CN102435725A - 一种简易石蜡组织芯片接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，包括：在病理组织蜡块上取样；将蜡加热直至融化状态，将蜡模制备框放在塑料蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框中聚合，冷却，撤下塑料蜡模板；将所得的蜡模连同蜡模制备框放置于孵箱中，使蜡模变软后取出，在蜡模的接种范围内钻孔，将芯片组织种入蜡模相应的孔中；将所得的蜡模的接种面放在平板烫台上，待蜡融化后，停止加热，自然冷却；再次将平板烫台升温，取下蜡模和蜡模制备框；将蜡模和蜡模制备框置入冰箱，取出后，将蜡模与蜡模制备框分离，将所得的蜡模切片后，即得石蜡组织芯片。本发明具有廉价、方便、简洁、快速、产量高、取材多样的优点，能普及至每一个病理科及相关研究单位。

Description

一种简易石蜡组织芯片接种方法

技术领域

 本发明提供了一种简易石蜡组织芯片接种方法，用于制备组织芯片，属于组织芯片技术领域。

背景技术

组织芯片技术是基因芯片技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片一样，属于一种特殊生物芯片技术。组织芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。组织芯片技术使科研人员能同时对几百甚至上千种组织样本同时进行分析，进行某一个或多个特定的基因，或与其相关的表达产物的研究。该技术不仅可以与传统的病理学技术、组织化学及免疫组化技术相结合，还可以与DNA、RNA、蛋白质、抗体等技术相结合，并且可在基因、基因转录和相关表达产物生物学功能三个水平上进行研究。这对人类基因组学的研究与发展，尤其对基因和蛋白质与疾病关系的研究，疾病相关基因的验证、新药物的开发与筛选、疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面具有重要的实际意义和广阔的市场前景。

目前，美国Clontech和Stratagene等少数生物技术公司已开展了人及动物的组织芯片产品开发和销售，但数量少、价格高、品种单一，满足不了医学科研和医药工业研发的需要。2001年4月，美国LifeSpan生物科学公司建立了正常和疾病组织基因表达数据库。美国Tissuelnformactics公司用动物组织芯片技术进行药物毒理筛选和寻找新药物作用位点。此外，日本、英国等国正积极筹建国家临床组织病理数据库。

中国在组织芯片技术方面的研究进展迅速。2001年10月，中国国家科技部将组织芯片技术列为“十五”国家科技攻关西部开发重大项目，并已在西安正式立项。该立项分成7个子项目，包括组织芯片技术、组织芯片生物信息数据库、自动化组织芯片仪、自动分析装置、组织芯片相关技术与试剂、组织芯片实际应用技术，为中国与世界相关技术同步发展奠定了基础。

目前，组织芯片的制备主要依靠机械化芯片制备仪来完成。制备仪包括操作平台、特殊的打孔采样装置和一个定位系统。打孔采样装置对供体组织蜡块进行采样，同时也可对受体蜡块进行打孔，其孔径与采样直径相同，两者均可精确定位。制备仪的定位装置可使穿刺针或受体蜡块线性移动，从而制备出孔径、孔距、孔深完全相同的组织微阵列蜡块。通过切片辅助系统将其转移并固定到硅化和胶化玻片上即成为组织芯片。根据样本直径(0．2～2．0 mm)不同，在一张45 mm×25 mm的玻片上可以排列40～2000个以上的组织标本。一般按照样本数目的多少，将组织芯片分为低密度芯片(< 200点)、中密度芯片(200～600点)和高密度芯片(>600点)。常用组织芯片含有组织标本的数目在50～800个之间。根据研究目的不同，芯片种类可以分成肿瘤组织芯片、正常组织芯片、单一或复合、特定病理类型等数10种组织芯片。

但目前依据上述方法制备组织芯片有以下不足：第一，现有组织芯片制作成本很高。除特殊的仪器设备外（数十万元），制作1个组织芯片的费用在万元以上，每张切片单价在50～100元；第二，仅能在已有的蜡块上取样，组织来源受到限制；第三，根据现有设备和方法制备的芯片，切片量仅约50张，因为是在原有蜡块上点孔取样，组织厚度有限；第四，高密度芯片虽然通量大，但由于每枚组织微小，难以提供组织结构的信息；第五，仅在大型研究单位，才有经费和条件进行组织芯片的相关研究，难以推广。

发明内容

本发明的目的是发明一种简单、快速的组织芯片接种方法，制备低密度和中密度组织芯片，兼顾样本通量、组织结构和芯片产量等多方面的要求，使组织芯片技术的作用得到充分发挥。

为了达到上述目的，本发明提供了一种简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，包括：

第一步：在病理组织蜡块上取样，作为将要接种的芯片组织留存；

第二步：将蜡加热直至融化状态，将蜡模制备框放在塑料蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框中聚合，待蜡聚合后，冷却，撤下塑料蜡模板；

第三步：将所得的蜡模连同蜡模制备框放置于50～70℃孵箱中5～8min，使蜡模变软后取出，在蜡模的接种范围内钻孔，将第一步所得的芯片组织种入蜡模相应的孔中；

第四步：将第三步中所得的蜡模的接种面放在平板烫台上，升温至58～65℃，待蜡模内蜡模与芯片组织之间的接触面至距离接触面1～5mm高度的蜡融化后，停止加热，自然冷却；再次将平板烫台升温至22～24℃，取下蜡模和蜡模制备框；

第五步：将蜡模和蜡模制备框置入冰箱，取出后，侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，将所得的蜡模切片后，即得石蜡组织芯片。

优选地，所述的芯片组织为长为5mm～10mm、宽为1mm～2mm、厚为1mm～2mm的长方形块状、长条形块状、方形块状、长管状或长柱状（特殊结构如血管或神经为长管状或长柱状）。

优选地，所述的蜡模制备框为长36～50mm、宽28mm、高17mm、厚度2～10mm的塑料、玻璃或钢化玻璃的透明框。

优选地，所述的塑料蜡模板具有长2～5mm、宽2～5mm的方形刻度区，所述的方形刻度区内具有深度为2～3mm的刻度，塑料蜡模板的材料为耐热塑料。

优选地，所述的第二步中的冷却温度为-20℃，时间为5min。

优选地，所述的第三步中的钻孔深度为0.8～1cm。

本发明利用石蜡易溶解、易聚合的特性，使需要的组织在一定温度下接种在石蜡上，按照一定的顺序排列，石蜡将组织疏松地黏附在一起，最后用石蜡将组织完全聚合，切片后便得到所需要的组织芯片。

本发明具有廉价、方便、简洁、快速、产量高、取材多样的优点，能普及至每一个病理科及相关研究单位。

具体实施方式

    下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1：简易石蜡组织芯片接种方法

（1）芯片组织的获取：

病理取材时留取所需的组织，随同病理科常规组织处理程序，至浸蜡的步骤，留存。在已有的蜡块上标记所需要的组织，用石蜡组织芯片取样刀取样，作为将要接种的芯片组织留存。所述的芯片组织为8mm、宽为1.5mm、厚为1.5mm的长方形块状，组织大小和形状可根据研究需要自行确定，要求包埋面平整。

（2）蜡模的制备：

准备蜡模制备框和塑料蜡模板，蜡模制备框为塑料透明框（框长40mm，宽28mm，高17mm，框的厚度5mm），塑料蜡模板板面有方形刻度区，刻度深2.5mm，刻度区大小3 mm x3mm，材料为耐热塑料。

将蜡放入蜡壶，用电炉加热直至融化状态，将蜡模制备框放在塑料蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框聚合约6h，待蜡聚合后，放入-20℃冰箱5min，取出，撤下塑料蜡模板，蜡模板上的刻度显示在蜡模上，此面即为组织芯片接种面。

（3）将制备好蜡模连同蜡模制备框置于60℃孵箱中5min，使蜡模变软后取出（注意时间不宜太久，以免蜡模熔化，导致蜡模面不平整等）；

在蜡模四个角中的任何一角，用钢针钻孔，种入标记起始点的芯片组织；然后依次在接种范围区钻孔，深度约0.8cm，将已准备好的组织芯片种入蜡模相应的孔中，此时蜡模有很大的韧性，孔的大小可根据即将接种的芯片大小而决定。通常钻一个孔，接种一个芯片组织，以免顺序混乱，接种后立即记录相应芯片在蜡模中的位置；接种过程中，蜡模逐渐变硬，可再置入60℃孵箱中5min，待蜡模变软后继续接种；蜡模若还有剩余位置，可留待以后继续接种组织芯片。

（4）将蜡模接种面放在平板烫台上，逐渐升温至58℃，待蜡模内蜡模与芯片组织的接触面至距离接种面约2mm高度的蜡融化后，切断电源，自然冷却至室温完成聚合过程，放置5h，再次接通电源，使平板烫台升温至23℃，切断电源，期间可用镊子柄分离溢出来的石蜡，取下接种有组织芯片的蜡模制备框。

（5）将种植有组织芯片的蜡模制备框置入-20℃冰箱，5min后取出，轻轻侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，蜡模即可脱出，取下，包埋n个组织芯片的蜡块即制备完成，用常规切片机切片，捞片时请注意起始点顺序。

实施例2：简易石蜡组织芯片接种方法

（1）芯片组织的获取：

病理取材时留取所需的组织，随同病理科常规组织处理程序，至浸蜡的步骤，留存。在已有的蜡块上标记所需要的组织，用石蜡组织芯片取样刀取样，作为将要接种的芯片组织留存。所述的芯片组织为直径2mm，长1cm的圆柱状，组织大小和形状可根据研究需要自行确定，要求包埋面平整。

（2）蜡模的制备：

准备蜡模制备框和塑料蜡模板，蜡模制备框为塑料透明框（框长40mm，宽28mm，高17mm，框的厚度5mm），塑料蜡模板板面有方形刻度区，刻度深2.5mm，刻度区大小3 mm x3mm，材料为耐热塑料。

将蜡放入蜡壶，用电炉加热直至融化状态，将蜡模制备框放在塑料蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框聚合约6h，待蜡聚合后，放入-20℃冰箱5min，取出，撤下塑料蜡模板，蜡模板上的刻度显示在蜡模上，此面即为组织芯片接种面。

（3）将制备好蜡模连同蜡模制备框置于50℃孵箱中8min，使蜡模变软后取出（注意时间不宜太久，以免蜡模熔化，导致蜡模面不平整等）；在蜡模四个角中的任何一角，用钢针钻孔，种入标记起始点的芯片组织；然后依次在接种范围区钻孔，深度约0.8cm，将已准备好的组织芯片种入蜡模相应的孔中，此时蜡模有很大的韧性，孔的大小可根据即将接种的芯片大小而决定。通常钻一个孔，接种一个芯片组织，以免顺序混乱，接种后立即记录相应芯片在蜡模中的位置；接种过程中，蜡模逐渐变硬，可再置入50℃孵箱中8min，待蜡模变软后继续接种；蜡模若还有剩余位置，可留待以后继续接种组织芯片。

（4）将蜡模接种面放在平板烫台上，逐渐升温至65℃，，待蜡模内蜡模与芯片组织的接触面至距离接种面约3mm高度的蜡融化后，切断电源，自然冷却至室温完成聚合过程，放置5h，再次接通电源，使平板烫台升温至23℃，切断电源，期间可用镊子柄分离溢出来的石蜡，取下接种有组织芯片的蜡模制备框。

（5）将种植有组织芯片的蜡模制备框置入-20℃冰箱，5min后取出，轻轻侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，蜡模即可脱出，取下，包埋n个组织芯片的蜡块即制备完成，用常规切片机切片，捞片时请注意起始点顺序。

Claims (5)

1.一种简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，包括：

第一步：在病理组织蜡块上取样，作为将要接种的芯片组织留存；

第二步：将蜡加热直至融化状态，将蜡模制备框放在塑料蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框中聚合，待蜡聚合后，冷却，撤下塑料蜡模板；

第三步：将所得的蜡模连同蜡模制备框放置于50～70℃孵箱中5～8min，使蜡模变软后取出，在蜡模的接种范围内钻孔，将第一步所得的芯片组织种入蜡模相应的孔中；

第四步：将第三步中所得的蜡模的接种面放在平板烫台上，升温至58～65℃，待蜡模内蜡模与芯片组织之间的接触面至距离接触面1～5mm高度的蜡融化后，停止加热，自然冷却；再次将平板烫台升温至22～24℃，取下蜡模和蜡模制备框；

第五步：将蜡模和蜡模制备框置入冰箱，取出后，侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，将所得的蜡模切片后，即得石蜡组织芯片。

2.如权利要求1所述的简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，所述的芯片组织为长为5mm～10mm、宽为1mm～2mm、厚为1mm～2mm的长方形块状、长条形块状、方形块状、长管状或长柱状。

3.如权利要求1所述的简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，所述的蜡模制备框为长36～50mm、宽28mm、高17mm、厚度2～10mm的塑料、玻璃或钢化玻璃的透明框。

4.如权利要求1所述的简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，所述的第二步中的冷却温度为-20℃，时间为5min。

5.如权利要求1所述的简易石蜡组织芯片接种方法，其特征在于，所述的塑料蜡模板具有长2～5mm、宽2～5mm的方形刻度区，所述的方形刻度区内具有深度为2～3mm的刻度，塑料蜡模板的材料为耐热塑料。