CN103439163A - 活版式组织芯片制备方法及制备仪器 - Google Patents

Abstract

一种活版式组织芯片制备方法及制备仪器，所述制备仪器由切割模块、微型线切割机、受体蜡模、进给工作台四部分连接组成；切割模块为底板上安装切割模块、夹紧螺钉和铡刀，底板上加工有定位孔和缺角；所述的受体蜡模为整个蜡块上预制有多个空孔，所述的进给工作台包括横向步进电机、纵向步进电机、编码器、导轨和滚珠丝杆；所属的制备方法包括：1）受体蜡模的制备；2）蜡芯的制备；3）向受体蜡模置入蜡芯；4）切片。本发明机械自动化操作，定位准确，省时省力，误差小，效率高，极向易于识别，样品组织损伤小。

Description

活版式组织芯片制备方法及制备仪器

技术领域

本发明涉及生物和医学领域中一种重要的实验方法及装置，尤其是涉及一种活版式组织芯片制备方法及制备仪器。

背景技术

组织的阵列，也称为组织微阵列（TMAS），即在一个单一的受体块{接收块}或石蜡块上放有多个不同的组织样本。用切片机将受体块{接收块}按通常方法进行切片，得到标本。

组织微阵列技术是一项重大的实验技术革新，临床病理学家和生物学家利用阵列生物组织和病理标本的切片进行分析，获得高通量生物组织和病理标本状况及变化的关键信息。

通过利用组织芯片，科学家们研究了组织或（和）细胞结构的信息，细胞的功能和表型、亚细胞的基因表达、及蛋白定位和定量表达等问题。

借助组织微阵列技术，可将大量的组织和病理标本整合到一张芯片上，从而使实验室具备规模化组织化学及标准化组织病理检测方法。这种新的技术广泛适用于高通量组织表型检测、大规模药物筛选、配体以及其它生物反应测试等。

组织阵列的制造是非常耗时的，这是由于制作过程中需要使用中空的取样针从各种组织或样本块，冲压制备组织芯，逐一修整组织芯后，再将组织芯按既定顺序放置在同一个受体块里。有时样本组织数目较多时，这种重复性操作非常费时费力。

现有的组织芯片的制作技术绝大部分采用取样针操作，这种方法存在如下不足：取样针采样多以盲穿方式获得组织芯，取样点定位不准确，存在样本代表性不高；采样针取样以环转方式取样，尽管对供体组织块或蜡块影响较小，但难以保证所取组织芯的完整性，制备的蜡芯中组织压缩、变形、断裂等问题严重；另外取样针所取样深度不易控制，尽管现有机械取样装置能精确控制穿刺深度，但对于较薄的样品取样时，可能导致蜡芯前端为空白蜡芯，因此制备得组织芯片中组织芯不位于同一平面，切片后的芯片出现空位点，降低了芯片制备效率，不便于较薄、及上皮和囊壁等组织样品的展示。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：解决上述现有技术存在的问题，而提供一种活版式组织芯片制备方法及制备仪器，机械化自动化操作，定位准确，省时省力，误差小，样品组织极向性易于标识和识别，样品组织损伤小，单一芯片包含多种标本或样品组织信息。

本发明采用的技术方案是：

一种活版式组织芯片制备仪器，由切割模块、微型线切割机、受体蜡模、进给工作台四部分连接组成；所述的切割模块为底板上安装切割模板、夹紧螺钉和铡刀，在底板上还加工有定位孔和缺角；所述的受体蜡模安装在托盘上，托盘上加工有定位销孔，受体蜡模为整个蜡块上预制有多个略大于蜡芯的空孔，空孔有序排列；所述的进给工作台包括横向步进电机、纵向步进电机、编码器、导轨和滚珠丝杆，步进电机连接驱动滚珠丝杆，滚珠丝杆再连接驱动导轨，导轨与托盘连接固定，或者导轨与切割模块的底板连接固定。

一种基于上述活版式组织芯片制备仪器的活版式组织芯片制备方法，其具体方法为：

1）受体蜡模的制备：

上模为阳模，下模为阴模，制造受体蜡模时，先通过热台或恒温孵箱将蜡模预热至56℃。将预热后上、下模合上，再从两边的浇蜡口同时快速注入融化后的蜡液,然后轻微振荡下模，使得蜡液能充分的注满下模，下模注满蜡水后，将上、下模具在室温下保持静止，待蜡充分冷却凝固后拔出上模，从而得到受体蜡模，再按预先设计的顺序，将受体蜡模的每一个空孔进行二位编码，并记录下来；

2）蜡芯的制备：

第一步，从包埋盒里取出供体蜡块放置于切割模板上，使得供体蜡块的两边与切割模板右边和前边相接触；

第二步，将夹紧螺钉旋下，并在夹紧螺钉正下方各放一张方形塑料薄片，便于夹紧螺钉将供体蜡块夹紧；

第三步，由于供体蜡块边缘部分不含样本组织，于是使用薄且锋利的铡刀将其边缘部分切除，相比直接使用线切割大大提高工作效率；

第四步，铡刀切除边缘部分后，对含有样本组织的核心部分做好样品组织的标示，并记录下来，方便后续辨识；

第五步；使用微型线切割机沿着切割模块上的缺角走丝，从而切下横截面与缺角部分大小尺寸一致的蜡芯；

3）向受体蜡模置入蜡芯：

第一步，将制备好的受体蜡模放入托盘中，并将托盘与进给工作台装配连接，或者将切割模块与进给工作台装配连接；

第二步，通过定位销钉将切割模板上的缺角与受体蜡模位于第一排、第一列的空孔对准，准确定位；由此类推，此后拔出其中一个销钉，移动另一个销钉，使得缺角与第一排或者第一列的另一空孔一一对齐；

第三步，通过线切割方法切割供体蜡块制备的蜡芯，在切割完毕后，依靠自身重力垂直落下，或者操作植入事先与缺角对齐的受体蜡模的空孔内，每个空孔，只植入一个蜡芯；

第四步，当与切割模板上缺角对齐的空孔植入蜡芯后，操作步进电机使得工作台横向或者纵向进给，进给距离与两相邻空孔中心之间的长度相等，从而实现更换新的空孔与切割模板上缺角部分对齐；切换结束后，要立刻锁定进给操作手柄，重复上述操作使得受体蜡模每个空孔都植入蜡芯，植入的蜡芯都是事先标识过的样本组织，植入相应的空孔后将它们一一对应的关系建立数据库，以便后续查询；

4）切片：

第一步，受体蜡块与蜡芯初步融合：当受体蜡模里的所有空孔都植入了蜡芯后，将托盘放置于试验热台或孵箱中，56-60℃孵育融合，实时观察，待蜡块底部有蜡液溢出，及时转至室温固化；

第二步，蜡液准备：将包埋机中石蜡预热融化，将蜡液温度调整至68-72℃； 

第三步，植入蜡芯后蜡块的再次包埋：初步融合后，蜡块中可有空腔形成，且蜡块上半部分不整齐，不利于将含蜡芯的蜡块固定于切片机上完成切片。再次包埋时，可将病理包埋机内的预热蜡液沿着托盘壁注入植满蜡芯的受体蜡模里，避免直接倒在蜡模上。注入预热的蜡液时，轻微振荡托盘，使得蜡水完全注满受体蜡模，避免形成空腔；蜡液注入完毕后，将托盘保持静止置于室温条件下充分冷却至完全固化；

第四步，制片：将含有蜡芯的受体蜡模取出。修整标记后，融合后蜡块固定于组织切片机上切片、制片，得到一个切片上含有的多种样本组织及具有的多种样本组织信息的芯片。

上述技术方案中，所述的微型线切割机为成熟的市场产品，市场有购。

工作原理：

本发明将含不同样品组织的多个蜡芯放在同一个受体蜡模里，当受体蜡模里每一个空孔都植入蜡芯后，通过预热和加入蜡液，受体蜡模和组织芯充分融合，形成多组织芯的蜡块；所制得含有多种样本组织蜡芯的供体蜡块，经冷却、固化、切片、制片，取得含有多种样本组织信息的高通量的芯片。

本发明的制备蜡芯是通过线切割沿着切割模板的缺角部分走丝切割供体蜡块，从而切割下横截面与切割模板缺角部分大小尺寸一致的蜡芯，蜡芯长度为供体蜡块的厚度。

为了解决取样针对样本组织的损伤，本发明采用影响区域非常小的线切割的办法切割含有样本组织的供体蜡块得到供体蜡芯，在修整供体蜡块不含样本组织的边缘部分，采用铡刀切割，大大提高切割的工作效率。

为了解决普通制备组织芯片方法中样本组织的方向表示困难的难题，本发明使得含样品组织蜡芯从切割制备开始到落入受体蜡模整个过程它的方向不发生任何变化，因而切割前，在供体蜡块里事先标识好样本组织的里侧和外侧的方向，此后制得的蜡芯和熔合后受体蜡块中的样本组织与其保持方向上的一致。

为了解决蜡芯植入受体蜡模这一过程中手工操作的误差大，效率低难题，本发明采用全机械化操作，当蜡芯从供体蜡块上切割下来后，将依靠自身重力直接落入，或者操作植入事先与缺角对齐的受体蜡模的空孔内，每个空孔，只植入一个蜡芯，从而实现向受体蜡模内准确植入样品的操作。

当受体蜡模的其中一个孔植入了蜡芯后，通过操作进给工作台的电机，实现更换后续相邻的空孔与切割模块缺角部分对准，这种机械化进给运动具有精确度高，效率高的优点。

优点效果

本发明在切割不含样本组织的供体蜡块的边缘部分，没有直接使用线切割，而是先采用铡刀切除不含样本组织的边缘部分，大大提高工作效率。

本发明在通过线切割的办法制备供体蜡芯，该方法由于线切割的影响区域较小，对样本组织的损失非常小；从供体蜡块上切割下来的蜡芯从切割开始到落入受体蜡模的过程中，方向不改变，因而该装置制备的蜡芯具有很好的极向性，便于标识样本组织的内侧和外侧；切割模块部分和受体蜡模之间采用定位销定位，能够快速准确定位；受体蜡模相对切割模块的相对运动，通过操作进给工作台的电机实现横向和纵向进给运动，这种机械化的进给运动相比手工移动具有准确度性好，工作效率高等优点。

附图说明

    图1为本发明受体蜡模制造模具结构示意图；

图2为本发明受体蜡模结构示意图；

图3为本发明切割模块结构示意图；

图4为本发明受体蜡模与进给工作台装配示意图；

图5为本发明活版式组织芯片制备仪器的总装配示意图。

附图标注说明：

1-托盘，2-横向步进电机，3-编码器，4-导轨，5-滚珠丝杆，6-铡刀，7-夹紧螺钉，8-切割模板，9-底板，10-定位销钉，11-受体蜡模，12-定位孔，13-纵向步进电机，14-下模，15-缺角，16-浇蜡口，17-上模，18-切割模块定位孔。

具体实施方式

参见图1—图5，本发明的活版式组织芯片制备仪器，由切割模块、微型线切割机、受体蜡模、进给工作台四部分连接组成；所述的切割模块为底板上安装切割模板、夹紧螺钉和铡刀，在底板上还加工有定位孔和缺角；所述的受体蜡模安装在托盘上，托盘上加工有定位销孔，受体蜡模为整个蜡块上预制有多个略大于蜡芯的空孔，空孔有序排列；所述的进给工作台包括横向步进电机、纵向步进电机、编码器、导轨和滚珠丝杆，步进电机连接驱动滚珠丝杆，滚珠丝杆再连接驱动导轨，导轨与托盘连接固定，或者导轨与切割模块的底板连接固定。

一种基于上述活版式组织芯片制备仪器的活版式组织芯片制备方法，其具体方法为：

1）受体蜡模的制备：

上模为阳模，下模为阴模，制造受体蜡模时，先通过热台或恒温孵箱将蜡模预热至56℃。将预热后上、下模合上，再从两边的浇蜡口同时快速注入融化后的蜡液,然后轻微振荡下模，使得蜡液能充分的注满下模，下模注满蜡水后，将上、下模具在室温下保持静止，待蜡充分冷却凝固后拔出上模，从而得到受体蜡模，再按预先设计的顺序，将受体蜡模的每一个空孔进行二位编码，并记录下来；

2）蜡芯的制备：

第一步，从包埋盒里取出供体蜡块放置于切割模板上，使得供体蜡块的两边与切割模板右边和前边相接触；第二步，将夹紧螺钉旋下，并在夹紧螺钉正下方各放一张方形塑料薄片，便于夹紧螺钉将供体蜡块夹紧；第三步，由于供体蜡块边缘部分不含样本组织，于是使用薄且锋利的铡刀将其边缘部分切除，相比直接使用线切割大大提高工作效率；第四步，铡刀切除边缘部分后，对含有样本组织的核心部分做好样品组织的标示，并记录下来，方便后续辨识；第五步；使用微型线切割机沿着切割模块上的缺角走丝，从而切下横截面与缺角部分大小尺寸一致的蜡芯；

3）向受体蜡模置入蜡芯：

    第一步，将制备好的受体蜡模放入托盘中，并将托盘与进给工作台装配连接，或者将切割模块与进给工作台装配连接；第二步，通过定位销钉将切割模板上的缺角与受体蜡模位于第一排、第一列的空孔对准，准确定位；由此类推，此后拔出其中一个销钉，移动另一个销钉，使得缺角与第一排或者第一列的另一空孔一一对齐；第三步，通过线切割方法切割供体蜡块制备的蜡芯，在切割完毕后，依靠自身重力垂直落下，或者操作植入事先与缺角对齐的受体蜡模的空孔内，每个特定的受体蜡块孔，只植入一个蜡芯；第四步，当与切割模板上缺角对齐的空孔植入蜡芯后，操作步进电机使得工作台横向或者纵向进给，进给距离与两相邻空孔中心之间长度相等，从而实现更换新的空孔与切割模板上缺角部分对齐；切换结束后，要立刻锁定进给操作手柄，重复上述操作使得受体蜡模每个空孔都植入蜡芯，植入的蜡芯都是事先标识过的样本组织，植入相应的空孔后将它们一一对应的关系建立数据库，以便后续查询；

4）切片：

第一步，受体蜡块与蜡芯初步融合：当受体蜡模里的所有空孔都植入了蜡芯后，将托盘放置于试验热台或孵箱中，56-60℃孵育融合，实时观察，待蜡块底部有蜡液溢出，及时转至室温固化；第二步，蜡液准备：将包埋机中石蜡预热融化，将蜡液温度调整至68-72℃； 第三步，植入蜡芯后蜡块的再次包埋：初步融合后，蜡块中可有空腔形成，且蜡块上半部分不整齐，不利于将含蜡芯的蜡块固定于切片机上完成切片。再次包埋时，可将病理包埋机内的预热蜡液沿着托盘壁注入植满蜡芯的受体蜡模里，避免直接倒在蜡模上。注入预热的蜡液时，轻微振荡托盘，使得蜡水完全注满受体蜡模，避免形成空腔；蜡液注入完毕后，将托盘保持静止置于室温条件下充分冷却至完全固化；第四步，制片：将含有蜡芯的受体蜡模取出。修整标记后，融合后蜡块固定于组织切片机上切片、制片，得到一个切片上含有的多种样本组织及具有的多种样本组织信息的芯片。

上述的微型线切割机为成熟的市场产品，市场有购。

 下面结合附图，对本发明作进一步详细说明：

如图所示，本发明由切割模块部分、微型线切割机、受体蜡模、进给工作台四部分连接组成；所述切割模块部分由底板、切割模板、铡刀、夹紧螺钉组成；切割模块的底板上预先打有定位孔，方便后续其缺角部分与供体蜡模的空孔对准定位，减少手工定位时间，提供工作效率；切割模板上预先做了一个缺角，缺角的大小跟需要制备供体蜡芯的大小一致；同时，该缺角部分是线切割走丝路线；处于缺角部分含有组织的的供体蜡块，切割前事先标识组织的里层和外层，在线切割完毕后，依靠自身重力含组织的蜡芯直接落入下方的受体蜡模里，下落过程不发生旋转，且蜡芯为方孔结构，植入后不会发生旋转移位，因而不会改变标识的方向，具有良好极向性；切割模块里的铡刀主要作用是切割供体蜡块的边缘不含组织的部分，相比直接使用线切割大大提供工作效率；微型线切割机切割是用于切割供体蜡块含有组织的那部分，从而得到供体蜡芯，并对其编号、记录，使用线切割切割组织大大减少切割对组织的损伤；微型线切割机沿着切割模具的缺角切割完毕，被切下的含有组织的供体蜡芯将依靠自身重力直接落入受体蜡模里,减少人工干预的误差；进给工作台将会使得受体蜡模能够横向和纵向移动，并在工作台上的托盘上事先打好定位孔，通过定位销使得切割模块和工作台连接起来，使得切割模具的缺角和蜡模的孔能快速准确对准；受体蜡模，是在整块蜡块上，预先打好比蜡芯略大的孔，使得蜡芯能够顺利的落入受体蜡模的孔内，蜡模的每个孔都按排列的位置编号，落入的蜡芯也事先编号，并对应建立数据库以便后续查询；受体蜡模里的空孔放满蜡芯后，对蜡块进行融合和再包埋，冷却后贮存起来以便后续切片使用；用融合固化后含蜡芯的受体蜡块制片时，沿着垂直于托盘的方向切片，这样得到的一个切片会含有多种组织，从而得到信息量大的切片，减少多次制片的时间，省时省力；沿不同角度切片，这样制得的芯片可以看到不同样本组织，不同角度横截面的微观结构。

Claims (2)

1.一种活版式组织芯片制备仪器，其特征在于：由切割模块、微型线切割机、受体蜡模、进给工作台四部分连接组成；所述的切割模块为底板上安装切割模板、夹紧螺钉和铡刀，在底板上还加工有定位孔和缺角；所述的受体蜡模安装在托盘上，托盘上加工有定位销孔，受体蜡模为整个蜡块上预制有多个略大于蜡芯的空孔，空孔有序排列；所述的进给工作台包括横向步进电机、纵向步进电机、编码器、导轨和滚珠丝杆，步进电机连接驱动滚珠丝杆，滚珠丝杆再连接驱动导轨，导轨与托盘连接固定，或者导轨与切割模块的底板连接固定。

2.一种基于权利要求1所述的活版式组织芯片制备仪器的活版式组织芯片制备方法，其特征在于：其具体方法为： 

1）受体蜡模的制备：

上模为阳模，下模为阴模，制造受体蜡模时，先通过热台或恒温孵箱将蜡模预热至56℃；

将预热后上、下模合上，再从两边的浇蜡口同时快速注入融化后的蜡液,然后轻微振荡下模，使得蜡液能充分的注满下模，下模注满蜡水后，将上、下模具在室温下保持静止，待蜡充分冷却凝固后拔出上模，从而得到受体蜡模，再按预先设计的顺序，将受体蜡模的每一个空孔进行二位编码，并记录下来；

2）蜡芯的制备：_---------

第一步，从包埋盒里取出供体蜡块放置于切割模板上，使得供体蜡块的两边与切割模板右边和前边相接触；

第二步，将夹紧螺钉旋下，并在夹紧螺钉正下方各放一张方形塑料薄片，便于夹紧螺钉将供体蜡块夹紧；

第三步，由于供体蜡块边缘部分不含样本组织，于是使用薄且锋利的铡刀将其边缘部分切除，相比直接使用线切割大大提高工作效率；

第四步，铡刀切除边缘部分后，对含有样本组织的核心部分做好样品组织的标示，并记录下来，方便后续辨识；

第五步；使用微型线切割机沿着切割模块上的缺角走丝，从而切下横截面与缺角部分大小尺寸一致的蜡芯；

3）向受体蜡模置入蜡芯：

第一步，将制备好的受体蜡模放入托盘中，并将托盘与进给工作台装配连接，或者将切割模块与进给工作台装配连接；

第二步，通过定位销钉将切割模板上的缺角与受体蜡模位于第一排、第一列的空孔对准，准确定位；由此类推，此后拔出其中一个销钉，移动另一个销钉，能使得缺角与第一排或者第一列的另一空孔一一对齐；

第三步，通过线切割方法切割供体蜡块制备的蜡芯，在切割完毕后，依靠自身重力垂直落下，或操作植入事先与缺角对齐的受体蜡模的空孔内，每个空孔，只植入一个蜡芯；

第四步，当与切割模板上缺角对齐的空孔植入蜡芯后，操作步进电机使得工作台横向或者纵向进给，进给距离与两相邻空孔中心之间长度相等，从而实现更换新的空孔与切割模板上缺角部分对齐；切换结束后，要立刻锁定进给操作手柄，重复上述操作使得受体蜡模每个空孔都植入蜡芯，植入的蜡芯都是事先标识过的样本组织，植入相应的空孔后将它们一一对应的关系建立数据库，以便后续查询；

4）切片：

第一步，受体蜡块与蜡芯初步融合：当受体蜡模里的所有空孔都植入了蜡芯后，将托盘放置于试验热台或孵箱中，56-60℃孵育融合，实时观察，待蜡块底部有蜡液溢出，及时转至室温固化；

第二步，蜡液准备：将包埋机中石蜡预热融化，将蜡液温度调整至68-72℃； 

第三步，植入蜡芯后蜡块的再次包埋：初步融合后，蜡块中可有空腔形成，且蜡块上半部分不整齐，不利于将含蜡芯的蜡块固定于切片机上完成切片；

再次包埋时，可将病理包埋机内的预热蜡液沿着托盘壁注入植满蜡芯的受体蜡模里，避免直接倒在蜡模上；

注入预热的蜡液时，轻微振荡托盘，使得蜡水完全注满受体蜡模，避免形成空腔；蜡液注入完毕后，将托盘保持静止置于室温条件下充分冷却至完全固化；

第四步，制片：将含有蜡芯的受体蜡模取出；

修整标记后，融合后蜡块固定于组织切片机上切片、制片，得到一个切片上含有的多种样本组织及具有的多种样本组织信息的芯片。

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