CN103436599B - Nptⅱ标记筛选基因的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，其中，LAMP检测引物组包括下列引物：外引物F3：CTCGACGTTGACTCTGATG；外引物B3：TGATGCTCATCGTCCAGT；内引物FIP：TAGCCGGTTCATGCGTAT GCTCATCTCACCTTGCACCT；内引物BIP：CCTATCGTCCACCTTGCGACTTC CAGTTCGACTTGACC；环引物FLP：TTGCATCTGCCATGTAGGTTA；环引物BLP：CGTTCACGGTTGGATGCC。本发明提供的LAMP检测引物组对NPTII标记筛选基因具有良好的特异性。
Description
【技术领域】
本发明属于食品安全领域，涉及环介导等温扩增技术，具体涉及含有NPTII标记筛选基因的转基因作物的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
转基因作物是指利用重组DNA技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代，也称为遗传修饰生物体(Genetically modified organisms，GMOs)。自1983年首例转基因植物问世以来，全球转基因作物的种植面积和销售收入均以倍数增长。但从严肃的科学意义上说，转基因农产品的生物安全性目前尚无确定的结论。虽然我国规定自2002年3月20日起，所有转基因农作物及其副产品都应加以标志，但是在转基因农作物不断增多的形势下，仍然很少见到加注转基因字样的农产品。因此开发简便的转基因大豆检测技术并对相关产品进行检测势在必行。
目前普遍应用基于DNA的检测技术对转基因作物进行检测。该类技术主要包括传统定性PCR和定量PCR。这些检测技术都需要特殊的DNA扩增仪(PCR仪)才能够完成。而环介导的等温基因扩增技术(Loop-Media tedLsothcrmal AmpliFication，LAMP)侬赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件保温几十分钟，完成核酸扩增反应；可以在1小时之内，将靶基因DNA片段扩增109-1010倍，并且只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定是否扩增，不需要电泳检测过程。
查阅转基因大豆品系MON89788相关文献，了解NPTII标记筛选基因序列信息，部分序列信息具体为：
ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTG GAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGAT GCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAA GACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGG CTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTT GTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGC AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGG CTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCG ACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCC GGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCC AGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATC TCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATG GCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCT ATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCG AATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGC AGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA。
【发明内容】
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组，其对NPTII标记筛选基因具有良好的特异性。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种NPTII标记筛选基因的LAMP检测试剂盒，其便于对NPTII标记筛选基因进行LAMP检测。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种NPTII标记筛选基因的LAMP检测方法，其具有灵敏较高、特异性良好、检测快速可靠、操作简单的特点。
上述第一个技术问题通过以下技术方案实现：
一种NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组，其特征在于，包括下列引物：
外引物F3：CTCGACGTTGACTCTGATG；
外引物B3：TGATGCTCATCGTCCAGT；
内引物FIP：
TAGCCGGTTCATGCGTATGCTCATCTCACCTTGCACCT；
内引物BIP：
CCTATCGTCCACCTTGCGACTTCCAGTTCGACTTGACC；
环引物FLP：TTGCATCTGCCATGTAGGTTA；
环引物BLP：CGTTCACGGTTGGATGCC。
通过实验证明，本发明提供的LAMP检测引物组对的DNA均无非特异扩增。因此，本发明提供的LAMP检测引物组对NPTII标记筛选基因具有良好的特异性。
上述第二个技术问题通过以下技术方案实现：
NPTII标记筛选基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
；其中，引物液中的各引物对应为所述NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组中的各引物。
还包括显色剂；所述显色剂为荧光染料SYBR Green I。
还包括对照物：阳性对照为纯度为10％、浓度为100ng/ul的含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液，阴性对照为ddH2O。
本发明提供的LAMP检测试剂盒集合了上述LAMP检测引物及LAMP检测的相关用料，便于使用者对NPTII标记筛选基因进行LAMP检测。
上述第三个技术问题通过以下技术方案实现：
NPTII标记筛选基因的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(101)对待检样品提取待检模板DNA；
(102)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系具体为：
，将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63℃恒温反应60min，然后在80℃下保温5min；其中，引物液中的各引物对应为所述BAR基因的LAMP检测引物组中的各引物。
通过实验证明，本发明提供的LAMP检测方法结合上述引物的良好特异性及LAMP方法的优点，具有以下特点：灵敏度较高、快速可靠、稳定性良好、操作简单、鉴定简单。
【附图说明】
图1为实施例一中进行LAMP反应的结果示意图；
图2为实施例二中进行灵敏度实验的结果示意图；
图3-图6为实施例三中进行特异性实验的结果示意图；
图7-图9为实施例四进行稳定性实验的结果示意图。
【具体实施方式】
实施例一
本实施例一提供的NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组，其包括下列引物：
外引物F3：CTCGACGTTGACTCTGATG；
外引物B3：TGATGCTCATCGTCCAGT；
内引物FIP：
TAGCCGGTTCATGCGTATGCTCATCTCACCTTGCACCT；
内引物BIP：
CCTATCGTCCACCTTGCGACTTCCAGTTCGACTTGACC；
环引物FLP：TTGCATCTGCCATGTAGGTTA；
环引物BLP：CGTTCACGGTTGGATGCC。。
本实施例一提供的NPTII标记筛选基因的试剂盒，其包括以下成分：
；其中，引物液中的各引物对应为所述BAR基因的LAMP检测引物组中的各引物。
本实施例一提供的对待检样品进行检测的方法，具体包括以下步骤：
(101)对待检样品提取待检模板DNA；
(102)进行环介导等温基因扩增反应：
配置总体积为25μL的LAMP反应体系，具体为：
；其中，引物液中的各引物对应为所述BAR基因的LAMP检测引物组中的各引物；将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63℃恒温反应60min，然后在80℃下保温5min；
(103)结果判断，可以通过以下两种方式中一种进行：
第一种方式：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，若出现沉淀为阳性，若没出现沉淀为阴性；
第二种方式是：在上述反应管中分别加入1-2μL显色剂(通常用量为2μL)，混匀，若呈绿色为阳性，呈橙色则为阴性。
选择上述引物进行LAMP检测，具有出峰时间早、信号强的特点，如图1所示，以含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液代替待检模板DNA，另外进行上述步骤(102)两次；以ddH2O作为阴性对照，具体是以ddH2O代替待检模板DNA，另外进行上述步骤(102)两次；上述四次LAMP反应结果见图1，在图1中，CH1线、CH2线对应ddH2O，CH3线、CH4线对应含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液。
在本文中，含有NPT II标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液的参数为：纯度为5％，DNA浓度为100ng/ul。
在本文中，DNA浓度及纯度的测定为：
取5μLDNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；DNA的浓度按照以下公式计算获得：
C＝A×N×50/1000；
式中，C——DNA浓度(μg/μL)，A——260nm处的吸光值，N——核酸稀释倍数，1OD260nm＝50μg/mL双链DNA；当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于LAMP检测。
实施例二
在本实例中，主要对实施例一提供的检测方法进行灵敏度实验，具体是：
将含有NPTII标记筛选基因的转基因玉米MON863的DNA溶液(纯度为10％)用非转基因水稻的DNA溶液分别稀释成五个不同纯度的混合溶液，在五个混合溶液中，转基因玉米MON863的DNA的纯度分别为5％、1％、0.5％、0.1％、 0.05％；每个混合溶液分别取2μL，均取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)；以ddH2O作为阴性对照，以含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液作为阳性对照，分别取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)。
在本文中，含有NPTII标记筛选基因的转基因玉米MON863的DNA溶液的参数为：纯度为10％，浓度为100ng/μl。
含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液的参数为：纯度为10％，浓度为100ng/μl。
实验结果见图2所示，在图2中，CH21线-CH28线分别对应于含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液、ddH2O、含有NPTII标记筛选基因的转基因玉米MON863的DNA溶液(纯度为10％)、纯度为5％的混合溶液、纯度为1％的混合溶液、纯度为0.5％的混合溶液、纯度为0.1％的混合溶液、纯度为0.05％的混合溶液。
由图2可知，实施例一的检测方法的检测限可达在纯度为0.5％的转基因玉米MON863的DNA溶液(含有NPTII标记筛选基因)检测出NPTII标记筛选基因；最低检出限时约23min出峰，假阳性未出现，可以将反应时间确定为45min。因此，本方法具有较高的灵敏度。
实施例三
在本实例中，主要对实施例一提供的引物进行特异性实验，具体是：
用绿豆、蚕豆、猪、燕麦、桔子、羊、鸭、土豆、蜜梨、草虾、鹰嘴豆、鸡、鹅、水稻、白云豆、四季豆、豇豆、荞麦、番茄、大杏仁、核桃、驴的DNA分别取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)；以ddH2O作为阴性对照，以含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液作为阳性对照，分别取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)。
部分实验结果见图3所示，在图3中，CH31线-CH38线分别对应于含有 NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液、ddH2O、绿豆、蚕豆、猪、燕麦、桔子、羊。
部分实验结果见图4所示，在图4中，CH41线-CH48线分别对应于鸭、土豆、蜜梨、草虾、鹰嘴豆、鸡、鹅、水稻。
部分实验结果见图5所示，在图5中，CH51线-CH58分别对应于白云豆、四季豆、豇豆、荞麦、番茄、大杏仁、核桃、驴。
部分实验结果见图6所示，在图6中，CH61线-CH68分别对应于：含有NPTII标记筛选基因的MON863、DP356043、GA21、MON89788、BT11、含有NPTII标记筛选基因的EH92-527-1、MON88017、MON810。
由图3至图6所显示的结果可见，上述引物仅对NPTII标记筛选基因具有特异性，对其他不含NPTII标记筛选基因的转基因品系和非转基因物种均无扩增，因此，上述引物的特异性良好，因此，在此前提下，本发明提供的检测方法非常可靠。
实施例四
在本实例中，主要对实施例一提供的检测方法进行稳定性实验，具体包括：
将含有NPTII标记筛选基因的转基因玉米MON863的DNA溶液(纯度为10％)用非转基因玉米DNA稀释到纯度为5％，分别取20份量为2μL上述稀释后的DNA溶液，均取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述步骤(102)；以ddH2O作为阴性对照，含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液作为阳性对照，分别取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤(102)。
结果见图7-图9，图7的CH73-CH78曲线、图8中的8根曲线及图9中的6根曲线是对应上述20份稀释后的DNA溶液，图7中CH71线、CH72线分别对应含有NPTII标记筛选基因的玉米粉的DNA溶液、ddH2O；从图上来看，20根曲线的出现位置都很接近，因此，可见本检测方法的稳定性好。
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。
序列表
<110>
<120>NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
<130>唐食明；钱振杰；冯家望
<160>6
<170>PatentIn version3.5
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CTCGACGTTGACTCTGATG 19
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
TGATGCTCATCGTCCAGT 18
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
TAGCCGGTTCATGCGTATGCTCATCTCACCTTGCACCT 38
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CCTATCGTCCACCTTGCGACTTCCAGTTCGACTTGACC 38
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
TTGCATCTGCCATGTAGGTTA 21
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
CGTTCACGGTTGGATGCC 18
Claims (6)
1.NPTII标记筛选基因的LAMP检测引物组，其特征在于，包括下列引物：
外引物F3：CTCGACGTTGACTCTGATG；
外引物B3：TGATGCTCATCGTCCAGT；
内引物FIP：
TAGCCGGTTCATGCGTATGCTCATCTCACCTTGCACCT；
内引物BIP：
CCTATCGTCCACCTTGCGACTTCCAGTTCGACTTGACC；
环引物FLP：TTGCATCTGCCATGTAGGTTA；
环引物BLP：CGTTCACGGTTGGATGCC。
2.NPTII标记筛选基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
；其中，
外引物F3：CTCGACGTTGACTCTGATG；
外引物B3：TGATGCTCATCGTCCAGT；
内引物FIP：
TAGCCGGTTCATGCGTATGCTCATCTCACCTTGCACCT：
内引物BIP：
CCTATCGTCCACCTTGCGACTTCCAGTTCGACTTGACC；
环引物FLP：TTGCATCTGCCATGTAGGTTA；
环引物BLP：CGTTCACGGTTGGATGCC。
3.根据权利要求2所述的NPTII标记筛选基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于，还包括显色剂。
4.根据权利要求3所述的NPTII标记筛选基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂为荧光染料SYBR Green I。
5.根据权利要求2所述的NPTII标记筛选基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于，还包括对照物：阳性对照为纯度为10％、浓度为100ng/ul的含有NPTII标记筛选基因的转基因玉米MON863的DNA溶液，阴性对照为ddH2O。
6.NPTII标记筛选基因的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(101)对待检样品提取待检模板DNA；
(102)进行环介导等温基因扩增反应：
配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系具体为：
，将LAMP反应体系置于LAMP浊度仪中进行63℃恒温反应60min，然后在80℃下保温5min；其中，
外引物F3：CTCGACGTTGACTCTGATG；
外引物B3：TGATGCTCATCGTCCAGT；
内引物FIP：
TAGCCGGTTCATGCGTATGCTCATCTCACCTTGCACCT；
内引物BIP：
CCTATCGTCCACCTTGCGACTTCCAGTTCGACTTGACC；
环引物FLP：TTGCATCTGCCATGTAGGTTA；
环引物BLP：CGTTCACGGTTGGATGCC。
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| CN102559897A (zh) * | 2012-01-13 | 2012-07-11 | 广州华峰生物科技有限公司 | 一种nptⅱ基因检测用引物组、相应的试剂盒及其使用方法 |
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2013
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| 环介导等温扩增核酸技术及其应用;匡燕云等;《微生物学通报》;20071231;第34卷(第3期);557-560 * |
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