 약 200 mm의 최종 길이를 가질 수 있다. 또한, 튜브의 각각의 단부의 내면을 따라 형성되는 모따기가 선택된다. 이 모따기는 컬럼 튜브(20)의 내부 내로 구동될 유동 분배기(24)를 정렬하고 그리고 삽입 시 도울 것이 요구된다.
둘째로, 적절한 크기의 유동 분배기(24)는 튜브의 내경("ID") 보다 미세하게 큰, 예를 들어 약 0.25%, 0.5 내지 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 또는 3.5% 큰 외경을 갖도록 특정되어야만 한다[단계(804)]. 예를 들어, 199.90 mm의 내경을 갖는 폴리프로필렌 튜브를 위해, 유동 분배기(24)는 201.90 mm 보다 큰(예를 들어 202 내지 204, 202,5, 203, 203.5, 204, 204.5, 205, 205.5 mm) 외경("OD")을 가져야만 한다. 유동 분배기(24)는 튜브(20) 벽에 충분한 후프 텐션을 유도하도록, 특정한 공칭 OD로 설계된다. 적절한 공칭 OD를 선택할 때, 감안할 고려 요소는, 컬럼 튜브의 ID 와 그 벽 두께 모두의 공차 및 유동 분배기(24) OD의 공차를 포함하는 형상과 조합하여, 구성 재료의 물리적 특성(예를 들어 마찰계수, 영률, 탄성계수, 및 항복 시 연신률)을 포함한다. 조립체를 함께 압입하는데 요구되는 힘은 이론적으로 결정될 수 있으며[예를 들어, 유한 요소 해석(Finite Element Analysis)과 같은 진보된 분석 툴을 통해], 또한 대안으로서 이 평가는 특정한 구성 재료의 실증 연구에 의해 실시될 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 유동 분배기는, 사용 시 호환성을 보장하고 또한 예를 들어 용접 중 튜브의 내벽에 유동 분배기의 고정을 간단하게 하기 위해, 튜브와 동일한 재료로 제조될 수 있다.
셋째로, 도 5에 도시된 바와 같이, 제1(예를 들어, 바닥) 유동 분배기(24b)는 튜브(20)의 제1 단부에, 예를 들어 바닥 단부에, 고정된다[단계(806)]. 이는 임의의 알려진 수단에 의해 이루어질 수 있으며, 또는 제1 유동 분배기와 관련된 임의의 사공간을 피하거나 감소시키는 것을 돕기 위해, 여기에 기재되는 억지 끼워맞춤 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 유동 분배기(24b)는 금속 클램프, 튜브(20)(내벽이나 외벽 상의) 및 유동 분배기 주변 벽 내로 절단된 나선, 접착제, 및 다양한 타입의 용접을 사용하여 고정될 수 있다. 요점은 이 제1 유동 분배기(24b)가 일단 튜브(20)의 제1 단부에 고정되었다면 이동될 필요가 없다는 점이다. 일부 실시예에 있어서, 제1 유동 분배기(24b)는 튜브(20)의 일체형 부분으로서 형성된다. 예를 들어, 제1 유동 분배기는 알려진 기술을 사용하여 튜브(20)의 특징부로서 성형될 수 있다.
억지 끼워맞춤 방법이 제1(예를 들어, 바닥) 유동 분배기에 사용되었다면, 이는 초기에는 요구된 압력으로 효율적인 유압 밀봉을 제공하기 위해 유도된 후프 텐션에 의해 원하는 위치에서 제 위치에 보유될 수 있으며, 그 후 용접, 나사, 또는 접착제를 포함하는 임의의 알려진 수단을 사용하여 그 위치에 영구적으로 고정될 수 있다. 특히, 적절한 억지 끼워맞춤을 설정하기 위해, 유동 분배기(24)는 튜브의 모따기된 바닥 단부와 정렬되며, 그 후 약 1000 lbf 내지 10,000 lbf(예를 들어, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 또는 10,000 lbf)의 축방향 힘이 유동 분배기(24) 상에 적용되어, 이를 컬럼 튜브(20) 내로 구동시키고, 그에 따라 튜브의 내경을 확장시킨다. 예를 들어, 유동 분배기(24)가 튜브(20) 내로 삽입될 동안, 튜브(20)와 유동 분배기(24) 모두는 함께 끼워맞춤되기 위해 소성적으로 변형되며, 튜브(20) 변형의 크기는 유동 분배기(24) 변형의 크기 보다 크다.
유동 분배기(24)를 튜브 내로 구동시키는데 요구되는 힘은, 다른 요소들 중에서도, 튜브 내에 형성되는 모따기의 각도, 및 그 형상 치수와 조합하여 (전술한) 구성 재료에 특정한 다른 물리적 특성에 의존한다. 예를 들어, 튜브 내에 억지 끼워맞춤을 설정하기 위해 제2 유동 분배기를 튜브 내로 구동시키는 축방향 힘은, 억지 끼워맞춤, 튜브 벽 두께, 및 튜브와 유동 분배기 재료의 특정한 기계적 특성의 함수이다. 튜브의 양 단부 내로 유동 분배기를 구동시키는데 요구되는 힘은 로드 셀 또는 유사한 인장 테스트 기구에 의해 측정될 수 있으며, 또한 유동 분배기와 튜브 벽 사이에 적절한 억지 끼워맞춤을 보장하기 위해 각각의 조립 중 검사되어야만 한다. 튜브 내로 유동 분배기를 구동시키는데 요구되는 축방향 힘은 튜브 벽과 유동 분배기 외주 엣지 사이의 접착 및 변형 마찰력으로 인한 대향력 보다 커야만 하고 또한 이와는 반대이어야만 한다.
하기의 식 1은 삽입력을 추가로 설명하고 있다.
F적용된 > F마찰,삽입 + F마찰,변형 = F순마찰 (1)
여기서, 상기 F적용된 는 튜브 내로 유동 분배기의 삽입과는 반대인 마찰력을 극복하는데 필요한 축방향 힘이고, 상기 F마찰, 삽입 은 유동 분배기와 튜브 벽 재료 사이의 접착으로 인한 마찰력이며, 상기 F마찰,변형 은 유동 분배기 및/또는 튜브 벽의 변형으로 인한 마찰력이고, 상기 F순마찰 은 순수 마찰력이다. 필요하다면, 부착 마찰력을 제거하기 위해 윤활유를 적용함으로써 또한 윤활유 없이 유동 분배기를 삽입하는데 요구되는 전체 축방향 힘으로부터 유동 분배기를 삽입하는 요구되는 결과적인 축방향 힘을 뺌으로써, 상기 2개의 마주하는 마찰력을 구별할 수 있다.
대안적으로, 유동 분배기를 튜브 내로 구동시켜 충분한 결과적인 유도된 후프 텐션을 생산하기 위해, 최소한의 축방향 힘을 결정할 수 있다. 이 유도된 후프 텐션은 튜브 내측의 특정한 위치에 유동 분배기를 보유하는 방사방향 힘으로서 작용한다. 잘 알려진 억지 끼워맞춤 방정식을 고려하여, 모든 튜브 및 유동 분배기 크기를 위한 유도된 후프 텐션을 제시하기 위한 표현이 유도되었다.
유도된 후프 텐션은, 이를 튜브 벽과 접촉하는 유동 분배기의 원주방향 면적과 곱함으로써, 유동 분배기의 벽 상의 튜브 벽에 의해 발휘된 전체 방사방향 힘과 관련될 수 있다. 하기의 식(2)은 이를 추가로 설명한다.
σ후프텐션 = F방사방향/A접촉, fd (2)
여기서, 상기 F방사방향 은 유동 분배기 벽으로 방사방향으로 내향하여 작용하는 튜브 벽 둘레에 균등하게 분포되는 방사방향 힘이며, 상기 A접촉, fd 는 튜브 벽과 접촉하는 유동 분배기의 면적이다. 또한, 이 방사방향 힘은, 유동 분배기와 튜브의 내벽 사이에서, 직교하는 마찰력(F순마찰)과 직접적으로 관련되어 있음을 추가로 알 수 있다. 따라서 유동 분배기를 튜브 내로 구동시키기 위해 마찰력(F적용된)을 극복하는데 요구되는 힘을, 유동 분배기를 튜브 내측의 원하는 위치에 보유할 유도된 후프 텐션(σ후프텐션)과 관련시킬 수 있다.
F순마찰 = F방사방향(μ마찰) (3)
F적용된 ≥ F순마찰 = σ후프텐션(A접촉, fd )(μ마찰) (4)
및
σ후프텐션 ≤ F적용된/(A접촉, fd )(μ마찰) (5)
여기서, 상기 μ마찰 은 유동 분배기 재료와 튜브 벽 재료 사이의 마찰계수이다.
이런 상호관련의 결과로서, 경험적 테스트가 주어진 유도된 후프 텐션이 추천된 최대 작동 범위의 적절한 안전 요소까지, 예를 들어 2x, 3x, 또는 4x, 누설 방지 밀봉을 제공하는 한, 조립 중 로드 셀 또는 유사한 기구로, 컬럼의 적절한 작동 압력을 보장 및 체크할 수 있다. 먼지, 습기, 산화막, 표면 마무리, 미끄럼 속도, 온도, 진동, 및 컬럼과 유동 분배기 벽에 대한 오염 정도는 마찰계수(μ마찰) 값의 변화에 기여할 수 있으며, 따라서 기록된 삽입력에 영향을 끼친다. 이 에러를 감소시키기 위한 시도로서, 정확한 마찰계수(μ마찰) 및 요구되는 유도된 후프 텐션을 달성하기 위한 후속의 적용되는 부하(F적용된)는 안정적이고 반복 가능한 제조/실험실 환경, 즉 클린룸에서 수행될 것이 재추천된다. 궁극적으로, 설비는 매우 적은 먼지, 낮은 습도, (재료의 기계적 특성에 영향을 끼칠 수 있는) 최소한의 UV 광, 최소한의 진동, 일정한 온도(실온 상태에 가까운), 낮은 오염 정도, 및 일정한 삽입 속도를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 하기의 식은 결과적인 억지 끼워맞춤에 대한 표면 마무리의 크기를 결정하는데 사용되었으며, 이는 (본 발명의 경우, 재료에 대한) 표면 마무리가 전체적인 억지 끼워맞춤을 무시할 수 있음을 나타내고 있다.
δeff = δint - △δ (6)
여기서, 상기 δeff 는 유효 간섭이고, 또한 상기 △δ는 내측 튜브 벽의 표면 마무리 및 유동 분배기의 원주방향 표면을 고려한 측정된 억지 끼워맞춤에 대한 보정이다.
△δ= 0.1(2)(Rz , tube + Rz , fd) (7)
여기서, 상기 Rz , tube 는 튜브의 내벽의 표면 마무리이며, 상기 Rz , fd 는 유동 분배기의 외벽의 표면 마무리이다.
충분한 유도된 후프 응력을 보장하여 이 압력을 포함하기 위해, 유동 분배기와 튜브 벽 사이의 간섭량 사이의 관계를 전개하여 어떤 압력까지 누설되는 것을 방지하도록 먼저 실험이 실시될 수 있다. 식(1)은 유동 분배기와 튜브 벽 사이에 누설-방지 밀봉을 생성하는데 유도된 후프 텐션이 직접적으로 책임이 있음을 도시하고 있다. 일정한 튜브 및 유동 분배기 재료를 가정하는 3개의 주요한 변수, 즉 억지 끼워맞춤(δint), 튜브의 외경(Dtube ,o), 및 유동 분배기의 외경(Dfd)은 유도된 후프 텐션의 크기에 기여할 것이다. 일단 이들 값 중 2개가 선택되면, 제3 변수의 변화는 유동 분배기를 삽입하는데 적용된 힘(F적용된) 대 누설에 대한 내부 압력의 여러 경우를 테스트하는 것을 허용할 것이다. 일단 유동 분배기를 지나 임의의 누설 없이 적절한 내부 압력이 달성되었다면, 적용된 힘의 값은 원하는 압력을 포함하는데 필요한 유도된 후프 텐션을 역산하는데 사용될 수 있다. 일단 필요한 유도된 후프 텐션이 어떤 크로마토그래피 컬럼 크기(튜브 내경)를 위해 발견되었다면, 이들이 궁극적으로 동일한 최종의 유도된 후프 텐션값을 달성하는 한 디자인을 최적화하기 위해, 유도된 후프 텐션에 기여하는 3개의 주요한 변수가 다시 한번 수정될 수 있다.
도 9a 및 9b는 유동 분배기(24)가 모따기(22)에 도달하기 전에 초기에 튜브(20) 내로 구동될 동안 발생되는 힘의 개략적인 자유 본체(free body) 다이아그램을 도시하고 있다. 유동 분배기(24)가 먼저 튜브(20)에 들어갈 때, 튜브(20)는 아직 확장되지 않았다. 유동 분배기(24)와 튜브(20) 벽 사이의 간섭은, 튜브(20)가 확장되고 유동 분배기(24)가 압축되도록 강제한다. 튜브(20)의 벽 두께가 유동 분배기(24)의 직경 및 두께 보다 작기 때문에, 전체적인 합력은 튜브 벽의 확장으로 나타날 것이다[유동 분배기(24)는 대응하여 소량의 압축을 받을 수 있음을 인식해야 한다]. 이것이 발생하기 위해, 축방향으로의 힘은 유도된 후프 텐션으로 인해 생성되는 힘을 극복할 정도로 충분히 커야만 한다. 축방향 힘은 선형 작동기로부터이며, 수평방향 또는 방사방향 힘은 유도된 후프 응력으로부터이다. 축방향 힘은 마찰력을 간단히 극복한다. 상기 마찰력은 유도된 후프로부터의 힘의 값과 직접적으로 관련되어 있다.
도 10a 및 10b는 유동 분배기(24)가 모따기(22)를 통과한 후 튜브(20)의 축방향 길이를 따라 구동될 동안 발생되는 힘의 개략적인 자유 본체 다이아그램을 도시하고 있다. 축방향 힘의 일부 성분이 튜브(20)를 팽창시키는데 기여하더라도, 응력은 유동 분배기(24)와 튜브(20) 사이의 초기 접촉 지점으로부터 먼 3-5 특징적인 치수로 분배되며, 또한 튜브(20)는 유동 분배기(24)의 앞에서 이미 확장되어 있다. 따라서 유동 분배기(24)가 튜브(20)의 길이를 따라 축방향으로 더욱 삽입될 때, 유동 분배기(24)를 가압하는 축방향 힘은 유동 분배기(24)와의 접촉 지점뿐만 아니라 유동 분배기(24) 앞의 3-5 특징적인 치수에서 발생하는 높은 유도된 후프 텐션을 극복하도록 크다. 일부 실시예에 있어서, 모따기는 튜브 벽의 그 단부에서 시작되며, 또한 예를 들어 튜브의 전체 길이를 따라 연장할 수 있다.
도 11은 일 실시예에 있어서 유동 분배기(24)가 튜브(20) 내로 이동할 때 유동 분배기(24)를 튜브(20) 내로 가압하는데 요구되는 축방향 힘을 도시한 차트를 도시하고 있다. 도시된 바와 같이, 힘은 초기에는 피크까지 증가하지만, 유동 분배기(24)의 제1 부분은 튜브 모따기(22)의 초반부에 들어가서 이를 통과한다. 처음에, 유동 분배기(24) 및 튜브 벽은 정적 마찰을 경험하며, 상기 정적 마찰을 극복하는 힘이 가장 크다. 일단 유동 분배기(24) 및 튜브(20) 벽의 변형이 튜브(20) 내로 유동 분배기(24)의 미끄럼으로 넘겨졌다면, 유동 분배기(24)의 튜브 내로 계속 가압하는데 요구되는 힘은 이것이 동적 마찰을 경험하기 때문에 강하한다. 동적 마찰은 극복하기에는 정적 마찰 보다 상당히 적다. 또한, 2개의 추가적인 피크가 이 그래프에도 제시되어 있다. 약 21 mm의 제1 피크는 모따기(22)의 바닥이 유동 분배기(24)의 O-링 홈(26)에 있을 때 대응한다(도 12 참조). 제2 피크는 전체 유동 분배기(24)가 모따기를 지나 튜브(20)의 영역에 결합되는 지점에 대응한다. 도시된 바와 같이, 이런 예에 있어서, 최대 축방향 힘은 약 1200-1300 lbf 이다.
어떤 실시예에 있어서, 밀봉은 유동 분배기(24)의 외벽의 O-링 홈(26) 내에 배치되는 O-링의 사용에 의해 개선될 수 있다. 어떤 실시예에 있어서, 압입 또는 억지 끼워맞춤은 유동 분배기를 제 위치에 보유하기에 충분하지만, 그러나 다른 실시예에서는 더욱 영구적인 접합이 요구된다.
일단 유동 분배기(24)가 튜브의 제1(예를 들어, 바닥) 단부 내로 약 1 내지 10 cm, 예를 들어 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 또는 8.5 cm 구동되었다면, 유동 분배기(24) 및 튜브가 동일하거나 또는 충분히 유사한 재료로 제조된 경우, 유동 분배기(24)는 예를 들어 용접에 의해 제 위치에 영구적으로 고정될 수 있다. 유동 분배기와 컬럼 튜브 사이에 용접부를 형성하기 위해, 고온 툴 용접, 고온 가스 용접(예를 들어, 420℃), 초음파, 압출, 레이저, 전도성, 고주파, 등을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 다양한 용접 기술이 사용될 수 있다. 2개의 부재가 상이한 재료로 제조되었다면, 이들은 튜브를 압축하고 그리고 유동 분배기를 그 위치에서 튜브 내에 정착시킬 힘을 적용하기 위해 외부에 적용되는, 금속 호스 클램프와 같은 기계적 클램프를 사용하여, 또는 접착제에 의해, 또는 튜브 벽을 통해 유동 분배기 내로 통과하는 기계적 파스너에 의해 연결될 수 있다.
넷째로, 입구 및 출구 피팅(38a, 38b)은 제1(예를 들어, 바닥) 및 제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기(24a, 24b)에 부착된다[단계(808)]. 입구 및 출구 피팅(38a, 38b)은 상부 및 바닥 유동 분배기(24a, 24b)의 나사형 피팅 구멍(26) 내로 나사결합되는 나사 영역(40)을 갖는다. 오목부(예를 들어, O-링 글랜드)는 각각의 피팅의 바닥 단부(즉, 유동 분배기와 결합하는 단부) 또는 유동 분배기의 나사형 피팅 구멍(26)의 터미널 단부에 형성될 수 있다. 이런 실시예에 있어서, O-링은 피팅(38)과 유동 분배기 사이에 밀봉(예를 들어, 액체-기밀 밀봉)을 형성하기 위해 이들이 함께 나사결합될 때 피팅(38)과 유동 분배기(24) 사이에 배치된다. 이 인터페이스에 충분한 밀봉을 형성하기 위해, 토오크 렌치가 O-링의 적절한 압축을 보장하도록 사용될 수 있다.
이어서, 액체 슬러리 형태의 패킹 매체가 바닥 유동 분배기(24b) 위의 공간(챔버)에서 컬럼 튜브(20) 내로 로딩된다[단계(810)].
이어서, 도 6 및 7에 도시된 바와 같이, 일단 제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기(24a)가 튜브로 배관되었다면(그리고, 액체 소스에 이미 선택적으로 연결되었다면), 이것은 억지 끼워맞춤 방법을 사용하였을 때 제1 유동 분배기(24b)가 삽입될 때와 거의 동일한 방법으로 튜브(20) 내로 삽입된다. 상기 제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기(24a)가 튜브(20) 내로 삽입되는 초기 위치가 즉시 고정되지 않기 때문에, 테스트에 이어 제2 유동 분배기의 초기 삽입을 재조정하는 것이 바람직할 수 있기 때문에, 억지 끼워맞춤 방법이 제2 유동 분배기를 위해 사용되는 것이 중요하다. 따라서 억지 끼워맞춤 방법이 사용되므로, 제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기(24a)는 최종 조정을 하기 위해 튜브(20) 내로 내측으로 이동될 수 있다. 또한, 억지 끼워맞춤은 컬럼의 테스트 중 사용된 압력으로 액체-기밀 밀봉을 보장하도록 설계 및 실시되어야 하는 점이 중요하다.
이 지점에서, 패킹 매체는 특수한 매체에 적절한 방법, 예를 들어 적절히 배합된 용액["이동상(mobile phase)" 또는 "패킹 버퍼(packing buffer)"]으로의 유동, 또는 컬럼 출구 피팅(38b)으로부터 적용된 흡입, 또는 임의의 다른 적절한 알려진 기술이나 방법을 사용하여, 패킹 베드 내에 능동적으로 정착될 수 있다. 제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기는 패킹 매체와 접촉할 때까지 유동 분배기에 추가적인 축방향 힘을 적용함으로써 튜브 내로 추가로 구동될 수 있으며, 또한 원하는 위치에 도달하도록 패킹 매체를 압축할 수 있다. 이런 압축은 패킹 매체의 특성에 따라 패킹된 베드 높이의 0부터 30% 또는 그 이상의 범위일 수 있다. HETP(이론단 해당 높이)(Height Equivalent to a Theoretical Plate) 테스트 및 비대칭 분석에 의해 측정된 컬럼의 성능은, 부분적으로는 베드의 압축의 함수일 것이다. 적절하다면, 삽입된 유동 분배기(24a)를 튜브의 단부를 향해 이동시켜 베드 압축을 감소시키는 것도 가능하다. 이는 제1 및 제2 유동 분배기 사이에 생성된 챔버 내측의 액체에 힘을 적용함으로써 정적 압력을 사용하여 이루어진다. 제1 유동 분배기(24B)가 영구적으로 고정되기 때문에, 압입을 사용하여 고정되는 제2 유동 분배기(24A)는 일단 압입을 극복하기에 충분한 힘이 컬럼 튜브 내의 액체에 의해 이에 발휘되었다면 이동할 것이다.
이어서, 보유되지 않은 그리고 용이하게 검출 가능한 피험물질(test article)(예를 들어, UV 모니터링을 통한 아세톤, 또는 전도성 모니터링을 통한 염화나트륨)의 펄스 주입에 의해, 컬럼 패킹 매체의 적합성이 테스트될 수 있다[단계(818)]. 패킹 테스트의 결과에 기초하여, 상부 유동 분배기(24a)는 패킹된 베드 내로 하방으로 더욱 이동할 수 있으며(예를 들어, 구동될 수 있으며), 그리고 상기 패킹 테스트는 반복될 수 있다. 상부 유동 분배기가 튜브 내로 너무 멀리 이동되고, 이것이 패킹 베드를 과잉으로 압축시킬 수 있다면, 액체는 밀봉 차단된 출구 피팅에 의해 입구 피팅을 통해 챔버 내로 가압될 수 있으며, 이에 따라 상부 유동 분배기(24a)를 튜브의 상단부를 향해 다시 이동시키기 위해 유압력을 사용하고 그리고 패킹된 베드의 압축을 감소시킨다. 일단 컬럼 패킹의 적합성이 결정되었다면, 컬럼은 그 후 최종 사용자 사양 마다 세균발육 억제용 보호 용액으로 살균되고 및/또는 씻겨진다.
제2(예를 들어, 상부) 유동 분배기(24a)가 적절히 위치되었을 때, 이는 제1 유동 분배기를 고정하기 위해 전술한 바와 같이 용접 또는 다른 수단에 의해 영구적으로 고정될 수 있다[단계(818)]. 일부 실시예에 있어서, 억지 끼워맞춤은 상부(또는 제2) 유동 분배기(24a)를 튜브(20)의 내벽에 고정하는데 충분할 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 패킹된 최종 크로마토그래피 컬럼은 그 후 상부 캡, 베이스, 및/또는 측부 가드(guard)로 삽입될 수 있다. 그 후, 크로마토그래피 컬럼은 최종 살균을 받을 수 있으며, 그리고 사용되거나 또는 선적을 위해 패키징된다.
사용 방법
여기에 기재된 시스템 및 방법은, 최종 사용자에게, 전형적으로 상당한 설비 투자를 요구하는 내구성의 하드웨어 설치에 존재하는 다른 크로마토그래피 컬럼과 성능에 필적할 수 있는, 1회용의 예비-패킹된, 예비 자격의, 살균 크로마토그래피 컬럼을 제공한다. 신규한 살균 컬럼은 다른 알려진 크로마토그래피 컬럼과 동일한 방식으로 사용되지만, 그러나 1회용 및 살균성을 감안한다면, 상기 신규한 컬럼은 독성이거나 또는 달리 독성인, 예를 들어, 바이러스, 병원체, 및 독소인 시약을 분리 및 정제하는데 특히 유용하다. 또한, 이들 살균 컬럼은 컬럼이 재사용되고 비효과적으로 세척되었을 때 자주 발생하는 오염의 공포 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 살균 컬럼은 연속적인 살균 공정 및 높은 수준의 미생물 제어가 요구되는 다품종 생산 설비에 사용될 수 있다.
신규한 살균 컬럼은 1회용 시스템 및 다중 컬럼-크로마토그래피 시스템에 사용될 수 있다. 또한, 신규한 살균 컬럼은 살균 연결부를 통해 살균 시스템에도 연결될 수 있다.
일부 사용에 있어서, 컬럼은 2개 또는 그 이상의 상이한 SpA 분자를 갖는 다양한 친화성 포획 매체로 예비-패킹될 수 있다.
예
본 발명은 청구범위에 기재된 발명의 범주를 제한하지 않는, 하기의 예에 추가로 기재된다.
예 1-압력 내성에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 플라스틱 크로마토그래피 컬럼 및 그 부분에 대해 여기에 기재되는 신규한 살균 방법의 영향을 결정하는 것이었다. 본 테스트는 각각의 부품의 압력 내성에 대한 감마선의 영향을 테스트하기 위해 크로마토그래피 컬럼 부분의 조사뿐만 아니라 임의의 패킹 매체를 포함하지 않는 조립된 크로마토그래피 컬럼의 조사를 포함하고 있다.
컬럼 재료-OPUS™ 크로마토그래피 컬럼(리플라이젠 코포레이션)
● 14 cm 유동 분배기
● 14 cm 베드 지지체-폴리프로필렌 메시
● 14 cm 유동 분배기 O-링
● 포트 O-링(소형 O-링)
● 입구 포트
● 포트 클램프
● 포트 플러그
● 14 cm 압출된 폴리프로필렌 튜브
방법
크로마토그래피 컬럼 부품은 그 이소메딕스 서비시스 비지니스(메사츄세츠, 노스버러) 하에 계약 살균 서비스를 제공하는, 살균 계약 회사인 스테리스 코포레이션에 의해 25 kGy의 원하는 타겟(target)으로 15-40 kGy 사이의 투여량으로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy 이었다. 상기 스테리스 코포레이션은, 예비-패킹된 컬럼 전체를 통해 이온화(전자 붕괴)를 생산하기 위해, 동위원소 소스(코발트 60)로부터 방출된 고-에너지 광자를 사용한다. 생세포(living cell)에서, 이들 붕괴는 DNA 및 다른 세포 구조물의 손상으로 나타난다. 분자 수준의 이들 광자-유도된 변화는 유기체의 사망을 유발하거나 또는 유기체로 하여금 재생산을 할 수 없게 하며, 따라서 원하는 살균을 제공한다.
조사 후 테스트를 위해, 컬럼은 물로 충전된 압력 탱크에 부착되었다. 상기 압력 탱크는 외부 불활성 가스 탱크를 사용하여 100 psi(7 bar)까지 가압될 수 있다. 컬럼은 먼저 물로 충전되었으며, 그 후 증가된 압력을 받는다. 테스트 중 압력 증가를 모니터링하기 위해, 압력 게이지가 컬럼의 입구에 부착되었다.
결과
비-조사된 신규한 크로마토그래피 컬럼은 4 bar의 최대 압력으로 지정되었다. 조사된 컬럼은 용접된 상부 어댑터를 갖지 않았으며, 이에 따라 4 bar 보다 작은 최대 압력에 견딜 것으로 예상되었다.
상기 상부 유동 어댑터는 압력이 5.5 bar 에 도달할 때까지 이동하지 않았다. 5.5 bar에서, 상부 유동 어댑터는 컬럼으로부터 완전히 제거될 수 있을 때까지 서서히 위로 이동하기 시작하였다. 이 테스트는 조사된 컬럼이 비-조사된 컬럼과 등가의 압력 내성을 갖고 있음을 나타내고 있다.
예 2- 침출물 및 추출물에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 감마선 조사에 의해 살균된 크로마토그래피 컬럼의 재료의 호환성을 결정하는 것이었다. 이 예에 있어서, 컬럼 부분으로부터의 침출물 및 추출물에 대한 감마선의 영향이 결정된다.
컬럼 재료-OPUS™ 크로마토그래피 컬럼(리플라이젠 코포레이션)
● 14 cm 유동 분배기-가공된 성형 폴리프로필렌
● 14 cm 베드 지지체-폴리프로필렌 메시
● 14 cm 유동 분배기 O-링-백금 경화된 실리콘
● 포트 O-링(소형 O-링)-백금 경화된 실리콘
● 입구 포트-가공된 폴리프로필렌
● 14 cm 압출된 폴리프로필렌 튜브
방법
OPUS™ 크로마토그래피 컬럼 부품은 예 1에 기재한 바와 같이 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에 의해 25 kGy의 원하는 타겟으로 15-40 kGy 사이로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy이었다.
조사된 그리고 비-조사된 모든 컬럼 재료는 37℃ 에서 20% 에탄올 및 물에 각각 72 시간 동안 침적되었다. 배양 시간의 말기에, 상청액(supernatant)은 역상(reverse phase) HLPC 에 의해 분석되었다.
상기 HLPC 법은 침출물 및 추출물을 검출하기 위해 사용되었다.
- HLPC 컬럼 YMC C18 - 3 um, 12 nm
- 버퍼 A: 물에서의 0.1% TFE
- 버퍼 A: 아세토니트릴에서의 0.1% TFE
- 유동 1 mL/분
침출물 및 추출물을 검출하기 위한 HLPC 법

시간
%A

0.00
5.0

45.00
50.0

60.00
80.0

65.00
80.0

68.00
5.0

75.00
5.0
결과
도 14a-14j를 참조하면, 20% 에탄올에는 비-조사된 그리고 조사된 컬럼 부분 모두에 대해 물에서 보다 미세하게 높은 수준의 침출물 및 추출물이 있다. 그래프는 플라스틱이 조사된 후 존재하게 되는 상당한 침출물 및 추출물이 없는 것을 도시하고 있다. 샘플 사이의 가변성은 통계적으로 중요하지 않다.
20% 에탄올에서, 테스트된 모든 컬럼 부분은 비-조사된 부분 보다 조사 후 낮은 수준의 추출물을 나타내고 있다. 물에서, 컬럼 본체는 조사 후 미세하게 높은 수준의 추출물을 가졌지만, 그러나 그 차이가 통계적으로는 중요하지 않다. 베드 지지체는 조사 후 물에서 높은 수준의 추출물을 나타내었다. 그러나 전체적인 변화는 적었다. 가능하기로는 감마선 조사로부터의 가교 결합으로 인해, 조사된 샘플에서는 일부 화합물 피크가 감소되었거나, 또는 완전히 사라졌다.
예 3-물리적 외관에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 조립된 크로마토그래피 컬럼의 물리적 외관에 대한 감마선 조사의 영향을 테스트하는 것이었다.
컬럼 재료-OPUS™ 크로마토그래피 컬럼(리플라이젠 코포레이션)
● 14 cm 유동 분배기-가공된 성형 폴리프로필렌
● 14 cm 베드 지지체-폴리프로필렌 메시
● 14 cm 유동 분배기 O-링-백금 경화된 실리콘
● 포트 O-링(소형 O-링)-백금 경화된 실리콘
● 입구 포트-가공된 폴리프로필렌
● 포트 클램프
● 포트 플러그
● 14 cm 압출된 폴리프로필렌 튜브
방법
조립된 빈 OPUS™ 크로마토그래피 컬럼은 예 1에 기재한 바와 같이 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에 의해 25 kGy의 원하는 타겟으로 15-40 kGy 사이로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy 이었다.
결과
도 13에 도시된 바와 같이, 조사된 폴리프로필렌 컬럼은 비-조사된 컬럼에 비해 오프(off) 백색/황색 색조를 가졌지만, 그러나 달리 온전하였다.
예 4-기계적 특성에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 크로마토그래피 컬럼의 기계적 특성에 대한 감마선 조사의 영향을 테스트하는 것이었다. 특히, 응력 대 스트레인 곡선을 유도하는 것이 목적이었다. 항복 시 인장 강도, 항복 시 연신률, 파괴 시 인장 응력, 파괴 시 연신률, 및 탄성률이 모두 이 곡선으로부터 발견되었다.
컬럼 재료-OPUS™ 크로마토그래피 컬럼(리플라이젠 코포레이션)
● 14 cm 압출된 폴리프로필렌 튜브
방법
OPUS™ 크로마토그래피 컬럼 튜브는 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에 의해 감마선의 25 kGy의 원하는 타겟으로 15-40 kGy 사이로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy 이었다.
조사 후, 인터텍 피티엘(Intertek PTL)(메샤츄세츠, 필츠필드)이 ASTM D638-10에 따라 인장 테스트를 실행하였다. 비-조사된 순수 압출 PP 튜브의 5개의 샘플 및 조사된 압출 PP 튜브의 5개의 샘플이 준비되고(컬럼 튜브로부터 절단된) 그리고 테스트되었다. 특정한 매개변수는 다음과 같다.
샘플 준비
인터텍 피티엘에 의해 가공
샘플 타입
ASTM 타입 1 인장 바아(bar)
샘플 치수
0.500" × 0.125"(평균)
십자 나사못( cross - head ) 속도
50 mm/분
신장계( extensometer )
50 mm 게이지 길이에 기초하여 160%. 실제 최소 요구사항 부합
E83: 모듈러스(등급 B-2)/연신률(등급 C)
컨디셔닝
23℃ 에서 40+ 시간±2℃/50%±10% RH
테스트 상태
23℃±2℃/50%±10% RH
결과
표 2는 이런 일련의 실험으로부터 얻어진 데이터를 요약하고 있다. 도 15 및 16은 순수 압출 PP 튜브와 조사된 압출 PP 튜브 사이의 무시 가능한 오차를 도시하고 있다. 모든 샘플은 도 16에 도시된 제1 최소값 내지 최대값에 의해 제시된 매우 유사한 외관 탄성 변형 영역을 경험하였다. 조사된 샘플은 더욱 강인한 재료(파괴까지의 곡선 아래의 영역)의 특성인, 항복 후 응력의 각각의 증가된 변화에 대해 매우 적게 스트레칭되는 경향이지만, 그러나 관련된 재료만 곡선의 탄성 영역에 포함되는데, 그 이유는 플라스틱이 조립 시 영구 변형을 경험하지 않기 때문이다. 모든 간섭은 재료가 임의의 소성 변형을 경험하지 않도록 설계되었다. 인장되거나 또는 압축되는 결과로서 재료가 시간에 따라 미세한 크리이프를 경험한다는 것을 언급하는 것은 가치 있는 것이며, 이는 플라스틱의 통상적인 물리적 특성이다.
표 2는 도 16을 분석한 결과로서 순수 압출 PP 튜브와 조사된 압출 PP 튜브의 결과적인 엔지니어링 특성을 비교하고 있다. 양 샘플은 동일한 항복 시 연신률을 경험한 반면에, 조사된 샘플은 미세하게 큰, 140 PSI, 항복 시 인장 강도를 달성하였다. 이는 항복 시 전체 인장 강도의 3% 보다 작으므로, 최소한의 요소로 간주될 수 있으며, 특히 순수 샘플과 조사된 샘플의 표준편차는 각각 35 와 49 PSI 이었다. 탄성 변형의 영역에서 응력 대 스트레인 곡선의 경사도에 의해 제시되는 탄성률은, 조사된 샘플 대 순수 샘플 보다 큰 20,000 PIS 이다. 큰 탄성률은 더욱 탄성인 재료를 나타내며, 따라서 재료는 더 큰 크기의 에너지를 흡수할 수 있으며, 그리고 여전히 그 본래의 형태로 복귀한다. 재료의 탄성은 이하의 식으로 표시된다.
Figure 112016069331632-pct00001
여기서, Uτ 는 탄성률이고, σ 는 응력이며, ε은 스트레인이고, εy 는 항복 시 스트레인의 값이다.
결론적으로, 두 재료는 매우 유사한 탄성 변형을 나타냈지만, 그러나 조사된 샘플은 비-조사된 순수 샘플 보다 훨씬 탄성인 것으로 간주될 것이다. 이는 스트레인의 크기에 도달하여 항복점을 달성하기 위해서는 조사된 샘플이 비-조사된 순수 샘플 보다 약간 많은 압력을 요구할 것임을 의미한다.
순수 압출 PP 튜브 및 조사된 압출 PP 튜브의 인장 특성의 분석

샘플명
샘플
번호
항복 시
인장강도(PSI)
항복 시
연신률(%)
파괴 시
인장강도(PSI)
파괴 시
연신률(%)
탄성률(PSI)








순수
pp
튜브
1
4960
11
3210
220
219000

2
4910
11
3210
210
218000

3
4990
11
3000
220
225000

4
5000
11
2940
450
217000

5
4960
11
2910
450
212000

평균
4960
11
3050
310
218000

St Dev
35
0
146
128
4700








조사된
PP
튜브
1
5120
11
2930
370
239000

2
5110
11
2790
390
232000

3
5150
11
2860
390
242000

4
5080
11
2710
160
240000

5
5020
11
2970
450
235000

평균
5100
11
2850
350
238000

St Dev
49
0
100
110
4000
예 5-기계적 특성에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 크로마토그래피 컬럼의 기계적 특성에 대한 감마선의 영향을 테스트하는 것이었다. 특히, 응력 대 스트레인 곡선을 유도하는 것이 목적이었다. 굴곡 응력과 5% 스트레인 및 굴곡 탄성률 모두가 모두 이 곡선으로부터 발견된다.
컬럼 재료-OPUS™ 크로마토그래피 컬럼(리플라이젠 코포레이션)
● 14 cm 압출된 폴리프로필렌 튜브
방법
OPUS™ 크로마토그래피 컬럼 튜브는 실시예 1에 기재된 바와 같이 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에 의해 감마선의 25 kGy의 원하는 타겟으로 15-40 kGy 사이로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy 이었다.
조사 후, 인터텍 피티엘(메샤츄세츠, 필츠필드)이 ASTM D790-10에 따라 굴곡 테스트를 수행하였다. 순수 압출 폴리프로필렌 튜브의 5개의 샘플 및 조사된 압출 PP 튜브의 5개의 샘플이 준비되고(컬럼 튜브로부터 절단된) 그리고 테스트되었다. 특정한 매개변수는 다음과 같다.
샘플 준비
인터텍 피티엘에 의해 가공
샘플 타입
ASTM 굴곡 바아
샘플 치수
0.500" × 0.125" × 5"(평균)
십자 나사못 속도
0.054 in/분
스팬 길이
2.016 in
신장계
50 mm 게이지 길이에 기초하여 160%. 실제 최소 요구사항 부합
E83: 모듈러스(등급 B-2)/연신률(등급 C)
스팬 -깊이 비율
16±1:1
지지체의 반경
0.197 in
로딩 노우즈의 반경
0.197 in
컨디셔닝
23℃ 에서 40+ 시간±2℃/50%±10% RH
테스트 상태
23℃±2℃/50%±10% RH
결과
도 17은 순수 압출 PP 튜브와 조사된 압출 PP 튜브 사이의 무시 가능한 차이를 도시하고 있다. 모든 샘플에 대해 6% 스트레인까지 3개의 지점 벤드(bend) 테스트가 실시되었으며, 조사된 샘플은 순수 샘플과 동일한 거리로 스트레칭하도록 미세하게 큰 압력을 요구하였다.
표 3은 도 17의 분석 결과로서 순수 압출 PP 튜브 및 조사된 압출 PP 튜브의 결과적인 엔지니어링 특성을 비교하고 있다. 일단 다시 예상되는 바와 같이, 조사된 샘플은 순수 샘플 보다 미세하게 큰 굴곡 탄성률을 경험하였으며, 이는 압출된 PP 튜브가 조사로의 도입에 따라 미세하게 더욱 탄성으로 되는 지표이다
결론적으로, 도 17에 의해 제시되는 바와 같이 순수 샘플과 조사된 샘플 사이에는 매우 최소한의 차이가 있었다. 조사된 샘플은 조사를 경험한 후 미세하게 더욱 탄성으로 되었다. 표 3은 전술한 가정을 지지한다.
순수 압출 PP 튜브 및 조사된 압출 PP 튜브의 굴곡 응력 특성

샘플명
샘플 번호
5% 스트레인에서의
굴곡 응력(PSI)
굴곡 탄성률(PSI)








순수pp 튜브
1
6390
223000

2
6250
215000

3
6310
221000

4
6410
221000

5
6280
220000

평균
6330
220000

St Dev
69
3000








조사된 PP 튜브
1
6650
235000

2
6580
239000

3
6510
236000

4
6430
233000

5
6680
236000

평균
6570
236000

St Dev
100
2200
예 6-기계적 특성에 대한 감마선의 영향-유동 분배기 O-링
이 예의 목적은 크로마토그래피 컬럼 실리콘 O-링의 기계적 특성에 대한 감마선의 영향을 테스트하는 것이었다. 특히, 각각의 재료에 대한 응력 대 스트레인 곡선을 유도하는 것이 목적이었다. 파괴 시 인장 강도와 파괴 시 연신률 모두가 모두 이 곡선으로부터 발견된다.
컬럼 재료
● 14 cm 유동 분배기 O-링
● 14 cm 압출된 폴리프로필렌 튜브
방법
유동 분배기 및 O-링을 갖는 조립된 OPUS™ 크로마토그래피 컬럼 튜브는 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에 의해 감마선의 25 kGy의 원하는 타겟으로 15-40 kGy 사이로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy 이었다.
조사 후, 인터텍 피티엘(메샤츄세츠, 필츠필드)이 ASTM D412-06a에 따라 인장 테스트를 수행하였다. 순수 실리콘 O-링의 2개의 샘플 및 조사된 실리콘 O-링의 2개의 샘플이 준비되고 그리고 테스트되었다. 테스트된 O-링은 조사 공정을 겪은 조립된 컬럼으로부터 제거되었다. 따라서 O-링은 조사 공정 중 인장 및 압축 하에 있을 뿐만 아니라 연장된 시간 주기 동안 인장 과 압축 상태 모두에 있다. 순수 O-링은 물품 목록으로부터 취해졌다. 특정한 매개변수는 다음과 같다.
샘플 준비
인터텍 피티엘에 의해 절단
샘플 타입
O-링 부재
십자 나사못 속도
20 in/분
신장계
1.0" 게이지 길이에 기초하여 1000%
컨디셔닝
23℃ 에서 40+ 시간±2℃/50%±10% RH
테스트 상태
23℃±2℃/50%±10% RH
결과
도 18은 비-조사된 순수 실리콘 O-링과 조사된 실리콘 O-링에 대한 응력 대 스트레인 곡선을 도시하고 있다. 비-조사된 순수 O-링은 조사되었던 조립된 컬럼으로부터 제거된 조사된 샘플에 비해, 테스트 전에 물품 목록으로부터 취해졌다. 달리 말하면, 조사된 샘플은 튜브 벽과 유동 분배기 사이에서 압축(대략 20% 압축) 및 인장(유동 분배기에서 O-링 글랜드 내로 삽입되도록 스트레칭되는)을 경험하였으며, 이는 재료의 약간의 내부 크리이프에 기여할 수 있다. 상기 내부 크리이프는 도 17에 명백한, 항복 시까지는 스트레칭하지 않는 미세하게 긴 샘플을 생산할 것이다. 조사된 샘플 또한 날카로운 탄성 영역(탄성률), 높은 항복 및 파괴 응력, 및 파괴 지점까지 낮은 스트레인을 가지며, 이들 모두는 미세하게 강인하며 또한 더욱 탄성인 재료이다. 조사와 초기 압축/인장의 조합은 조사된 샘플을 순수 실리콘 O-링 보다 미세하게 더욱 탄성이고 강인하게 하였다. 표 4는 전술한 가정을 지지하고 있다.
조사된 그리고 비-조사된 실리콘 O-링의 인장 강도의 분석

샘플명
샘플 번호
직경(in)
파괴 시
인장 강도(PSI)
파괴 시
연신률(%)





순수 실리콘
O-링
1
0.213
752
420

2
0.213
751
410

평균
0.213
752
415

St Dev
0
.5
5





조사된 실리콘
O-링
1
0.200
933
310

2
0.200
918
300

평균
0.200
926
305

St Dev
0
8
5
예 7-기계적 특성-유동 분배기 O-링에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 크로마토그래피 컬럼 실리콘 O-링의 기계적 특성에 대한 감마선의 영향을 테스트하는 것이었다. 특히, O-링 샘플에 대한 경도값을 유도하는 것이 목적이었다.
컬럼 재료-OPUS™ 크로마토그래피 컬럼(리플라이젠 코포레이션)
● 14 cm 유동 분배기 O-링
방법
OPUS™ 크로마토그래피 컬럼 유동 분배기 O-링은 예 1에 기재된 바와 같이 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에 의해 감마선의 25 kGy의 원하는 타겟으로 15-40 kGy 사이로 감마선 조사되었다. 분배된 실제 투여량은 21.3-25.3 kGy 이었다.
조사 후, 인터텍 피티엘(메샤츄세츠, 필츠필드)이 ASTM D2240-05(2010)에 따라 경도 테스트를 실행하였다. 비-조사된 순수 실리콘 O-링의 5개의 샘플 및 조사된 실리콘 O-링이 준비되고 그리고 테스트되었다. 특정한 매개변수는 다음과 같다.
샘플 준비
인터텍 피티엘에 의해 O-링으로부터 절단된 섹션
공백 시간 간격
1 초
사용된 압자( indenter )
A
컨디셔닝
23℃ 에서 40+ 시간±2℃/50%±10% RH
테스트 상태
23℃±2℃/50%±10% RH
결과
표 5는 순수 실리콘 O-링과 조사된 실리콘 O-링의 정격 경도를 비교하고 있다. 재료 경도는 단위 듀로미터에 의해 기재되었으며, 이는 특정한 기구가 일정한 힘을 제공한 재료 내로 가압하는 거리를 나타내고 있다. 예를 들어, 이들 테스트는 1.1-1.5 mm 직경이고 절두된 35°원추체의 경화된 철골을 특정한 ASTM D2240 타입 A로 실행되었다. 원추체의 팁은 O-링으로부터 절단된 샘플 내로 8.064N 힘으로 가압된다. 상기 원추체의 팁은 재료의 경도에 따라 어느 곳이라도 0-2.54 mm 연장할 수 있다. 팁이 2.54 mm 이동한다면, 재료는 0 쇼어A 경도를 가질 것이며, 역으로 팁이 0 mm 이동한다면, 재료는 100 쇼어A 경도를 가질 것이다.
조사된 샘플은 73 쇼어A 경도를 가졌으며, 비-조사된 순수 실리콘 O-링은 77 쇼어A 경도를 가졌다. 벤더(vendor)는 실리콘 O-링이 75 쇼어A 경도를 가졌으며, 따라서 조사된 그리고 비-조사된 순수 샘플 모두는 평균값으로부터 2 표준편차이며, 이는 본 테스트와 관련된 a±5 이기 때문에 무시 가능한 것으로 간주될 수 있다.
조사된 그리고 비-조사된 실리콘 O-링의 경도 분석

샘플명
샘플 번호
두께(in)
경도, 쇼어A










순수 실리콘 O-링
1









0.204
77

2
77

3
77

4
79

5
76

평균
77

St Dev
1










조사된 실리콘 O-링
1









0.207
73

2
73

3
72

4
72

5
74

평균
73

St Dev
71
예 8- 아가로스 매체로 패킹된 OPUS ™ 컬럼에 대한 감마선의 영향
이 예의 목적은 패킹된 베드의 유동 특성이 이어지는 감마선 조사로 변화되는지의 여부를 결정하는 것이었다.
OPUS™ 컬럼(리플라이젠 코포레이션)은 세파로스 6 패스트 플로우 매체(지이 헬스케어)로 20 cm 내경(id) × 20 cm 베드 높이(BH)의 치수까지 패킹되었다. 초기 테스트가 수행되었고, 그 후 컬럼은 스테리스 이소메딕스(메사츄세츠, 노스버러)에서 36.3 kGy 내지 39.9 kGy의 투여량으로 감마선 조사되었으며, 그 후 재-테스트되었다.
테스트를 위해, 이론단(theoretical plate), 비대칭, 및 압력이 100 cm/hr 에서 결정되었다. 컬럼은 10% 아세톤 용액의 1% 컬럼 용적 펄스가 컬럼 내로 주입되기 전에, 3 컬럼 용적의 100 mM NaCl에서 평형되었다.
감마선 조사 전 및 후 컬럼 패킹된 베드의 성능 속성

컬럼 성능
단/m
비대칭
압력@ 100 cm/hr

감마선 조사 전
3295
1.2
0.36 bar

감마선 조사 후
2785
1.3
0.31 bar
결과
감마선 조사된 컬럼의 패킹된 베드에 대한 이론단의 개수, 비대칭, 및 압력 강하의 변화는 각각 20% 보다 작았다. 결과는 세파로스 6FT 와 같은 아가로스 매체로 패킹된 20 cm ID ×20 cm BH OPUS 컬럼의 일체성이 감마선의 살균 투여량에 이어 온전한 것으로 존재함을 나타내고 있다.
예 9-결합 능력에 대한 감마선의 영향
본 테스트의 목적은 감마선 조사 후 다양한 패킹 매체의 기능성 수준을 결정하는 것이었다. 단백질 A로 기능화된 실리카 및 아가로스 매체가 테스트되었다. 이들 친화성 패킹 매체에 대한 감마선 조사의 기능적 영향을 평가하기 위해, 정적 결합 능력(static binding capacity)(SBC) 및 동적 결합 능력(dynamic binding capacity)(DBC) 모드 모두에서 인체 다클론성(polyclonal) IgG(hIgG)에 대한 능력이 사용되었다.
방법
실리카 매체, Davisil®(W.R. Grace) 및 세파로스™ 4 패스트 플로우 특징부는 환원성 아미노화 화학적 성질을 사용하여 재조합물 단백질 A, rSPA(리플라이젠 코포레이션)으로 부동화되었다. 동일한 매체 또한 상이한 단백질 A 리간드, MB4[리플라이젠(Repligen)]으로 부동화되었다. MB4 는 G29A 돌연변이를 각각 갖는 멀티머 재조합물 단백질 A 리간드이다. rSPA 로 부동화된 세파로스 4FF 는 리플라이젠 코포레이션에 의해 CaptivA™PriMab™ 이라는 상표명으로 판매되고 있다. 모든 매체 샘플은 20% 에탄올 용액에 저장되었다. 부동화된 샘플의 절반은 제어되어 안전하게 보존되었으며, 다른 절반은 감마선 조사(28.6-33.5 kGy)를 위해 스테리스(메샤츄세츠, 노스버러)로 보내졌다.
각각의 매체의 100 ㎕ 용적이 1.5 ml 원심 튜브 내에 측정되었으며, 그리고 매체를 평형화하기 위해 1 ml 인산염 버퍼된 염분(phosphate buffered saline)(PBS)으로 3회 세척되었다. 10 g/L IgG(세라케어)의 1.0 ml가 매체에 추가되어, 빙글빙글 회전하여 30 분간 혼합되도록 허용되었다. 배향에 이어, 매체는 1.0 ml PBS 로 5회 세척되었다. 그 후, pH 2.8의 10 ml 100 mM 인산염의 추가에 의해 hIgG 가 희석되었다. 용출액의 hIgG의 양은 280 nm에서 UV 측정에 의해 결정되었다. 결합 능력(그램 IgG /L 매체)은 UV 280 결과를 100으로 곱하고 그 후 1.3의 흡광계수로 나눔으로써 계산되었다.
IgG 동적 결합 능력
각각의 매체의 약 3.42 ml 양은 10 cm(Omnifit, 0.66 cm ID)의 베드 높이를 생성하는 컬럼 내로 패킹되었다. 각각의 컬럼은 AKTA Explorer FPLC(지이 헬스케어)를 사용하여 2.0 ml/min의 유동으로 PBS 로 패킹되었다. IgG(세라케어)는 PBS 에서 2.2 mg/ml 로 희석되었으며, 그 후 3.0 분의 잔류 시간을 제공하는 유동 속도로 컬럼에 로딩된다. 결합 능력은 5% hIgG 돌파구(breakthrough)에서 결정되었다.
결과
그 결과가 표 7에 도시되어 있다.
감마선 조사 전 및 후 단백질 A 크로마토그래피 매체의 결합 능력



샘플
SBC(mg/mL)
DBC-3 min(mg/mL)

감마선
조사 전
감마선
조사 후
% 초기 제어
감마선
조사 전
감마선
조사 후
% 초기 제어

CaptivA™
45.0
35.1
78.0%
28
21.4
76.4%

세파로스 4FF-MB4
42.9
36.9
86.1%
27.5
19.2
69.8%

실리카-rSPA
48.8
42.5
87.2%
38.4
34.5
89.8%

실리카-MB4
33.0
24.5
74.2%
29.5
19.5
66.1%
이들 결과는 감마선 조사 후의 패킹 매체 기능의 퍼센트가 비-조사된 제어 샘플의 66.0 내지 90.0% 이었음을 나타내고 있다. 이 결과는 높은 수준의 감마선 조사(28.6-33.5 kGy)가 적용되어 예기치 않게 높아졌다. 이들 데이터 또한 테스트된 모든 매체에서 초기 능력의 65% 보다 높게 유지되었으며 또한 일부 경우에는 능력의 80%가 유지되었음을 나타내고 있다. 이 성능은 비-조사된 단백질 A 매체의 리터 당 20g 내지 42g의 항체 제품을 정제할 것이며, 따라서 단백질 정제 공정을 지지한다.
예 10-결합 능력과 관련하여 감마선 조사 중 매체 보호 용액 조성물의 영향
본 테스트의 목적은 감마선 조사 중 패킹 매체 보호 용액의 조성물이 노출 후 기능 능력에 대한 영향을 갖는지의 여부를 결정하는 것이었다. 단백질 A 로 기능화된 아가로스 매체가 복수의 상이한 용액에서 감마선 조사되었다. 동적 결합 어세이(assay)에서 이들 친화성 패킹 매체의 성능에 대한 감마선의 영향을 평가하기 위해, 동적 결합 능력(DBC) 모드에서 인체 다클론성 IgG(hIgG)에 대한 능력이 사용되었다.
방법
CaptivA™PriMab™(rSPA 로 부동화된 세파로스 4FF, 리플라이젠 코포레이션)의 13 × 20 ml 샘플이 13개의 상이한 용액 내에서 세척되었다. 각각 20 ml 샘플이 50% 슬러리 농도로 준비되었다. 13개 샘플의 각각은 40 kGy의 타겟된 감마선 투여량을 위해 스테리스(메샤츄세츠, 노스버러)로 보내졌다. 분배된 실제 투여량은 36.3 내지 39.9 kGy 이었다. 감마선 조사에 이어, 각각에 대해 DBC 가 결정되었다.
IgG 동적 결합 능력
각각의 매체의 약 1 ml 양이 컬럼(XK5, 0.5 cm ID) 내로 패킹되었다. 각각의 컬럼은 AKTA Explorer FPLC(지이 헬스케어)를 사용하여 1 ml/min의 유동으로 PBS 로 패킹되었다. hIgG(세라케어)는 PBS 에서 2.2 mg/ml 로 희석되었으며, 그 후 6분의 잔류 시간을 제공하는 유동 속도로 컬럼에 로딩된다. 결합 능력은 10% hIgG 돌파구에서 결정되었다.
결과
그 결과가 표 8에 도시되어 있다.
상이한 용액에서 감마선 조사된 단백질 A 크로마토그래피 매체의 결합 능력

상태
보호 용액
DBC(mg/mL)
% 초기 제어

감마선 조사 전
20% 에탄올
38
-














감마선 조사 후
탈이온수
3
7.9%

20% 에탄올, 200 mM 아스코르브산
26
68.4%

2% 벤질 알코올
42
110.5%

50 mM 아세테이트, pH 5
20
52.6%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올, pH 5
21
55.3%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올,
100 mM 아스코르브산, pH 5
19
50.0%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올,
200 mM 아스코르브산, pH 5
24
63.2%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올,
400 mM 아스코르브산, pH 5
24
63.2%

50 mM 아세테이트, pH 6
6
15.8%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올, pH 6
10
26.3%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올,
100 mM 아스코르브산, pH 6
12
31.6%

50 mM 아세테이트, 2% 벤질 알코올,
200 mM 아스코르브산, pH 6
13
34.2%

인산염 버퍼된 염분, 2% 벤질 알코올,pH 7
42
110.5%
결과는 단백질 A 매체가 감마선 조사된 용액이 기능적 능력에 대해 주요한 영향을 갖고 있음을 나타내고 있다. 이온수에서만, 상기 기능적 능력이 본래의 < 10% 로 감소된다. 종래의 예는 결합 능력이 28.6-33.5 kGy 사이의 투여량으로 20% 에탄올에서 조사 후 제어의 > 65% 이었다. 이는 지방족 1급 알코올이 단백질 A 분자를 포함하는 친화성 매체의 성능을 유지하는데 유리할 수 있음을 나타내고 있다. 이 실험에서 20% 에탄올 용액에 존재하는 200 mM 아스코르브산으로 유사한 결과가 얻어졌다.
예기치 않게, 아세테이트 또는 에탄올을 포함하지 않는, 2% 벤질 알코올을 갖는 용액에서 조사된 매체는 모든 기능적 결합을 유지하였다. 이는 감마선 노출 중 지방족 알코올의 존재가 보호 이점을 제공할 수 있다는 증거를 제공한다. 아세테이트가 존재하는 샘플은 pH 5 보다는 pH 6에서 덜 안정하였지만, 그러나 물 단독에 비해 더 많은 능력을 각각 보유하였다. 아세테이트 샘플에 아스코르브산의 존재는 농도 증가에 적절한 보호 효과를 제공하였다.
다른 실시예
본 발명이 그 상세한 설명을 참조하여 기재되었지만, 전술한 설명은 예시적이며 첨부된 청구범위의 범주에 의해 한정되는 본 발명의 범주를 제한하지 않도록 의도되는 것을 인식해야 한다. 다른 양태, 이점, 실시예, 및 수정은 첨부한 청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (43)

  1. 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 방법으로서:
    (a) 튜브를 준비하는 단계;
    (b) 상기 튜브에 패킹 매체를 추가하고 그리고 상기 패킹 매체에 보호 용액을 추가하는 단계로서, 상기 보호 용액은 물 또는 인산염 버퍼된 염분에서의 2% 벤질 알코올을 포함하는 단계,
    (c) 패킹된 컬럼을 생성하기 위해, 튜브의 양단부를 폐쇄하는 단계; 및
    (d) 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼을 생성하기 위해, 8 kGy 내지 40 kGy의 감마선의 투여량으로 상기 컬럼을 조사하는 단계로서, (1) 상기 패킹 매체는 면역글로불린(IgG)과 결합할 수 있는 포도상구균 단백질 A(SpA) 폴리펩티드로 기능화되고, (2) 이후의 상기 보호 용액에서의 감마선 조사로, 상기 패킹된 컬럼은 10-3 유기체/컬럼의 살균 보증 수준(SAL)을 갖고, 크로마토그래피 매체는 면역글로불린(IgG)에 대한 결합 성능의 적어도 80%를 유지하는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    크로마토그래피 컬럼은 튜브, 상기 튜브의 상부 및 바닥 내에 설치되는 제1 유동 분배기, 및 제2 유동 분배기를 포함하며, 상기 튜브, 제1 유동 분배기, 및 제2 유동 분배기는 각각 동일하거나 또는 상이한 플라스틱 재료로 제조되는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 플라스틱 재료는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 아세탈, 유리-충전된 플라스틱, 탄소 충전된 플라스틱, 유리-섬유 플라스틱, 또는 탄소-섬유 플라스틱을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 패킹 매체는 아가로스, 실리카, 세라믹, 또는 아크릴레이트나 셀룰로오스 기반 재료의 폴리머를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SpA 폴리펩티드는 전체-길이 야생형 SpA, 재조합물 SpA, SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 SpA 도메인을 포함하는 모노머 SpA 폴리펩티드, 또는 SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 SpA 도메인을 임의의 조합으로 포함하는 멀티머 SpA 폴리펩티드, 또는 그 기능적 등가물을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 SpA 폴리펩티드는 멀티머 SpA 폴리펩티드를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 멀티머 SpA 폴리펩티드는 SpA 도메인 B, C, 및 Z로부터 선택되는 4개 또는 5개의 SpA 도메인을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    모든 SpA 도메인은 동일한, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 멀티머 SpA 폴리펩티드는 5개의 SpA 도메인 C를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 튜브의 양단부를 폐쇄하는 단계는,
    한쪽 단부에 억지 끼워맞춤을 생성하기 위해, 튜브의 단부 내로 튜브 보다 미세하게 큰 유동 분배기를 삽입하는 단계;
    튜브에 패킹 매체를 추가하는 단계; 및
    튜브 내에 매체의 패킹된 베드를 생성하기 위해, 다른 유동 분배기를 삽입하는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  11. 청구항 1에 있어서,
    감마선 조사의 투여량은 8, 10, 15, 20, 25, 30, 33, 35, 또는 40 kGy인, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    감마선 조사 전에 기밀성 및 수밀성 용기 내에 컬럼을 밀봉하는 단계를 더 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    감마선 조사 전에 포위체의 이중층을 제공하기 위해, 제2 기밀성 및 수밀성 용기 내에 컬럼을 밀봉하는 단계를 더 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 준비 방법.
  14. 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼으로서:
    (a) 2개의 단부를 갖는 살균 중공 튜브; 및
    (b) 튜브 내의 살균 패킹된 크로마토그래피 매체를 포함하며,
    상기 튜브는 패킹된 컬럼을 생성하기 위해 양 단부에서 폐쇄되며,
    상기 튜브 내의 크로마토그래피 매체는, 면역글로불린(IgG)과 결합할 수 있는 포도상구균 단백질 A(SpA) 폴리펩티드로 기능화되는 패킹 매체를 포함하고, 그리고 물 또는 인산염 버퍼된 염분에서의 2% 벤질 알코올을 포함하는 보호 용액을 포함하며,
    상기 패킹된 컬럼은 10-3 유기체/컬럼의 살균 보증 수준(SAL)을 갖는, 크로마토그래피 컬럼.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 패킹된 컬럼은 10-6 유기체/컬럼의 SAL을 갖는, 크로마토그래피 컬럼.
  16. 청구항 14 또는 청구항 15에 있어서,
    크로마토그래피 컬럼은 튜브, 상기 튜브의 상부 및 바닥 내에 설치되는 제1 유동 분배기, 및 제2 유동 분배기를 포함하며, 상기 튜브, 제1 유동 분배기, 및 제2 유동 분배기는 각각 동일하거나 또는 상이한 플라스틱 재료로 제조되는, 크로마토그래피 컬럼.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 플라스틱 재료는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 아세탈, 유리-충전된 플라스틱, 탄소 충전된 플라스틱, 유리-섬유 플라스틱, 또는 탄소-섬유 플라스틱을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼.
  18. 청구항 14에 있어서,
    상기 패킹 매체는 아가로스, 실리카, 세라믹, 또는 아크릴레이트나 셀루로오스 기반 재료의 폴리머를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼.
  19. 청구항 14에 있어서,
    상기 SpA 폴리펩티드는 전체-길이 야생형 SpA, 재조합물 SpA, SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 SpA 도메인을 포함하는 모노머 SpA 폴리펩티드, 또는 SpA 도메인 A, B, C, D, E, 또는 Z로부터 선택된 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 SpA 도메인을 임의의 조합으로 포함하는 멀티머 SpA 폴리펩티드, 또는 그 기능적 등가물을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 SpA 폴리펩티드는 멀티머 SpA 폴리펩티드를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 멀티머 SpA 폴리펩티드는 SpA 도메인 B, C, 및 Z로부터 선택되는 4개 또는 5개의 SpA 도메인을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼.
  22. 청구항 21에 있어서,
    모든 SpA 도메인은 동일한, 크로마토그래피 컬럼.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 멀티머 SpA 폴리펩티드는 5개의 SpA 도메인 C를 포함하는, 크로마토그래피 컬럼.
  24. 청구항 14에 있어서,
    억지 끼워맞춤을 제공하기 위해 튜브의 내경 보다 미세하게 큰 외경을 갖는 유동 분배기를 더 포함하고, 상기 튜브의 양단부는 상기 유동 분배기에 의해 폐쇄되는, 크로마토그래피 컬럼.
  25. 청구항 14에 있어서,
    상기 컬럼은 기밀성 및 수밀성 용기 내에 밀봉되는, 크로마토그래피 컬럼.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 컬럼은 감마선 조사 전에 포위체의 이중층을 제공하기 위해 제2 기밀성 및 수밀성 용기 내에 추가로 밀봉되는, 크로마토그래피 컬럼.
  27. 살균 패킹된 크로마토그래피 컬럼으로서:
    제1 단부 및 제2 단부를 갖는 살균 중공 튜브;
    튜브의 제1 단부에 고정되는 살균성 제1 유동 분배기;
    튜브의 내경 보다 큰 외경을 갖는, 살균성 제2 유동 분배기;
    제1 및 제2 유동 분배기 사이에서 튜브에 충전되는 살균 패킹 매체로서, 면역글로불린(IgG)과 결합할 수 있는 포도상구균 단백질 A(SpA) 폴리펩티드로 기능화되는 패킹 매체를 포함하는 살균 패킹 매체; 및
    살균 패킹 매체에 추가된 보호 용액으로서, 물 또는 인산염 버퍼된 염분에서의 2% 벤질 알코올을 포함하는 보호 용액을 포함하며,
    상기 제2 유동 분배기는 패킹 매체로 충전되는 제1 및 제2 유동 분배기 사이에서 중공 튜브 내에 챔버를 형성하기 위해 튜브의 제2 단부 내에 고정되며, 상기 패킹된 크로마토그래피 컬럼은 10-3 유기체/컬럼의 살균 보증 수준을 갖는, 크로마토그래피 컬럼.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 컬럼은 10-6 유기체/컬럼의 SAL을 갖는, 크로마토그래피 컬럼.
  29. 청구항 27에 있어서,
    상기 컬럼의 패킹 매체는 감마선 조사로 조사되지 않은 컬럼에서 동일한 타입의 패킹 매체의 특정한 흡착 수준의 적어도 60%의 특정한 흡착 수준을 갖는, 크로마토그래피 컬럼.
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