CN103091151B - 一种石蜡细胞芯片接种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石蜡细胞芯片接种方法，其特征在于，具体步骤为：将细胞用福尔马林固定过的肠衣包裹，处理至浸蜡的步骤，得到浸好蜡的细胞标本，加热至融化状态，打开肠衣，将细胞及液态石蜡刮入EP管，混匀后，塑形成所需形状的细胞芯片；将蜡模制备框放在蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框中聚合，取出，撤下蜡模板；将所得的蜡模连同蜡模制备框放置于孵箱中，使蜡模略变软后取出，在蜡模的接种范围内钻孔，将细胞芯片种入蜡模相应的孔中；蜡模放在恒温孵育箱内聚合；将蜡模和蜡模制备框置入冰箱，取出后，侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，将所得的蜡模切片后，即得石蜡细胞芯片。本发明具有廉价、方便、快速、产量高、塑形多样的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种石蜡细胞芯片接种方法，用于制备石蜡细胞芯片。
背景技术
细胞芯片技术是基因细胞芯片技术的发展和延伸，与组织细胞芯片、蛋白细胞芯片、抗体细胞芯片一样，属于一种特殊生物细胞芯片技术。细胞芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床细胞标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。细胞芯片技术使科研人员能同时对几百甚至上千种组织样本同时进行分析，进行某一个或多个特定的基因，或与其相关的表达产物的研究。该技术不仅可以与传统的病理学技术、组织化学及免疫组化技术相结合，还可以与DNA、RNA、蛋白质、抗体等技术相结合，并且可在基因、基因转录和相关表达产物生物学功能三个水平上进行研究。这对人类基因组学的研究与发展，尤其对基因和蛋白质与疾病关系的研究，疾病相关基因的验证、新药物的开发与筛选、疾病的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面具有重要的实际意义和广阔的市场前景。
目前，细胞芯片的制备还缺乏有效的方法，暂借助于传统的组织细胞芯片制备的方法，主要依靠机械化细胞芯片制备仪来完成。制备仪包括操作平台、特殊的打孔采样装置和一个定位系统。打孔采样装置对供体细胞蜡块进行采样，同时也可对受体蜡块进行打孔，其孔径与采样直径相同，两者均可精确定位。制备仪的定位装置可使穿刺针或受体蜡块线性移动，从而制备出孔径、孔距、孔深完全相同的组织微阵列蜡块。通过切片辅助系统将其转移并固定到硅化和胶化玻片上即成为细胞芯片。根据样本直径(0.2～2.0mm)不同，在一张45mm×25mm的玻片上可以排列40～2000个以上的组织标本。一般按照样本数目的多少，将细胞芯片分为低密度细胞芯片(＜200点)、中密度细胞芯片(200～600点)和高密度细胞芯片(＞600点)。
但目前依据上述方法制备细胞芯片有以下不足：第一，现有细胞芯片制作成本很高。除特殊的仪器设备外(数十万元)，制作1个细胞芯片的费用在万元以上，每张切片单价在50～100元；第二，仅能在已有的石蜡细胞块上取样，组织来源受到限制；第三，根据现有设备和方法制备的细胞芯片，切片量仅约50张，因为是在原有蜡块上点孔取样，细胞标本厚度有限；第四，高密度细胞芯片虽然通量大，但由于每枚组织微小，难以提供足够的信息；第五，聚合过程中，细胞容易弥散，导致不同病例间相互污染；第六，仅在大型研究单位，才有经费和条件进行细胞芯片的相关研究，难以推广。
发明内容
本发明的目的是开发一种简易细胞芯片接种方法，制备低密度和中密度细胞芯片，兼顾样本通量、组织结构和细胞芯片产量等多方面的要求，尤其可有效避免不同病例间的弥散导致的相互污染，使细胞芯片技术的作用得到充分发挥。
为了达到上述目的，本发明提供了一种石蜡细胞芯片接种方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：将细胞用福尔马林固定过的肠衣包裹，随同病理科常规组织处理程序进行处理，至浸蜡的步骤，得到浸好蜡的细胞标本；
第二步：将浸好蜡的细胞标本连同肠衣加热至融化状态，打开肠衣，将细胞及液态石蜡刮入EP管，混匀后，塑形成所需形状的细胞芯片，留存；
第三步：将蜡加热直至融化状态，将蜡模制备框放在蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框中聚合，待蜡聚合后，放入-10℃～-20℃冰箱2～10min，取出，撤下蜡模板；
第四步：将所得的蜡模连同蜡模制备框放置于50～70℃孵箱中5～8min，使蜡模略变软后取出，在蜡模的接种范围内钻孔，将第二步所得的细胞芯片种入蜡模相应的孔中；
第五步：将第四步中所得的蜡模放在恒温孵育箱内聚合，升温至54～56℃，1～3h后停止加热，自然冷却；
第六步：将蜡模和蜡模制备框置入-10℃～-20℃冰箱10～20min，取出后，侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，将所得的蜡模切片后，即得石蜡细胞芯片。
优选地，所述第二步中的细胞柱的形状为长方体形、正方体形、管状或圆柱状。
优选地，所述第三步中的蜡模制备框为耐高温材料制作，长为30mm～40mm，宽为15mm～30mm，高为10mm～15mm，壁厚为2mm～4mm。
优选地，所述第三步中的蜡模板为耐高温材料制作，长为60mm～70mm，宽为30mm～40mm，厚为5mm～10mm，其中央设有一个由四条凹槽围成的长方形区域，所述的凹槽的宽为2mm～4mm，深为1mm，凹槽可与蜡模框嵌合，长方形区域的长为30mm～40mm，宽为15mm～30mm，长方形区域内设有4～10条横向凹槽及6～15条纵向凹槽，横向凹槽和纵向凹槽将长方形区域分隔成24～150凸出的网格，网格长1mm～3mm，宽1mm～3mm，其中横向第一排网格表面刻有镜像数字或镜像字母状凹陷，纵向第一排第二个网格起刻有镜像字母或镜像数字状凹陷，其余网格表面有一直径为1mm的圆形凸起。
本发明的接种方法中，细胞由肠衣包裹后浸蜡，可以保证细胞量在操作过程中不流失，聚合时不需要完全融化石蜡，即可使细胞芯片与周围蜡完美聚合，防止细胞芯片融化后细胞弥散。本发明利用石蜡易溶解、易聚合的特性，使需要的细胞在一定温度下接种在石蜡上，按照一定的顺序排列，石蜡将组织疏松地黏附在一起，最后用石蜡将细胞完全聚合，切片后便得到所需要的细胞芯片。
本发明具有廉价、方便、简洁、快速、产量高、塑形多样的优点，能普及至每一个病理科及相关研究单位。
附图说明
图1为蜡模制备框和蜡模板示意图；
图2为蜡模制作过程示意图；
图3为蜡模示意图；
图4为钢针钻孔示意图；
图5为细胞芯片接种示意图；
图6为接种细胞芯片的蜡模示意图；
图7为包埋细胞芯片的蜡块示意图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种石蜡细胞芯片接种方法，具体步骤为：
(1)细胞芯片的获取：
将细胞用福尔马林固定过的肠衣包裹，随同病理科常规组织处理程序进行处理，至浸蜡的步骤，得到浸好蜡的细胞标本，留存。将浸好蜡的细胞标本连同肠衣加热至融化状态，打开肠衣，将细胞及液态石蜡刮入EP管，混匀后，塑形成圆柱状细胞芯片，留存。所述的细胞芯片组织大小和形状可根据研究需要自行确定，要求包埋面平整。
(2)蜡模的制备：
如图1所示，准备蜡模制备框1和蜡模板2，蜡模制备框1为耐高温材料制作，长为36mm，宽为29mm，高为10mm，壁厚为0.2mm，蜡模板2为耐高温塑料制作，长为70mm，宽为40mm，厚为10mm，其中央设有一个由四条凹槽围成的长方形区域，所述的凹槽的宽为3mm，深为1mm，凹槽可与蜡模框嵌合，长方形区域的长为36mm，宽为29mm，长方形区域内设有9条横向凹槽及12条纵向凹槽，横向凹槽和纵向凹槽将长方形区域分隔成108个凸出的网格，网格长3mm，宽3mm，其中横向第一排网格表面刻有镜像数字状凹陷，纵向第一排第二个网格起刻有镜像字母状凹陷，其余网格表面有一直径为1mm的圆形凸起。
将蜡放入蜡壶，用电炉加热直至融化状态，将蜡模制备框1放在蜡模板2上，如图2所示，将蜡3倒入蜡模制备框1内聚合，待蜡3聚合后，放入-20℃冰箱5min，取出，撤下蜡模板2，蜡模板2上的刻度显示在如图3所示的蜡模4上，此面即为细胞芯片接种面。
将制备好蜡模4连同蜡模制备框1置于60℃孵箱中5min，使蜡模4略变软后取出(注意时间不宜太久，以免蜡模熔化，导致蜡模面不平整等)；
(3)在蜡模接种面的选定点，如图4所示，用钢针5钻孔，种入标记起始点的细胞芯片6；然后依次在接种范围区钻孔，深度根据细胞芯片6的长度调整，如图5所示，将已准备好的细胞芯片6种入蜡模4相应的孔中，此时蜡模4有很大的韧性，孔的大小可根据即将接种的细胞芯片6的大小而决定。通常钻一个孔，接种一个细胞芯片6，以免顺序混乱，接种后立即记录相应细胞芯片6在蜡模4中的位置；接种过程中，蜡模4逐渐变硬，可再置入60℃孵箱中5min，待蜡模4变软后继续接种，直至完成接种，得到如图6所示的接种细胞芯片的蜡模7；蜡模若还有剩余位置，可留待以后继续接种细胞芯片。
(4)将接种细胞芯片的蜡模7放在恒温孵育箱内进行聚合，升温至56℃，2h后停止加热，自然冷却；连同蜡模制备框1一同取下。
(5)将接种细胞芯片的蜡模7置入-20℃冰箱10min后取出，轻轻侧敲蜡模制备框1，将接种细胞芯片的蜡模7与蜡模制备框1分离，接种细胞芯片的蜡模7即可脱出，取下，包埋细胞芯片的蜡块8即制备完成，如图7所示，用常规切片机切片，捞片时请注意起始点顺序。
Claims (3)
1. 一种石蜡细胞芯片接种方法,其特征在于,具体步骤为：
第一步：将细胞用福尔马林固定过的肠衣包裹，随同病理科常规组织处理程序进行处理，至浸蜡的步骤，得到浸好蜡的细胞标本；
第二步：将浸好蜡的细胞标本连同肠衣加热至融化状态，打开肠衣，将细胞及液态石蜡刮入EP管，混匀后，塑形成所需形状的细胞芯片，留存；
第三步：将蜡加热直至融化状态，将蜡模制备框放在蜡模板上，将蜡倒入蜡模制备框中聚合，待蜡聚合后，放入-10℃～-20℃冰箱2～10min，取出，撤下蜡模板；
第四步：将所得的蜡模连同蜡模制备框放置于50～70℃孵箱中5～8min，使蜡模略变软后取出，在蜡模的接种范围内钻孔，将第二步所得的细胞芯片种入蜡模相应的孔中；
第五步：将第四步中所得的蜡模放在恒温孵育箱内聚合，升温至54～56℃，1～3h后停止加热，自然冷却；
第六步：将蜡模和蜡模制备框置入-10℃～-20℃冰箱10～20min，取出后，侧敲蜡模制备框，将蜡模与蜡模制备框分离，将所得的蜡模切片后，即得石蜡细胞芯片。
2.如权利要求1所述的石蜡细胞芯片接种方法,其特征在于,所述第三步中的蜡模制备框为耐高温材料制作，长为30mm～40mm，宽为15mm～30mm，高为10mm～15mm，壁厚为2mm～4mm。
3.如权利要求1所述的石蜡细胞芯片接种方法,其特征在于,所述第三步中的蜡模板为耐高温材料制作，长为60mm～70mm,宽为30mm～40mm,厚为5mm～10mm，其中央设有一个由四条凹槽围成的长方形区域，所述的凹槽的宽为2mm～4 mm,深为1mm,凹槽可与蜡模制备框嵌合,长方形区域的长为30mm～40 mm,宽为15mm～30mm,长方形区域内设有4～10条横向凹槽及6～15 条纵向凹槽, 横向凹槽和纵向凹槽将长方形区域分隔成24～150凸出的网格，网格长1mm～3 mm,宽1mm～3 mm,其中横向第一排网格表面刻有镜像数字或镜像字母状凹陷,纵向第一排第二个网格起刻有镜像字母或镜像数字状凹陷,其余网格表面有一直径为1mm的圆形凸起。
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| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
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Inventor after: Hou Yingyong Inventor after: Shi Yuan Inventor after: Hu Qin Inventor after: Li Xiaojing Inventor after: He Deming Inventor after: Jiang Dongxian Inventor after: Sujieakesu Inventor after: Zeng Haiying Inventor after: Tan Yunshan Inventor before: Hou Yingyong Inventor before: Shi Yuan Inventor before: Hu Qin Inventor before: He Deming Inventor before: Jiang Dongxian Inventor before: Sujieakesu Inventor before: Zeng Haiying Inventor before: Tan Yunshan |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: HOU YINGYONG SHI YUAN HU QIN HE DEMING JIANG DONGXIAN SUJIEAKESU CENG HAIYING TAN YUNSHAN TO: HOU YINGYONG SHI YUAN HU QIN LI XIAOJING HE DEMING JIANG DONGXIAN SUJIEAKESU CENG HAIYING TAN YUNSHAN |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20130508 Assignee: Xiamen Tongling biological medicine technology Co., Ltd. Assignor: Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University Contract record no.: X2019980000224 Denomination of invention: Wax cell chip inoculation method Granted publication date: 20141029 License type: Exclusive License Record date: 20191008 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141029 Termination date: 20200104 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |