CN103439446A - 使用rp-hplc法测定桦树皮中桦木醇含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物的含量检测领域，具体涉及一种RP-HPLC法测定桦树皮中桦木醇含量的方法。本发明色谱条件为：C₁₈(4.6×250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20，使用紫外检测器检测，检测波长为210nm，桦树皮提取液用甲醇超生提取。本发明检测方法中样品浓度与峰面积线性关系好、准确性高、具有良好的重现性和稳定性。测定桦木醇线性范围为0.1μg/ml～50μg/ml，线性相关系r＝1，桦树皮提取液重复实验RDS＝0.24％，稳定实验RDS＝0.687％。

Description

使用RP-HPLC法测定桦树皮中桦木醇含量的方法

技术领域

本发明涉及桦木醇含量检测方法，具体涉及桦树皮中桦木醇的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)含量测定。

背景技术

桦木醇(结构式见附图1)是一种五环三萜类化合物，又名白桦酯醇、桦木醇、桦木脑，分子式：C₃₀H₅₀O₂，溶于乙醇、乙醚、氯仿和苯，微溶于冷水、石油醚等有机溶剂。其植物主要是罗勒、青梅、桦木等的根、茎、叶、树干和树皮中，是一种重要的天然生物活性物质，具有消炎、抗病毒、抑制头发纤维中蛋白质溶解、改善受损头发光泽、促进头发生长等活性，可应用于食品、化妆品及医药等行业。桦木醇也是一种重要的药物合成中间体，如桦木醇β-桦木醇对人体黑色素瘤具有良好的抗癌效果，对前列腺癌、淋巴癌等疾病也有一定的治疗效果。在众多含有桦木醇的植物原料中，具有商业利用价值的主要是桦木树皮。但是近几年我国对桦木树皮中桦木醇的研究很少。孙宏(高效液相色谱法测定白桦树皮中儿茶素和白桦醇的含量，孙宏，张泽，化学分册，2009年第二期)报道，用色谱柱为C₁₈(150×6.0mm，5μm)，流动相为甲醇-水(75+25)混合溶液，检测波长为205nm进行含量检测。此外王遂(一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，王遂，杨传平，姜静，刘桂丰，东北林业大学)利用高效液相色谱条件为C₁₈色谱柱，流动相中有机相为乙腈，水相为体积含量为0.1％的磷酸水溶液，进行梯度洗脱。就目前检测桦木皮中桦木醇的含量的方法中存在检测结果准确度低，操作方法繁琐，线性关系差。本发明提供的方法样品浓度与峰面积线性关系好，测定准确性高，具有良好的重现性和稳定性，适用于桦树皮中桦木醇的含量测定。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的操作检测缺点，提供一种线性关系好，测定准确性高、具有良好的重现性和稳定性。为达上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明一个具体的实施例中，本发明采用反相高效液相色谱法测定桦树皮中桦木醇的含量。

本发明又一个具体的实施例中，相色谱仪选为美国Agilent，紫外检测器，所选色谱柱为C₁₈(4.6x250mm，5μm)。

本发明再一个具体的实施例中，流动相中有机相为甲醇，水相是体积含量为0.1％的磷酸水溶液，体积比为85-75∶15-25，体积比优选80∶20。

本发明进一个具体的实施例中，所述的进样量为1-10μl，优选5μl。

本发明还一个具体的实施例中，所述流动相流速为0.5-1.5ml/mim，优选1.0ml/mim

本发明最后一个具体的实施例中，桦树皮提取液用甲醇超声提取，桦木醇采用甲醇溶解，样品浓度为1.0mg/ml。

附图说明

图1桦木醇结构式

图2桦木醇标准品液相色谱图

图3桦树皮提取液液相色谱图

图4桦木醇标准品线性关系

图5桦木醇标准品工作曲线

具体实施方式

色谱条件：

采用Agilent高效液相色谱仪，用C₁₈色谱柱C₁₈(4.6x250mm，5μm)；

柱温：25℃；

检测器：紫外检测器，检测波长210nm；

流动相溶液：甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；

桦木醇标准溶液配制：精密称取10.0mg标准品，置于10ml容量瓶中，加甲醇超声使样品溶解并定容至刻度线。

桦树皮提取液配制：准确称取桦树皮粉末1.0g，将桦树皮粉末放在80℃烘箱中烘干，烘干的桦树皮粉末中加无水甲醇至100ml容量瓶中，超声提取50min，取上清液，用0.45μm有机滤膜过滤，即得到桦树皮提取液。

桦木醇含量计算根据公式：

W＝C×100ml/1.0g×100％

其中，C为待测样品的浓度(μg/ml)

W为桦木醇的含量

实施例1

按上述方法配制的桦木醇标准溶液，经一个0.2μm有机系针头滤器过滤后，注入1.5ml的样品瓶中，贴上标签，并放入液相色谱仪中，按本发明确定的检测方法，如下所述的色谱条件下进行测定。结果显示峰形良好，桦木醇的色谱峰与其他组分色谱峰完全分离，见图2所示。

其中，色谱柱：C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；色谱柱温度：25℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm。

实施例2

按上述方法配制的桦木醇提取液，用1ml注射器取上层清液，经2个0.2μm有机系针头滤器过滤后，注入1.5ml的样品瓶中，贴上标签，并放入液相色谱仪中，按本发明确定的方法，如下所述的色谱条件下进行测定。结果显示峰形良好，样品分离效果很好，见图3所示。

其中，色谱柱：C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；色谱柱温度：25℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm。

本发明的方法学考察

(1)线性关系考察

按上述方法配制的桦木醇标准溶液，经0.2μm有机系针头滤器过滤后注入液相色谱仪中，按本发明确定的方法，如下所述的条件下依次进样1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，对进样量和峰面积进行数据回归分析得r＝1，可见本方法的线性关系很好，见图4。

其中，色谱柱：C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；色谱柱温度：25℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm。

(2)线性范围考察

按上述配制1.0mg/ml的桦木醇标准溶液，用甲醇分别稀释成0.1μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml，经0.2μm有机系针头滤器过滤后，注入1.5ml的样品瓶中，贴上标签，并放入液相色谱仪中。按本发明确定的方法，如下所述的色谱条件下进行检测，并依次记录桦木醇标准品相应的峰面积，以标准品峰面积(Y)为纵坐标，标准品浓度(X)为横坐标进行线性回归，得线性方程为Y＝2.8913X+0.2507，即浓度在0.1μg/ml-50μg/ml范围内，桦木醇的含量和峰面积呈良好的线性关系，见图5所示。

其中，色谱柱：C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；色谱柱温度：25℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm。

(3)精密度考察

按上述方法制备的桦树皮提取液重复进样5次，并按本发明确定的方法，如下所述的色谱条件下进行测定，并由上述的线行方程：Y＝2.8913X+0.2507和桦木醇含量计算方程：W＝C×100ml/1.0(C为样品的浓度，即为X)，即可测的桦树皮中桦木醇的含量。结果表明：本发明测定桦木醇含量的方法精密度高，重现性好，相对标准偏差小，RSD＝0.24％，1g桦树皮中含163.0582mg的桦木醇，结果见下表。

表1桦树皮提取液重复实验结果及桦木醇含量结果

其中，色谱柱：C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；色谱柱温度：25℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm。

(4)溶液的稳定性考察

按上述制备的桦木醇标准溶液，放置，分别于不同时间进样。按本发明分析方法，如下所述色谱条件进样，并记录不同时间的峰面积。结果表明：本发明测定溶液在8小时内桦木醇的峰面积未见明显变化，见下表。

表2桦木醇稳定性结果

其中，色谱柱：C₁₈(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液＝80∶20；色谱柱温度：25℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测器：紫外检测器；检测波长：210nm。

Claims (6)

1.本发明旨在采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定桦树皮中桦木醇的含量，使用紫外检测器，选用液相色谱仪为美国Agilent，所述的液相色谱柱为C₁₈，以甲醇和0.1％磷酸水溶液为流动相，桦树皮提取液采用甲醇或乙醇超生提取，桦木醇采用甲醇或已睛溶解。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为：C₁₈(4.6×250mm，5μm)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相以甲醇与0.1％磷酸水溶液混合组成的体积比为85-75∶15-25，体积比进一步优选80∶20。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，最佳检测波长为210nm，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，进样体积为5μl。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，桦树皮提取液用甲醇超声提取，固液比为1∶100，0.45μm滤膜过滤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，桦木醇采用甲醇溶解，样品浓度为1.0mg/ml。

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