CN117168946A - 一种组织芯片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组织芯片的制作方法，该方法包括如下步骤：(1)在基板上按照预设阵列打孔，获得芯片板；(2)将芯片板置于包埋底模底部，将直径与芯片板内径相同的蜡芯插入在芯片板的孔中；(3)在包埋底模中注满石蜡液，待石蜡凝固后去除芯片板，得到去除芯片板的石蜡包埋组织阵列，再将去除芯片板的石蜡包埋组织阵列上芯片板对应位置修平。本发明提供了一种制备组织芯片的方法，可以降低制作组织芯片的费用，扩大了组织芯片的使用范围。而且整体操作流程简便，无需精确控制温度，能有效解决手工制作组织芯片步骤繁琐，对实验人员要求较高的问题。制作出的组织芯片切片后，经HE和免疫组化验证，染色过程中无脱片，所有位点完好无损。

Description

一种组织芯片的制作方法

技术领域

本发明涉及一种组织芯片的制作方法，属于组织芯片技术领域。

背景技术

组织芯片又称组织微阵列(Tissue microarray)，是生物芯片重要的组成部分。组织芯片指将几十，或可达上百个不同个体组织标本按实验需求事先设计好的布局或顺序排列于同一载体上，进行同一指标的原位组织学研究，减少实验误差的同时，大量降低了试剂和时间成本。同时具有体积小、通量高、储存方便等优点。

目前较为便利的方法为运用全自动组织芯片仪制作组织芯片，然而价格高昂，对于非大型医院或非大规模实验室来说都具有较大的经济负担，从而无法推广。手工的制作方法种类较多，根据是否需要受体蜡块可分为需要受体蜡块和浇注式两类。需要受体蜡块是目前常用的制作石蜡包埋组织阵列的方法，但是步骤繁琐且温度难以控制，受体蜡块的预制孔常与组织柱大小不一致，切片时会散片、掉片、开裂，而且大多需要仪器辅助操作；受体蜡块打孔取出的空白蜡芯长度和供体蜡块打孔取出的目的蜡芯长度不容易保持一致，切片时因各个蜡芯长度参差不齐，较难获得具有全部芯片点的完整切片，从而造成材料浪费。而浇注式制作石蜡包埋组织阵列的方法对操作者的操作水平要求较高，浇注过程中芯片阵列不易固定，易出现倾倒、错位，混乱等现象。这些问题影响了组织芯片技术在病理诊断和研究中应用。

申请公布号为CN116148012A的中国发明专利文件公开了“一种简易低耗的组织芯片制作方法”，具体制作步骤如下：步骤一、工具准备，线上或线下购买牛羊用放气穿刺针以及锉刀，利用锉刀将穿刺针的尖头部打磨平，即可获得组织芯片制作的简易工具；步骤二、受体蜡块的制作，用两块玻璃和合适的模具制作成方形受体蜡块；步骤三、供体蜡块的取样，对日常收集的制作组织芯片专用蜡块进行常规石蜡切片HE染色，由病理医生对HE切片进行阅片评估，初步排除坏死组织多、细胞稀疏、钙化等不合格的供体蜡块，显微镜下选取待穿刺的病灶位置，标记笔圈出病灶范围，以HE染色切片作为参照，圈出供体蜡块对应的病灶区；步骤四、供体蜡块的移植和包埋，供体蜡块放置37℃恒温箱20min，加热软化组织，用穿刺针的针筒垂直穿刺供体蜡块的病灶区，将穿刺的组织柱按照组织芯片的设计顺序注入对应的受体蜡块孔的内部，平整面朝上，此操作均在病理切片包装盒内进行，完成供体蜡块和受体蜡块之间的组织柱移植后，应用合适的包埋模具倒扣于受体蜡块上面，迅速翻转受体组织芯片蜡块，避免移植的组织柱脱落混乱，然后用小镊子将各个孔内的组织柱轻轻按压至底面进行包埋操作；步骤五、组织芯片蜡块的切片，重包埋完成的组织芯片蜡块眼观组织柱排列整齐，无偏位现象，组织柱与受体蜡块之间融合好，无空洞和缝隙，各组织柱的底面平整，进行切片操作，切面上观察每个组织点是否已经完全出现，将切片贴在载玻片透明区域的正中间，进行常规烤片；步骤六、HE染色验证。该方法所用的组织芯片制作工具简单，操作简单，成本低廉，但是需要制备供体蜡块，而且受体蜡块与组织柱上下部分别溶解相融合的过程需有经验的操作人员精准控制温度，而且整体流程相对繁琐。

因此，开发出一种操作步骤简单可行，对实验人员要求较低的组织芯片制作方法是扩大组织芯片应用范围的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织芯片的制作方法，以解决现有技术中手工制备组织芯片的过程繁琐、制备过程中条件难以控制、对实验人员要求较高、制备的组织芯片质量难以控制的问题。

为了实现上述目的，本发明中一种组织芯片的制作方法的技术方案是：

一种组织芯片的制作方法，包括如下步骤：

(1)在基板上按照预设阵列打孔，获得芯片板；

(2)将芯片板置于包埋底模底部，将直径与芯片板内径相同的蜡芯插入在芯片板的孔中；

(3)在包埋底模中注满石蜡液，待石蜡凝固后去除芯片板，得到去除芯片板的石蜡包埋组织阵列，再将去除芯片板的石蜡包埋组织阵列上芯片板对应位置修平。

上述方案的有益效果在于：本发明选择硬度和厚度适宜的基板打孔后制备成芯片板，将芯片板使用石蜡液固定在包埋底模的底部，然后将与芯片板孔径相符的、修整合适的蜡芯插入到芯片板中，由于芯片板具有一定的厚度，所以蜡芯能卡在芯片板的孔内。后续石蜡液倒入包埋底模中时，由于石蜡芯卡在芯片板的孔内，不容易被石蜡液的流动力所带倾倒，有效地避免了石蜡芯倾倒、错位、混乱等现象。石蜡液凝固后，将芯片板去除，在包埋底模中补加适量的石蜡液，填充之前芯片板占据的空间，冷却成型切片即可获得组织芯片。本发明组织芯片的制作方法第一不需要受体蜡块，简化了制作石蜡包埋组织阵列繁琐的操作步骤，也避免了过程中温度难以控制的难点；第二首次使用自制芯片板先将石蜡芯固定，能有效解决后续石蜡液倾注过程中，石蜡芯倾倒、错位，混乱等问题；第三在倾注的石蜡液凝固后将芯片板去除，最终的石蜡包埋组织阵列中不存在其他成分，如：固定石蜡芯的胶等，减少引入的外部成分，在一定程度上减少影响最终结果的外来因素。

具体地，选用硬度和厚度适宜的塑料薄片用作制备芯片板的材料，所述材料要有一定的厚度，可使蜡芯卡在孔内，在后面的操作过程中不易倾倒；在后期芯片板需要去除，这就要求芯片板易于弯曲，方便去除可重复使用。考虑到材料的成本、易获得程度和实用性，可选择实验室常见的载玻片方盒为制作芯片板的材料。

作为进一步地改进，所述基板的厚度不大于1mm；所述蜡芯的长度为0.5～1cm。

作为进一步地改进，步骤(2)中包括使用石蜡液将芯片板固定在包埋底模底部。

上述方案的有益效果在于：使用石蜡液将芯片板固定在包埋底模底部，能更好的使石蜡芯定位，能有效防止后续石蜡液倾注时，由于芯片板移动导致最终获得的组织芯片位置发生改变。而且以石蜡液固定不会引入外来物质，且方便后续多次融化、凝固的操作。

优选地，石蜡液以能铺满包埋底模底部，将芯片板固定且石蜡液不能充满芯片板的孔为宜。

作为进一步地改进，步骤(2)中待石蜡芯插入完成后，将包埋底模在酒精灯上烘烤至包埋底模底部的蜡融化后再室温凝固。

为了使石蜡芯更牢固地固定，上述操作可根据实际情况重复多次，如两次、三次。

上述方案的有益效果在于：将石蜡芯插入芯片板的孔后，将包埋底模在酒精灯上烘烤加热后，底模上存在凝固的石蜡和插入芯片板孔洞中的石蜡芯融化，再降温凝固后，能使石蜡芯更加牢固地固定在芯片板的孔中。

作为进一步地改进，步骤(3)中修平是使用石蜡将芯片板对应位置填平。

作为进一步地改进，步骤(3)中待石蜡凝固后，取出带有芯片板的石蜡包埋组织阵列，撬起芯片板一角，将芯片板去除，在包埋底模中注入石蜡液，将去除芯片板的石蜡包埋组织阵列放入包埋底模中，待冷却成型后即获得完整的组织芯片。

上述方案的有益效果在于：采用石蜡液将芯片板位置填平有助于减少蜡芯的浪费。

附图说明

图1为本发明实施例1中芯片板示意图；

图2为本发明实施例1中蜡芯布局图；

图3为本发明实施例1中带芯片板的石蜡包埋组织阵列图；

图4为本发明实施例1中去除芯片板的石蜡包埋组织阵列图；

图5为本发明实施例1中石蜡包埋组织阵列的成品；

图6为本发明实施例1中组织芯片；

图7为本发明实验例1中组织芯片的HE染色图；

图8为本发明实验例1中组织芯片的免疫组化染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

实施例1一种组织芯片的制作方法

本实施例的组织芯片的制作方法，具体实施操作如下：

1、芯片板的制备

选用硬度和厚度适宜的塑料薄片(载玻片方盒)用作制备芯片板的材料，裁成适合包埋底模底部的大小(37mm×24mm×9mm)，使用组织取样器在塑料薄片上按照预设阵列打孔即获得芯片板，如图1所示。

2、在包埋底模底部滴加适量(以能铺满包埋底模底部，将芯片板固定且石蜡液不能充满芯片板的孔为宜)融化的石蜡，在凝固前放入芯片板，使其平整的固定在底部如图1所示。

3、蜡芯的制备

对日常收集的制作组织芯片专用蜡块在石蜡切片机上修整，直至获得较为完整的供体蜡块切片，进行HE染色，初步排除坏死组织多、细胞稀疏、钙化等不合格的供体蜡块，选取蜡芯位置。用与步骤1相同孔径的组织取样器在供体蜡块上打孔，获得蜡芯。

4、石蜡包埋组织阵列的制备

利用镊子将蜡芯上表面朝下(蜡芯上表面由于经过切片机修整过，比较平整)，依次插入步骤2中的芯片板中，如图2所示。将包埋底模在酒精灯上烘烤至包埋底模底部的蜡融化后在室温凝固，重复此操作多次，即可更好的将蜡芯固定。然后将融化的蜡液沿包埋底模边缘倒入。待蜡液凝固后，将包埋底模放入冰箱中使冷却。然后敲击包埋底模，使组织整列与包埋底模分离，如图3所示。

这时组织阵列表面还有芯片板。用刀片去除芯片板四周的蜡，然后用刀片撬起芯片板一角，轻轻将芯片板去除，去除芯片板的组织阵列如图4所示。

重新在包埋底模中注入适量的蜡液，然后快速将去除芯片板的组织阵列放入包埋底模中。待冷却后再次放入冰箱中，使组织整列与包埋底模分离，如图5所示。由图中可以看出，石蜡包埋组织阵列位点排列整齐，无移位、混乱、变形、开裂及气泡。

5、切片

将制作好的石蜡包埋组织阵列放入切片机，经过简单的修整即可获得较完整的组织芯片，如图6所示，每次切片至少可获得包含15张石蜡切片的蜡带。

实验例1组织芯片的制作方法在组织芯片染色中的应用

本实验例的组织芯片的制作方法在组织芯片染色中的应用，具体实施步骤如下：

利用实施例1中步骤5切片获得的组织芯片切片进行HE染色和免疫组化染色，染色步骤如下：

(1)HE染色

脱蜡及水化→苏木素-伊红染色→封片→观察。

(2)免疫组化染色

脱蜡及修复→封闭→一抗试剂→一抗后试剂→加酶标聚合物→DAB显色及复染→封片及观察。

HE染色结果如图7所示，由图中可知，组织芯片的切片中无刀痕和脱片现象，位点组织形态及细胞结构均清晰可辨。

组织芯片切片鼠抗人CK8/18和β-Catenin免疫组化染色结果如图8所示，免疫组化染色过程中无脱片，所有位点完好无损；而且由图8可知染色结果与常规石蜡切片免疫组化染色结果相同。

以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种组织芯片的制作方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)在基板上按照预设阵列打孔，获得芯片板；

(2)将芯片板置于包埋底模底部，将直径与芯片板内径相同的蜡芯插入在芯片板的孔中；

(3)在包埋底模中注满石蜡液，待石蜡凝固后去除芯片板，得到去除芯片板的石蜡包埋组织阵列，再将去除芯片板的石蜡包埋组织阵列上芯片板对应位置修平。

2.根据权利要求1所述的组织芯片的制作方法，其特征在于：所述基板的厚度不大于1mm；所述蜡芯的长度为0.5～1cm。

3.根据权利要求1所述的组织芯片的制作方法，其特征在于：步骤(2)中包括使用石蜡液将芯片板固定在包埋底模底部。

4.根据权利要求3所述的组织芯片的制作方法，其特征在于：步骤(2)中待石蜡芯插入完成后，将包埋底模在酒精灯上烘烤至包埋底模底部的蜡融化后再室温凝固。

5.根据权利要求1所述的组织芯片的制作方法，其特征在于：步骤(3)中修平是使用石蜡将芯片板对应位置填平。

6.根据权利要求5所述的组织芯片的制作方法，其特征在于：步骤(3)中待石蜡凝固后，取出带有芯片板的石蜡包埋组织阵列，将芯片板去除，在包埋底模中注入石蜡液，将去除芯片板的石蜡包埋组织阵列放入包埋底模中，待冷却成型后即获得完整的组织芯片。