CN103197005B

CN103197005B - 一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法

Info

Publication number: CN103197005B
Application number: CN201310079961.1A
Authority: CN
Inventors: 王遂; 杨传平; 姜静; 刘桂丰; 赵慧
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: CN103197005A

Abstract

一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，涉及一种白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法。本发明是要解决现有方法不能完全分离三种物质、检测结果不准确的问题。该方法按以下步骤进行：一、利用超声波辅助技术提取白桦树皮提取液，二、采用反相高效液相色谱法，对三种物质进行定性定量分析。该方法对三种三萜类物质提取工艺简单，容易实施，提取率较高；检测手段先进，分离效果好，灵敏度高，具有良好的重现性和稳定性。适用于白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的含量分析。

Description

一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法

技术领域

本发明涉及一种白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法。

背景技术

三萜类（triterpenoids）化合物是一类基本母核由30个碳原子组成的，在生源关系上由鲨烯（squalene）衍生而来的萜类化合物，在植物中分布广泛，具有广泛的药理活性，具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物、抗生育等活性。白桦脂醇、白桦脂酸和齐墩果酸均是重要的三萜化合物。

白桦脂醇（Betulin），又名桦木脑，属于羽扇豆烷型的五环三萜类化合物，分子式为C₃₀H₅₀O₂，相对分子质量442.72，白色针晶，熔点256～257℃，溶于乙醇、氯仿和苯，微溶于冷水、石油醚等，存在于多种植物中，尤其在白桦树皮中的含量较高。白桦脂醇具有重要的药理作用，实验表明，白桦脂醇及其衍生物作为生物抑制剂在HIV和癌症治疗方面表现出了巨大的潜能。同时，白桦脂醇具有消炎、抗病毒、抗氧化、抑制头发纤维中蛋白质溶解、改善受损头发光泽、促进头发生长等活性，可应用于食品、化妆品及医药等行业。此外，白桦脂醇作为白桦脂酸的前体，可以用来人工合成其衍生物。

白桦脂醇

白桦脂酸（Betulinic acid），又名桦木酸，是白桦脂醇的重要衍生物，也属于羽扇豆烷型五环三萜化合物，分子式为C₃₀H₄₈O₃，相对分子质量456.71，熔点为295～298℃，为最具开发前景的三萜类化合物之一。白桦脂酸具有极强的抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌、抗疟和抗蠕虫活性，且对心脑血管系统亦有一定作用。

白桦脂酸

齐墩果酸（Oleanic acid），又名土当归酸，属齐墩果烷型五环三萜化合物，分子式为C₃₀H₄₈O₃，相对分子质量456.71，熔点300℃。具有护肝降酶、促进肝细胞再生、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用，还具有降血糖、降血脂、镇静的作用，是开发治疗肝病和降血糖等药物有效成分。

齐墩果酸

天然的三萜不溶或难溶于水，易溶于低极性的有机溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、乙醚等，传统提取分离方法，一般根据其溶解性差异采用不同的有机溶剂进行提取分离。比如采用极性较小的溶剂如氯仿、乙醚等提取。近来，一些新型的提取技术逐渐兴起，如超临界流体萃取法、超声循环提取法、半仿生提取法、微波萃取法等在三萜类化合物提取上显示出了巨大优势。色谱分离方法和波谱结构测定技术的迅速发展，使得对三萜这种结构复杂的化合物的定性定量分析成为可能。由于三萜化合物汽化困难，故实际使用中，人们更多选用高效液相色谱进行一般定性定量测定。在现有可查范围内，利用HPLC同时测定白桦树皮中白桦脂醇、白桦脂酸和齐墩果酸未见报道。目前，对三萜的测定多采用等度洗脱（张泽等.高效液相色谱法测定白桦树皮中白桦酯醇的含量，林产化学与工业，2004年1月，61-63页；范桂枝等.白桦不同部位及种源间白桦酯醇含量的差异分析，林产化学与工业，2007年4月，103-106页；潘萍等.Rp—Hplc测定大叶紫珠中桦木酸的含量，中国中药杂志，2008年，33卷第7期，753-755页），这些方法的缺点是：不能完全分离白桦脂醇、白桦脂酸和齐墩果酸三种物质，且对于目标峰进行峰纯度分析显示峰中含有较多杂质，严重干扰了测定结果的准确性。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术不能完全分离三种物质、检测结果不准确的问题，提供一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法。

本发明的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法包括如下步骤：

一、白桦树皮提取液的制备：将白桦树皮在超低温条件下，所述的超低温为在液氮条件下研磨白桦树皮，以26～30Hz频率研磨1～3min，研磨后得到的粉末在80℃烘箱中烘干，向烘干得到的白桦树皮粉末中加入无水乙醇，采用超声波提取，在超声波频率40kHz，功率100W，水温48～52℃环境中，超声提取55～65min，取上清液用有机滤膜过滤，即得到白桦树皮提取液，其中所述的烘干后的白桦树皮粉末和无水乙醇的质量与体积比为（0.5～2.0）g：100mL；

二、将白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的标准品分别用无水乙醇配制成7种标准工作液；

三、将标准工作液与步骤一中得到的待测样品溶液依次注入高效液相色谱仪，以体积百分含量为0.1％磷酸水溶液为水相，乙腈为有机相进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱过程中有机相的浓度变化为线性结合“J”型和反“J”型曲线；流动相中乙腈的体积百分含量依次为55%～80%、80%～90%,、90%～100%、100%～55%；

其中，高效液相色谱条件为：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C₁₈色谱柱，规格为4.6mm×250mm×5μm，柱温为30℃，流动相中有机相为乙腈，水相为体积百分含量为0.1％磷酸水溶液，流速0.5～1.2mL/min，检测波长195nm，进样量10μL；

四、以标准工作液目标峰峰面积和相应物质浓度建立标准曲线，根据相应峰的保留时间和光谱图确定目标峰，采用外标法定量计算白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸含量，即完成检测。

本发明包含以下有益效果：

1、本发明使用无水乙醇为提取液，安全环保，价格低廉，提取率较好；2、利用超声波辅助提取技术，大大节约了提取时间；3、使用乙腈-水（含0.1%磷酸）为流动相，既避免了甲醇-水流动相体系在低紫外波长条件下无法检测的困扰，同时改善了目标峰峰型，使峰拖尾情况大大改善；4、梯度洗脱过程中有机相的浓度采取非线性变化，利用提取液中各组分容量因子（k’）的不同而实现峰的分离，使目标峰分离度增加，峰纯度提高，取得了满意的效果，同时梯度洗脱中流动相比例的调控，可以将强保留杂质洗去，保证连续进样的稳定性；5、本发明所得色谱图，提取液中大部分峰分离良好，峰型尖锐，特别适合于指纹图谱分析；6、三萜分离检测灵敏度高，稳定性和重现性好，在一定范围内，三种三萜类物质的标准曲线线性关系良好（r²≥0.999），三种物质保留时间相对标准偏差（RSD）均小于0.06%，三种三萜含量测定相对标准偏差（RSD）均小于0.4%，因此本发明的检测结果准确；7、检出限（LOD）白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇依次为0.6μg/ml、1.5μg/ml和3.7μg/ml，定量限（LOQ）为0.7μg/ml、1.7μg/ml和3.8μg/ml，测定方法的加标回收率从白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇依次为101.5%、105.2%和102.4%，满足分析需要。

附图说明

图1为按本发明所设色谱条件完成检测之标准工作液色谱图；

图2为按本发明所设色谱条件完成检测之白桦（422）色谱图；

图3为图1之标准工作液色谱图三个目标峰光谱图；

图4为图2之白桦（422）色谱图三个目标峰光谱图；

图5为实施例二中方法Ⅱ完成检测之标准工作液色谱图；

图6为实施例二中方法Ⅱ完成检测之白桦（422）色谱图；

图7为实施例二中方法Ⅲ完成检测之标准工作液色谱图；

图8为实施例二中方法Ⅲ完成检测之白桦（422）色谱图；

图9为按本发明所设色谱条件完成检测之四倍体白桦（436）色谱图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法包括以下步骤：

一、待测样品溶液的制备：将白桦树皮放入样品破碎系统，在超低温条件下，以26～30Hz频率研磨1～3min，研磨后得到的粉末在80℃烘箱中烘干，向烘干得到的白桦树皮粉末中加入无水乙醇，超声波辅助提取55～65min，取上清液用有机滤膜过滤，即得到白桦树皮提取液，其中所述的烘干后的白桦树皮粉末和无水乙醇的质量与体积比为（0.5～2.0）g：100mL；

三、将标准工作液与步骤一中得到的待测样品溶液依次注入高效液相色谱仪，以体积百分含量为0.1％磷酸水溶液为水相，乙腈为有机相进行梯度洗脱；

其中，高效液相色谱条件为：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm×5μm，柱温为30℃，流动相中有机相为乙腈和水相为体积百分含量为0.1％磷酸水溶液，流速0.5～1.2mL/min，检测波长195nm，进样量10μL；

四、以标准工作液目标峰峰面积和相应物质浓度建立标准曲线，根据相应峰的保留时间和光谱图确定目标峰，外标法定量计算白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸含量。

本实施方式包含以下有益效果：

1、本实施方式使用无水乙醇为提取液，安全环保，价格低廉，提取率较好；2、利用超声波辅助提取技术，大大节约了提取时间；3、使用乙腈-水（含0.1%磷酸）为流动相，既避免了甲醇-水流动相体系在低紫外波长条件下无法检测的困扰，同时改善了目标峰峰型，使峰拖尾情况大大改善；4、梯度洗脱过程中有机相的浓度采取非线性变化，利用提取液中各组分容量因子（k’）的不同而实现峰的分离，使目标峰分离度增加，峰纯度提高，取得了满意的效果，同时梯度洗脱中流动相比例的调控，可以将强保留杂质洗去，保证连续进样的稳定性；5、本实施方式所得色谱图，提取液中大部分峰分离良好，峰型尖锐，特别适合于指纹图谱分析；6、三萜分离检测灵敏度高，稳定性和重现性好，在一定范围内，三种三萜类物质的标准曲线线性关系良好（r²≥0.999），三种物质保留时间相对标准偏差（RSD）均小于0.06%，三种三萜含量测定相对标准偏差（RSD）均小于0.4%，因此本发明的检测结果准确；7、检出限（LOD）白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇依次为0.6μg/ml、1.5μg/ml和3.7μg/ml，定量限（LOQ）为0.7μg/ml、1.7μg/ml和3.8μg/ml，测定方法的加标回收率从白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇依次为101.5%、105.2%和102.4%，满足分析需要。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的超低温为在液氮条件下研磨白桦树皮。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述的步骤一中所述的以28Hz频率研磨2min。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中所述的采用超声波提取，是以无水乙醇为提取液，在超声波频率40kHz，功率100W，水温48～52℃环境中，提取55～65min。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中所述的采用超声波辅助提取，是以无水乙醇为提取液，在超声波频率40kHz，功率100W，水温50℃环境中，提取60min。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中所述的有机滤膜过滤是采用0.45μm孔径的有机滤膜。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中所述的烘干后的白桦树皮粉末和无水乙醇的质量与体积比为1g：100mL。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中所述的7种标准工作液白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的浓度分别为：a、2.5μg/mL、25μg/mL和10μg/mL；b、5μg/mL、50μg/mL和20μg/mL；c、10μg/mL、100μg/mL和40μg/mL；d、20μg/mL、200μg/mL和80μg/mL；e、50μg/mL、500μg/mL和200μg/mL；f、100μg/mL、1000μg/mL和400μg/mL；g、150μg/mL、1500μg/mL和600μg/mL。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中所述的梯度洗脱过程中有机相的浓度变化为线性结合“J”型和反“J”型曲线。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤三中的流动相中乙腈的体积百分含量依次为55%～80%、80%～90%,、90%～100%、100%～55%。其它与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤四所述的对样品色谱图中目标峰的确定采用保留时间和紫外特征光谱图与标品色谱图相匹配的方法。其它与具体实施方式一至十之一相同。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：

在东北林业大学白桦强化种子园采集1g二倍体白桦树皮（代号410），放入样品破碎系统，在超低温条件下（液氮处理），以28Hz频率研磨2min，将研磨后得到的粉末放入称量瓶，在80℃烘箱中烘干，每隔12h称量1次，直至连续三次称重变化小于0.1%为止。取3份0.1g烘干后白桦粉末，分别加入10mL无水乙醇，依次编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。将Ⅰ在超声波频率40kHz，功率100W，水温50℃环境中，提取60min；将Ⅱ在超声波频率40kHz，功率60W，水温40℃环境中，提取15min；将Ⅲ在超声波频率40kHz，功率60W，水温50℃环境中，提取30min。将上述提取后得到上清液过0.45μm有机滤膜，即得到白桦树皮提取液。

将1.5mL白桦树皮提取液，加入2mL进样瓶（Waters），放入4℃冰箱备用。采用二极管阵列检测器（PDA），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱（4.6mm×250mm×5μm），以乙腈-水（含0.1%磷酸）为流动相，梯度洗脱，柱温30℃，进样量10μL，样品间进样延迟5min，在195nm波长条件下检测。梯度洗脱程序如表1：

表1 梯度洗脱程序

将3个样品依次进样，完成检测。利用Empower3.0软件，根据相应峰的保留时间和光谱图确定样品中的目标峰，根据建立的标准曲线，外标法定量计算白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸含量。结果见表2：

表2 白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸含量检测结果

由结果可知，编号Ⅰ所用提取方法得到的三种三萜含量均优于其余两种方案。

实施例二：

在东北林业大学白桦强化种子园采集2g二倍体白桦树皮（代号422），放入样品破碎系统，在超低温条件下（液氮处理），以28Hz频率研磨2min，将研磨后得到的粉末放入称量瓶，在80℃烘箱中烘干，每隔12h称量1次，直至连续三次称重变化小于0.1%。取3份0.1g烘干后的白桦树皮粉末，分别加入10mL无水乙醇，依次编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。均在超声波频率40kHz，功率100W，水温50℃环境中，提取60min。将上述提取后得到上清液过0.45μm有机滤膜，即得到白桦树皮提取液。

取1.5mL白桦树皮提取液，加入2mL进样瓶（Waters），放入4℃冰箱备用。采用二极管阵列检测器（PDA），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C₁₈色谱柱（4.6mm×250mm×5μm），以乙腈-水（含0.1%磷酸）为流动相，柱温30℃，进样量10μL，样品间进样延迟5min，梯度洗脱程序见表3：

表3 梯度洗脱程序

检测波长195nm，梯度洗脱70min，其参照标准品色谱图见图1，标准品光谱图见图3，样品色谱图见图2，样品光谱图见图4。将Ⅱ按照流动相乙腈：水=90：10（V/V），流速1.2mL/min，检测波长210nm，等度洗脱20min（赵一楠.黑龙江省白桦桦木醇、羽扇醇的分布特征.东北林业大学硕士研究生毕业论文.2011年），其参照标准品色谱图见图5（三个峰自左向右依次为白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇），样品色谱图见图6。将Ⅲ按照流速1.2mL/min，检测波长210nm，梯度洗脱程序，10min内流动相乙腈的比例由90%线性升高到100%，并保持13min，随后在2min内线性降为90%，洗脱25min（王倩.白桦树皮三萜类物质的分布规律.东北林业大学硕士研究生毕业论文.2009年），其参照标准品色谱图见图7（三个峰自左向右依次为白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇），样品色谱图见图8。

观察各色谱图，结果发现，方法Ⅱ、Ⅲ三个目标峰在样品中由于杂质的干扰，均未达到基线分离，且峰型扩展，灵敏度低，进一步对目标峰光谱图比对发现，各峰中均不同程度含有杂质，峰纯度较低。而方法Ⅰ所要分离检测的三个目标峰与邻近峰达到了基线分离，峰型尖锐，无拖尾，灵敏度高，对相应峰的光谱比对亦显示峰纯度较好。对比三种方法样品色谱图，发现方法Ⅰ分离并检测出了更多的峰，且大多数峰峰型良好，这不仅说明该方法分离出了更多的物质，具有更高的准确性，其得到的色谱图还可应用在指纹图谱研究中，为分析白桦品种，进行质量控制等进一步研究打下基础。

实施例三：

在东北林业大学白桦强化种子园分别采集二倍体白桦树皮（代号422）和四倍体白桦树皮（代号436）各1g，放入样品破碎系统，在超低温条件下（液氮处理），以28Hz频率研磨2min，将研磨后得到的粉末放入称量瓶，在80℃烘箱中烘干，每隔12h称量1次，直至连续三次称重变化小于0.1%。分别取烘干后的二倍体和四倍体白桦树皮各0.1g，依次编号为Ⅰ和Ⅱ，各加入10mL无水乙醇（分析纯），均在超声波频率40kHz，功率100W，水温50℃环境中，提取60min。滤液过0.45μm有机滤膜，即得到白桦树皮提取液。

取1.5mL上述提取液，加入2mL进样瓶（Waters），放入4℃冰箱备用。采用二极管阵列检测器（PDA），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C₁₈色谱柱（4.6mm×250mm×5μm），以乙腈-水（含0.1%磷酸）为流动相，柱温30℃，进样量10μL，样品间进样延迟5min，将Ⅰ按照表4程序梯度洗脱：

表4 梯度洗脱程序

检测波长195nm，梯度洗脱70min。编号Ⅰ所得色谱图见图2，编号Ⅱ所得色谱图见图9。观察得到的色谱图，发现所测三种三萜均达到基线分离，说明该方案同样适用于不同倍性白桦树皮中白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇的测定。

Claims

1.一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，其特征在于上述方法包括以下步骤：

三、将标准工作液与步骤一中得到的白桦树皮提取液依次注入高效液相色谱仪，以体积百分含量0.1％磷酸水溶液为水相，乙腈为有机相进行梯度洗脱；所述的梯度洗脱过程中有机相的浓度变化为线性结合“J”型和反“J”型曲线；流动相中乙腈的体积百分含量依次为55%～80%、80%～90%,、90%～100%、100%～55%；

其中，高效液相色谱条件为：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C18色谱柱，规格为4.6mm×250mm×5μm，柱温为30℃，流动相中有机相为乙腈，水相为体积百分含量为0.1％磷酸水溶液，流速0.5～1.2mL/min，检测波长195nm，进样量10μL；

2.根据权利要求1中所述的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，其特征在于步骤一中所述的以28Hz频率研磨2min。

3.根据权利要求2中所述的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，其特征在于步骤一中所述的采用超声波提取，是以无水乙醇为提取液，在超声波频率40kHz，功率100W，水温50℃环境中，提取60min。

4.根据权利要求3中所述的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，其特征在于步骤一中所述的用有机滤膜过滤是采用0.45μm孔径的有机滤膜。

5.根据权利要求4中所述的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，其特征在于步骤一中所述的烘干后的白桦树皮粉末和无水乙醇的质量与体积比为1g：100mL。

6.根据权利要求5所述的一种白桦树皮中白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的检测方法，其特征在于步骤二中所述的7种标准工作液白桦脂酸、白桦脂醇和齐墩果酸的浓度分别为：a、 2.5μg/mL、25μg/mL和10μg/mL；b、5μg/mL、50μg/mL和20μg/mL；c、10μg/mL、100μg/mL和40μg/mL；d、20μg/mL、200μg/mL和80μg/mL；e、50μg/mL、500μg/mL和200μg/mL；f、100μg/mL、1000μg/mL和400μg/mL；g、150μg/mL、1500μg/mL和600μg/mL。