CN102042922B

CN102042922B - 一种制作一次成型组织芯片的方法及应用于该方法中的模具

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Publication number: CN102042922B
Application number: CN2010105287438A
Authority: CN
Inventors: 林爱芬; 包卫光; 颜卫华
Original assignee: TAIZHOU HOSPITAL OF ZHEJIANG PROVINCE
Current assignee: TAIZHOU HOSPITAL OF ZHEJIANG PROVINCE
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-11-02
Also published as: CN102042922A

Abstract

本发明提供了一种制作一次成型组织芯片的方法及应用于该方法中的模具，属于组织芯片制作技术领域。它解决了现有的组织芯片制作过程技术要求高等问题。本方法包括如下步骤：(1)、组装模具；(2)、取芯和填充；(3)、预热和注蜡；(4)、拆卸；(5)、切片与染色。通过该方法能够制作一次成型的组织芯片，并且能够简化制作流程，操作步骤简单，具有快速、经济和容易上手等优点。

Description

一种制作一次成型组织芯片的方法及应用于该方法中的模具

技术领域

本发明属于组织芯片制作技术领域，涉及一种制作一次成型组织芯片的方法及应用于该方法中的模具。

背景技术

组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray，TMA)，是将数十至上千个小组织整齐地排列在一张载玻片上而制成的组织切片。它是继基因芯片、蛋白质芯片之后出现的又一种重要的生物芯片，主要用于研究同一种基因或蛋白质分子在不同细胞或组织中表达的情况，具有高通量、大样本、省时快速等优点。自1998年Kononen等提出组织芯片的明确概念并证实其作用以来，组织芯片技术发展迅速。该技术已应用于人类基因组研究、医学诊断和基础研究，尤其是在肿瘤基因筛选、肿瘤抗原筛选及寻找与肿瘤发生、发展及预后相关的标记物等方面显示了巨大的潜能。

组织芯片具有以下优点：(1)组织芯片是一种高通量、大样本技术，一次实验操作可以完成传统实验方法的几十次甚至上千次的操作，显著提高病理组织学研究的效率，省时快速；(2)耗材少，所需费用是传统病理学方法的1/10～1/100；(3)含生物学信息量大，有助于进行大样本的回顾性研究。(3)组织芯片实验条件比较一致，有利于设计实验对照组；(4)可以减少传统实验方法中批内和批间误差；(6)组织芯片的图像数据可以采用自动化分析方法，便于数据采集、储存和检索；(7)一块组织芯片蜡块含有几十种甚至上千种组织标本的信息，便于存档蜡块的保存。组织芯片应用范围广，可用于医学基础研究及临床研究，还可用于分子诊断、治疗靶点定位、抗体或新药筛选以及基因或蛋白表达的原位分析等。组织芯片在肿瘤学研究中应用广泛。

组织芯片的应用前景非常广阔，但制作组织芯片却很是繁琐，需要制作空心蜡模，二次包埋等，还需要带有抽真空功能的组织芯片制作仪器等。而且制作过程技术要求高，制作空心蜡模时容易出现变形或开裂；二次包埋时容易出现组织芯融合不佳或熔蜡过度；组织面不平整；切片时组织移位，甚至脱片等问题。目前比较先进的组织芯片仪价格高达几十万人民币，即使是国产的也要几万人民币，而且都非常笨重。这些缺点都使得组织芯片的发展和应用受到了很大的限制，更使得组织芯片技术无法在基层医院或科研单位推广。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述问题，提出了一种制作一次成型组织芯片的方法及应用于该方法中的模具，通过该方法能够制作一次成型的组织芯片，并且能够简化制作流程，操作步骤简单，具有快速、经济和容易上手等优点；该模具使用方便，结构简单，成本低。

本发明通过下列技术方案来实现：一种制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)、组装模具：将预先设计的模具部件——阵列孔铜板、阵列针铜板和L形铜垫片组装起来，阵列孔铜板上的阵列通孔形成阵列模腔；

(2)、取芯和填充：用取样器在预先制作的石蜡包埋组织标记部位打孔取出组织芯，并按预先准备的组织芯片设计表一一对应填入阵列模腔中；

(3)、预热和注蜡：将模具中的承蜡槽放在阵列孔铜板上，使阵列模腔位于承蜡槽内，再将模具整体放入温箱预热，预热后取出模具，马上注入68～72℃的石蜡，注入的量不超过塑料包埋盒的承托面，在石蜡微凝时顶起组织芯，再放入塑料包埋盒，再注满68～72℃的石蜡；

(4)、拆卸：将石蜡快速冷却，在完全冷却后，在烤片台上加热底座和四周即可取下模具，至此，组织芯片蜡块即可制作完成；

(5)、切片与染色：将制成的组织芯片石蜡块置于零下20℃冰箱内16～24分钟，取出后切成4μm厚组织芯片。

在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在所述的步骤(3)中，模具放入温箱预热直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入68～72℃石蜡后，观察蜡柱周围开始凝固——泛白，就可取出两块L形铜垫片，将列阵孔铜板均匀下压，即将组织芯均匀顶起，待承蜡槽内石蜡凝固不再透明后就可放入塑料包埋盒。

上述的方案由于顶起组织芯操作需待石蜡稍稍凝固后实施，导致顶起部分的组织芯与蜡体间会留有一些细小的气泡，为此，作为第二种技术方案，在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在所述的步骤(3)中，准备1mm厚的L形铜垫片和0.2mm厚的L形铜垫片，在填充好组织芯后撤去的1mm厚的L形铜垫片，换以0.2mm的L形铜垫片，再将模具整体放入温箱预热，直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入68～72℃的石蜡，在注蜡后不等石蜡凝固，马上均匀用力按下阵列孔铜板，顶起组织芯，待承蜡槽内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。

作为第三种方案，在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在所述的步骤(3)中，准备1mm厚的L形铜垫片和0.2mm厚的L形铜垫片，在填充好组织芯后撤去的1mm厚的L形铜垫片，换以0.2mm的L形铜垫片，均匀用力将组织芯顶起，再将模具整体放入温箱预热，直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入68～72℃的石蜡，待承蜡槽内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。

为了消除第二种方案和第三种方案在制作时会导致包埋组织芯浪费，在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在完成所述步骤(3)中，换上0.2mm的L形铜垫片并完成注蜡后，立即顶起组织芯，待石蜡柱周围开始凝固而泛白时再将0.2mm厚L形铜垫片抽出，再均匀按下阵列孔铜板将最后组织芯顶起。

在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在所述的步骤(2)中，石蜡包埋组织定位是将所有石蜡包埋组织块切片，HE染色，经病理医生阅片定位，作好标记。

在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在所述的步骤(3)中，所述温箱的温度为65℃，预热时间为15～20分钟。

在上述制作一次成型组织芯片的方法中，在所述的步骤(4)中，石蜡的冷却通过放入4℃冰箱或置于空调口加快冷却。如冷却太慢，容易导致腊体本身产生气泡。

一种上述方法中制作一次成型组织芯片的模具，其特征在于，该模具包括阵列孔铜板、阵列针铜板和两个L形铜垫片，阵列孔铜板上设有矩形的阵列通孔，阵列针铜板的一侧设有与上述阵列通孔一一对应的阵列针，阵列针的横截面和高度与阵列通孔的截面和深度相同，阵列针插接在阵列通孔中，上述两个L形铜垫片拼成矩形，并垫在阵列孔铜板和阵列针铜板之间，上述的阵列针位于两个L形铜垫片内。

在上述制作一次成型组织芯片的模具中，所述的阵列孔铜板上还放置有承蜡槽，该承蜡槽为一个上下开口的铜质四方框体结构，上部为斗状的宽口，下部为筒状的窄口结构。

在上述制作一次成型组织芯片的模具中，所述的承蜡槽的上部设有台阶状的承接口。该承接口与病理科使用的塑料包埋框相对应，刚好能够承托。

在上述制作一次成型组织芯片的模具中，所述阵列孔铜板和阵列针铜板均为长方形，两者宽度相同，阵列针铜板的长度略长于阵列孔铜板的长度；所述L形铜垫片的长边比阵列针铜板的宽度略长。

在上述制作一次成型组织芯片的模具中，所述阵列针铜板大小50×30mm²，厚3mm，针间距为1mm，阵列针的直径为2mm；所述阵列孔铜板大小为45×30mm²，厚4mm，阵列通孔的孔径2mm，孔间距1mm；在上述制作一次成型组织芯片的模具中，所述L形铜垫片厚为1mm，边宽为3mm。

与现有技术相比，本发明能够简化原有的组织芯片制作流程，提高组织芯片制作速度和质量，降低切片时组织芯移位和掉片率。本方法只需一个取样器和四种铜质模具即可完成整个制作过程，而且操作步骤简单，具有简便、快速、经济、容易上手等优点。通过定位、取样、填充、预热、注蜡等步骤即可一次性完成组织芯片蜡块的制作，无需制作空心蜡模，无需二次包埋。制成的组织芯片蜡块具有组织面平整、一体性好、切片时不掉芯不位移等优点。

附图说明

图1是模具组装好后的结构示意图。

图2为承蜡模块的冠状面切面图。

图3为承蜡模块的矢状面切面图。

图4为阵列孔铜板的结构示意图。

图5为阵列针铜板的结构示意图。

图6为L形铜垫片的结构示意图。

图中，1、阵列孔铜板；2、阵列针铜板；3、L形铜垫片；4、阵列通孔；5、阵列针；6、承蜡槽；7、模腔。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1：

本发明中制作一次成型组织芯片的模具包括阵列孔铜板1、阵列针铜板2和两个L形铜垫片3，阵列孔铜板1上设有n×n矩形的阵列通孔4，阵列通孔4的大小和排列根据需要可灵活变动。阵列针铜板2的一侧设有与阵列通孔4一一对应的阵列针5，阵列针5排列与阵列通孔4完全相同，既阵列针5的横截面和高度与阵列通孔4的截面和深度相同，阵列孔铜板1和阵列针铜板2均为长方形，两者宽度相同，阵列针铜板2的长度略长于阵列孔铜板1的长度，可方便组装和拆卸。以6×7列阵为例提供参考数据：阵列孔铜板1的阵列通孔4数为6×7；孔径2mm、孔间距1mm；阵列孔铜板1大小为45×30mm²，厚4mm。阵列针铜板2的针数为6×7，针直径2mm、针间距1mm，阵列针铜板2大小50×30mm²，厚3mm。如图4和图5所示。

如图1所示，两个L形铜垫片3拼成矩形，并垫在阵列孔铜板1和阵列针铜板2之间，阵列针5位于两个L形铜垫片3内。由于L形铜垫片3的存在，阵列针5插接在阵列通孔4中，在阵列通孔4中形成了模腔7，如图6所示，L形铜垫片3厚为1mm，边宽为3mm。L形铜垫片3的长边比阵列针铜板2的宽度略长，长出部分可方便制作中拆卸L形铜垫片3。

如图2和图3所示，阵列孔铜板1上还放置有承蜡槽6，该承蜡槽6为一个上下开口的铜质四方框体结构，上部为斗状的宽口，下部为筒状的窄口结构。承蜡槽6的上部设有台阶状的承接口，该承接口与病理科使用的塑料包埋框相对应，刚好能够承托。下部的窄口根据阵列通孔的尺寸，略大之；考虑切片方便，总高应在15mm以内。以6×7列阵为例：上内口宽42×29mm²(包埋盒为40×28)，高3mm；倾斜部高4mm；下部内口宽26×24mm²，高6mm；四壁厚约2mm。

以6×7胃癌组织芯片的制作为例，其制作一次成型组织芯片的步骤如下：

芯片设计：每例胃癌设正常(N)、癌旁(P)、癌造(C)各一孔，6×7列阵可排14例，最后1孔留空，用于识别阵列方向，设计好后通过电脑制表并将设计表打印。

组织定位：将所有胃癌石蜡包埋组织块切片，HE染色，经病理医生阅片定位，作好标记。

模具的组装：将预先设计的模具——阵列孔铜板1、阵列针铜板2和L形铜垫片3组装起来，阵列孔铜板1上的阵列通孔4形成阵列模腔7；

取芯和填充：在标记部位用取样器打孔取出组织芯，并按组织芯片设计表一一对应填入阵列通孔4中。填充时稍加用力，尽量不在阵列针5与组织芯之间留有空隙。

预热和注蜡：将承蜡槽6放在阵列孔铜板1之上，再将模具整体放入65℃温箱预热15～20min，观察到蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入70℃的石蜡(不超过塑料包埋盒的承托面)。观察蜡柱周围开始凝固——泛白，然后取出2块L形铜垫片3，将列阵孔铜板均匀下压，即将组织芯均匀顶起。待承蜡槽6内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒，再注满70℃的石蜡。

拆卸：置于空调口或4℃冰箱内加快冷却，待石蜡完全冷却后，在70℃烤片台上加热底座和四周即可取下模具。至此，组织芯片蜡块即可制作完成。

切片与染色：将制成的组织芯片石蜡块置于零下20℃冰箱内约20min，取出后切成4μm厚组织芯片。然后，即可对切片进行常规HE染色或免疫组化染色。

实施例2：

实施例2的内容与实施例1基本相同，不同点在于，模具使用两种型号的L形铜垫片3，除了实施例1中的1mm厚的铜垫片，还有0.2mm厚的铜垫片。由于实施例1中，顶起组织芯操作需待石蜡稍稍凝固后实施，导致顶起部分的组织芯与蜡体间会留有一些细小的气泡，虽然气泡不影响组织芯的稳固，也不影响切片和染色，但影响了组织芯片蜡块的美观。因此，在步骤预热和注蜡上与实施例1不同，本实施例中，先准备1mm厚的L形铜垫片3和0.2mm厚的L形铜垫片3，在填充好组织芯后撤去的1mm厚的L形铜垫片3，换以0.2mm的L形铜垫片3，将模具中的承蜡槽6放在阵列孔铜板1上，使阵列模腔7位于承蜡槽6内，再将模具整体放入温箱预热，直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入70℃的石蜡，注入的量不超过塑料包埋盒的承托面，在注蜡后不等石蜡凝固，马上均匀用力，按下阵列孔铜板1，顶起组织芯，待承蜡槽6内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒，再注满70℃的石蜡。由于超薄L形铜垫片3的作用，使阵列针5不能完全顶出，阵列通孔4仍留有约0.2mm孔深，使得组织芯能够很好的保持位置，不移动不倾斜，石蜡的流动性也很好，减少了气泡存在的空间。

通过实施例2制作的组织芯片有0.2mm厚是露在蜡块平面外的，在切片时此突出部分必须先被切除。因此，如果要求蜡块即美观无气泡，又不浪费组织，在完成注蜡后，待石蜡柱周围开始凝固而泛白时再将超薄“L”形垫片抽出，在均匀按下阵列孔铜板1将最后的约0.2mm的组织顶起。由于顶起厚度很小，顶起部分与蜡体间留有的气泡也很少。这样即可以保证大部分组织芯与蜡体融合的很好，又可充分利用组织芯的厚度。

实施例3：

实施例3基本与实施例2相同，只是在预热和注蜡步骤上与实施例2不同，在填充好组织芯后撤去的1mm厚的L形铜垫片3，换以0.2mm的L形铜垫片3，均匀用力将组织芯顶起，将模具中的承蜡槽6放在阵列孔铜板1上，使阵列模腔7位于承蜡槽6内，再将模具整体放入温箱预热，直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入70℃的石蜡，注入的量不超过塑料包埋盒的承托面，待承蜡槽6内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒，再注满70℃的石蜡。

Claims

1.一种制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)、组装模具：将预先设计的模具部件——阵列孔铜板(1)、阵列针铜板(2)和L形铜垫片(3)组装起来，阵列孔铜板(1)上的阵列通孔(4)形成阵列模腔(7)；

(2)、取芯和填充：用取样器在预先制作的石蜡包埋组织标记部位打孔取出组织芯，并按预先准备的组织芯片设计表一一对应填入阵列模腔(7)中；

(3)、预热和注蜡：将模具中的承蜡槽(6)放在阵列孔铜板(1)上，使阵列模腔(7)位于承蜡槽(6)内，再将模具整体放入温箱预热，预热后取出模具，马上注入68～72℃的石蜡，注入的量不超过塑料包埋盒的承托面，在石蜡微凝时顶起组织芯，再放入塑料包埋盒，再注满68～72℃的石蜡；

(5)、切片与染色：将制成的组织芯片石蜡块置于零下20℃冰箱内16～24分钟，取出后切成4μm厚组织芯片，然后对切片进行常规HE染色或免疫组化染色。

2.根据权利要求1所述的制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，模具放入温箱预热直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入68～72℃石蜡后，观察蜡柱周围开始凝固——泛白，就可取出两块L形铜垫片(3)，将列阵孔铜板均匀下压，即将组织芯均匀顶起，待承蜡槽(6)内石蜡凝固不再透明后就可放入塑料包埋盒。

3.根据权利要求1所述的制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，准备1mm厚的L形铜垫片(3)和0.2mm厚的L形铜垫片(3)，在填充好组织芯后撤去的1mm厚的L形铜垫片(3)，换以0.2mm的L形铜垫片(3)，再将模具整体放入温箱预热，直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入68～72℃的石蜡，在注蜡后不等石蜡凝固，马上均匀用力按下阵列孔铜板(1)，顶起组织芯，待承蜡槽(6)内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。

4.根据权利要求1所述的制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，准备1mm厚的L形铜垫片(3)和0.2mm厚的L形铜垫片(3)，在填充好组织芯后撤去的1mm厚的L形铜垫片(3)，换以0.2mm的L形铜垫片(3)，均匀用力将组织芯顶起，再将模具整体放入温箱预热，直至蜡柱微微熔化——表面发亮即可；将模具自温箱取出，马上注入68～72℃的石蜡，待承蜡槽(6)内石蜡凝固不再透明后，放入塑料包埋盒。

5.根据权利要求3所述的制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，换上0.2mm的L形铜垫片并完成注蜡后，立即顶起组织芯，待蜡柱周围开始凝固而泛白时再将0.2mm厚L形铜垫片(3)抽出，再均匀按下阵列孔铜板(1)将最后组织芯顶起。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述温箱的温度为65℃，预热时间为15～20分钟。

7.根据权利要求6所述的制作一次成型组织芯片的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，石蜡的冷却通过放入4℃冰箱或置于空调口加快冷却。

8.一种在权利要求1所述方法中所使用的制作一次成型组织芯片的模具，其特征在于，该模具包括阵列孔铜板(1)、阵列针铜板(2)和两个L形铜垫片(3)，阵列孔铜板(1)上设有矩形的阵列通孔(4)，阵列针铜板(2)的一侧设有与上述阵列通孔(4)一一对应的阵列针(5)，阵列针(5)的横截面和高度与阵列通孔(4)的截面和深度相同，阵列针(5)插接在阵列通孔(4)中，上述两个L形铜垫片(3)拼成矩形，并垫在阵列孔铜板(1)和阵列针铜板(2)之间，上述的阵列针(5)位于两个L形铜垫片(3)内。

9.根据权利要求8所述的制作一次成型组织芯片的模具，其特征在于，所述的阵列孔铜板(1)上还放置有承蜡槽(6)，该承蜡槽(6)为一个上下开口的铜质四方框体结构，上部为斗状的宽口，下部为筒状的窄口结构，所述的承蜡槽(6)的上部设有台阶状的承接口。

10.根据权利要求9所述的制作一次成型组织芯片的模具，其特征在于，所述阵列孔铜板(1)和阵列针铜板(2)均为长方形，两者宽度相同，阵列针铜板(2)的长度略长于阵列孔铜板(1)的长度；所述L形铜垫片(3)的长边比阵列针铜板(2)的宽度略长。