CN103436582B - 一种魔芋多肽提取物、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种从魔芋飞粉中提取魔芋多肽提取物的方法，及其由此方法获得的魔芋多肽提取物和该魔芋多肽提取物的用途。为了提高魔芋多肽提取物中魔芋多肽的含量，本发明优化提取工艺，采用复合酶酶解魔芋飞粉蛋白提取液，最终获得的魔芋多肽提取物中魔芋多肽的含量高达85～97%，并且魔芋多肽的分子量在350～3500Da，另外本发明还提供了魔芋多肽提取物在制备治疗糖尿病及糖尿病并发症的用途，以及含有魔芋多肽提取物的降糖药物组合物，总之，本发明的魔芋多肽提取物及其药物组合物具有很好的医药前景。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种从魔芋飞粉中提取魔芋多肽提取物的方法，及其由此方法获得的魔芋多肽提取物和该魔芋多肽提取物的用途。
背景技术
糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一组由环境和遗传因素共同作用引起的综合征，其基本病理特点为胰岛素分泌绝对或相对不足，或外周组织对胰岛素不敏感，引起以糖代谢紊乱为主，包括脂肪、蛋白质代谢紊乱的一种全身性疾病。糖尿病控制与并发症的临床试验（DCCT）、英国前瞻性糖尿病研究（UKPDS）等多项循证医学研究已使人们对强化血糖控制的意义达成共识，血糖达标不仅可以预防或延缓糖尿病慢性并发症的发生，提高患者的生活质量，而且会大大降低糖尿病相关的医疗费用。然而现实中糖尿病患者的血糖达标率较低。注射胰岛素是治疗糖尿病的方法之一，但是临床治疗中发现，胰岛素注射本身也存在如下问题：（1）只能降低注射期间的血糖，不能完全按血糖变化曲线控制血糖；（2）容易产生低血糖；（3）胰岛素的吸收稳定性差，吸收差异达52%；（4）不能有效控制并发症。口服降糖药治疗糖尿病是一种长期的治疗和维持过程，但是单纯依靠口服降糖已经无法达到强化治疗的目标，主要由于长期口服降糖药物产生的耐药性和副反应造成的。因此，寻求更为有效的降糖药物是迫切的。
糖化血红蛋白是血液葡萄糖等己糖分子通过非酶作用，经细胞膜与红细胞内血红蛋白β链缬氨酸结合形成的产物，其中糖化血红蛋白（HbA1c）约占70％，其高低与血糖浓度和持续时间成正比，广泛用于糖尿病控制程度的判断和估计血管合并症的危险。近年来，由于HbAlc检测方法的改进及标准化的推行，高压液相层析法由于其稳定性好而在临床检测中逐渐得到应用，美同临床化学协会糖化血红蛋白标准化分会和IFCCHbA1c标准化工作组建议糖化血红蛋白其作为检测糖化血红蛋白的“金标准”。
魔芋飞粉是在魔芋精粉加工过程中产生的重量轻、颗粒小的粉末，占魔芋精粉的30%～40%，年产量约为1500～2000吨，多以低价饲料或作为干燥剂出售，利用价值低。目前研究发现，魔芋飞粉含粗蛋白质22.98％，粗纤维3.23％，是一个含高蛋白、低纤维重要资源，也是生产活性多肽的良好原料。
目前，采用魔芋飞粉提取魔芋多肽的方法有酸水解法、碱水解法以及简单的一步酶解方法。但在碱水解过程中，多数氨基酸受到不同程度的破坏，并且产生消旋现象，所以在生产中基本不采用此法。酸水解一般是用盐酸在沸腾的条件下水解，然后冷却水解物。其优点是水解效率高，不引起氨基酸的消旋作用，得到的是L-氨基酸，但是部分氨基酸会完全被破坏，且由于盐酸腐蚀性强，要求水解设备必须有很强的抗腐蚀性能，所以酸水解法在生产中的应用受到了很大的限制。酶水解所需的条件则较温和，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，且水解时间短，产物颜色浅，容易控制水解的程度。但目前采用酶解制备魔芋蛋白多肽过程中较多采用单一酶系，且存在选用的水解酶不合理，造成魔芋蛋白水解不彻底，生产周期严重延长的现象。
徐怀德等在《酶解魔芋飞粉蛋白制备ACE抑制肽》（食品科学，2010年第31卷第1期第157～160页）一文公开了一种从魔芋飞粉提取制备魔芋多肽粉及其作为ACE抑制剂的技术方案，酶解过程为一步酶解过程，且选用碱性蛋白酶，大部分多肽的分子量在2500道尔顿以下，均为20个以下氨基酸组成的多肽链。经过检测，该制备获得的魔芋多肽粉中多肽的含量较低，仅达到52.67%。
赵姗姗等在《酶解魔芋飞粉制备高F值多肽最佳工艺条件的研究》（生物技术，2006年，第16卷第3期第67～69页）一文中公开了一种从酶解魔芋飞粉制备高F值寡肽的方法，该方法中以魔芋飞粉为原料，采用Tris-HCl浸提法提取蛋白质，然后经过第一步酶解和第二步酶解，将芳香族氨基酸水解下来，最后用凝胶层析进行分离，即得到高F值寡肽制品，且第一步酶解用酶为碱性蛋白酶，第二次酶解用酶为链酶蛋白酶。由此可见，该工艺最后是采用凝胶层析进行分离获得高F值寡肽制品。
刘红等在《魔芋葡甘聚糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠高血糖的防治作用》（中国药理学通报，2002年，第18卷第1期第54～56页）一文公开了魔芋葡甘聚糖具有治疗糖尿病的活性。目前没有魔芋飞粉可以治疗糖尿病的报道，也没有关于魔芋多肽提取物具有治疗糖尿病功能的相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于为了提高魔芋多肽提取物中魔芋活性多肽的含量，对从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物的方法进行优化，为此，本发明提供了一种从魔芋飞粉中提取魔芋多肽提取物的方法，它包含如下步骤：
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节含有魔芋飞粉的水溶液的pH值至8.5～9.5，浸提时间为20～100min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.0～8.0、温度至50℃～60℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为2.5～4.5小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶至少选自碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的两种，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50～200。
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至7.0～9.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为2.0～4.0小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶至少选自碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的一种，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:100～400。
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为40℃～50℃，pH为7.0～9.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋多肽提取中的魔芋多肽的含量在85%～97%之间，魔芋多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
为了进一步提高魔芋多肽提取中的魔芋多肽的含量，本发明还对上述制备方法各个步骤工艺进行了优化。
首先，考虑到含有魔芋飞粉的水溶液中魔芋飞粉的浓度和溶液的pH对于魔芋飞粉蛋白的提取率具有重要影响，因此，本发明分别对含有魔芋飞粉的水溶液的pH、浸提时间和魔芋飞粉与纯水的质量比进行了优选。优选地，上述步骤（1）中用NaOH溶液调节含魔芋飞粉的水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，魔芋飞粉与纯水的质量比为1:50。上述提取条件可以改变蛋白质分子表面的带电情况，增加蛋白质的水溶性，同时可以防止蛋白质的脱氨、脱羧等有害物质的产生。经过检测，从魔芋飞粉中提取的魔芋飞粉蛋白收率为90%。
其次，考虑到酶法水解常用的酶有很多种，不同蛋白酶作用于蛋白质肽链上的位点不同，造成了水解程度和多肽的组成不同。因此，本发明分别对第一次酶解反应、第二次酶解反应的水解酶的种类、用量和酶解条件进行了优化。
对于第一次酶解反应而言，具体优化如下：作为本发明的一个优选实施例，优选地，上述步骤（2）中的pH为7.5、温度至55℃，酶解时间为3小时。
作为本发明的一个优选实施例，优选地，上述第一酶解蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，进一步优选地，第一酶解反应中，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100，更进一步优选地，其中碱性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50，其中中性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50。
对于第二次酶解反应而言，具体优化如下：作为本发明的一个优选实施例，优选地，上述步骤（3）中的pH为8.0、酶解时间为3小时。
作为本发明的一个优选实施例，优选地，上述第二酶解蛋白酶为胰蛋白酶。
最后，考虑到魔芋蛋白水解物中可能含有未被消化的蛋白质，纤维素，无机盐及色素等杂质，本发明采用膜分离技术进行除杂、浓缩。根据计算我们选择350Da和3500Da的滤膜将魔芋多肽提取物中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，分子量大于3500Da的魔芋多肽成分将再次经过第一次酶解反应、第二次酶解反应和超滤纯化，最终获得分子量为350Da～3500Da的魔芋多肽。因此，发明对超滤纯化工艺进行了优化，魔芋水解多肽超滤纯化的最佳工艺条件为：pH值为8.0，温度为45℃，压力为0.08MPa。
由于超滤的过程不需要添加化学萃取成份，不但可以分离出各种杂质，还可以对样品进行浓缩，保证高质量魔芋多肽的产生。在魔芋多肽提取物中，魔芋蛋白水解多肽的最终含量为97%。
综合上述优选条件，本发明提供了一种最优的从魔芋飞粉制备魔芋多肽提取物的方法，其包括如下步骤：
它包含如下步骤：
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100，其中碱性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50，中性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50。
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为胰蛋白酶，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在97%，活性多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
本发明的第二个目的是提供一种按照上述方法从魔芋飞粉获得的魔芋多肽提取物，在魔芋多肽提取物中含有魔芋多肽97%，总酸1.2%，全糖（以葡萄糖计）1.1%，铵盐0.7%，并且魔芋多肽的分子量在350～3500道尔顿之间。
本发明的第三个目的在于提供从魔芋多肽提取物在制备治疗糖尿病及其糖尿病并发症的药物中的用途。
糖化血红蛋白对糖尿病患者来说是一项非常重要的监测指标，它的高低直接决定将来各种严重影响糖尿病患者生活质量的慢性并发症的发生和发展。糖尿病患者定期监测糖化血红蛋白具有非常重要的意义，有助于帮助患者改善血糖控制水平，促进患者的血糖达标，并减少并发症的发病率，从根本上改善糖尿病患者的生活质量。本研究采用魔芋多肽提取物喂养糖尿病大鼠，并与模型组、吡格列酮组、魔芋葡甘聚糖组、魔芋飞粉组相比，结果发现，本发明的魔芋多肽提取物在降低糖化血红蛋白水平方面具有显著的优势，并预示着本发明提供的魔芋多肽提取物对于糖尿病和糖尿病并发症具有很好的治疗作用。所述的糖尿病并发症包括，糖尿病并发症动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变、非酒精性脂肪肝和糖尿病肾病等。
血清高敏C反应蛋白（CRP）是炎症标志物，在发热性疾病、各种炎症状态和创伤时，血清CRP水平会明显增高。长期以来，临床常以健康群体CRP的95%参考值上限判断患者有无明显的感染性炎症。但是，高灵敏度CRP（Hs-CRP）检测方法的开发和应用研究结果表明，原先认为是正常的血清CRP水平的高低却同未来的心血管病的发生密切相关。大量研究资料表明，动脉粥样化的血栓形成除了是脂肪堆积过程外，也是一个慢性炎症过程，而CRP是动脉粥样化的血栓形成疾病的介导和标志物。CRP对心绞痛、急性冠状动脉综合症和行经皮血管成形术患者，具有预测心肌缺血复发危险和死亡危险的作用。本发明通过试验研究表明了本发明的魔芋多肽提取物可以显著降低了糖尿病患者血清CRP，这预示着将显著减弱糖尿病患者与炎症相关的并发症反应。这进一步说明，本发明的魔芋多肽提取物可以用于治疗和/或预防诸如糖尿病并发症动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变、非酒精性脂肪肝和糖尿病肾病。
本发明尤其关注了魔芋多肽提取物对糖尿病肾病的治疗效果。具体地，首先发明人通过对SD大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）来完成糖尿病肾病（DN）的造模。对造模成功的大鼠给予本发明的魔芋多肽提取物，连续给药4个月后测尿微量白蛋白。结果发现，经过长期灌胃给药魔芋多肽提取物，在对DN大鼠尿微量白蛋白（MA）的影响方面，本发明的魔芋多肽提取物与模型组相比具有显著性差异。这也说明魔芋多肽提取物可以用于治疗糖尿病肾病。
与此同时，本发明还提供了一种治疗和/或预防糖尿病、糖尿病并发症尤其是动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变、非酒精性脂肪肝、糖尿病肾病的方法，即给与本发明的魔芋多肽提取物10mg～3000mg/d，优选地，给与本发明的魔芋多肽提取物60～1200mg/d。其中给药频次对与本领域的技术人员来说是可以依据病情、年龄等各种因素综合考虑后确定的。
魔芋多肽提取物作为糖尿病及其并发症的治疗药物，与其他抗糖尿病药物相比，具有如下技术优势：首先，适用面广。适用于各类型的糖尿病人、糖耐量异常或血糖偏高者，对肥胖、遗传等原因的血糖增高者，服用后可防患于未然。其次，不会引起低血糖反应。魔芋多肽主要是改善、修复自身胰岛素活性，与细胞受体产生亲和力，这种促进仍在机作整体调控之中。最后，毒副作用非常小。一般情况下降糖是通过外源性药物刺激β细胞释放胰岛素，这样就使胰岛素无法长期承受这样的超负荷刺激，也刺激了肝、肾代谢功能，无异于杀鸡取卵。具有降血糖功能的魔芋多肽是尽量给机体提供辅助手段，让机体自身提高调节血糖的能力，其调节机理和植物中提取的特点决定了其服用的安全性。
本发明的第四个目的是提供一种含有上述魔芋多肽提取物的药物制剂，所述的药物制剂为临床上常用的药物剂型。作为药物制剂而言，可以将本发明的魔芋多肽提取物配制成各种形式，如片剂、胶囊剂、口服液和注射剂，对于片剂，将多肽提取物与药学上认可的适用载体混合，所述的药学上认可的载体也称为赋形剂，须具有足够的纯度和可以接受的低毒性，比如微晶纤维素、淀粉等。
本发明的第五个目的在于提供包含上述魔芋多肽提取物的药物组合物及其它们作为治疗糖尿病或糖尿病并发症的用途。
在本发明提供的魔芋多肽提取物及其用于治疗糖尿病及其并发症的基础上，本发明提供了含有魔芋多肽提取物的药物组合物，所述的药物组合物还含有如下活性组分：至少一种胰岛素增敏剂或至少一种胰岛素促分泌剂，作为本发明药物组合物的一个优选实施例，本发明的药物组合物还含有吡格列酮；作为本发明药物组合物的另一个优选实施例，本发明的药物组合物还含有格列美脲。本发明的药物组合物与单独给予魔芋多肽提取物或吡格列酮（或格列美脲）相比，在降低糖化血红蛋白和尿微量白蛋白方面，取得了预料不到的协同作用。
为此，为了进一步优选糖尿病及其糖尿病并发症的治疗方案，本发明提供了另外一种治疗糖尿病及其并发症的方法，即给予本发明的药物组合物治疗。其中，所述的糖尿病并发症为动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变、非酒精性脂肪肝和糖尿病肾病。对于糖尿病及其并发症的一个治疗方案，同时给予魔芋多肽和吡格列酮（或格列美脲），魔芋多肽与吡格列酮（或格列美脲）的重量比可以是药学上能够接受的任意比例。优选地，魔芋多肽与吡格列酮（或格列美脲）的重量比为：（10～3000）:（3～120），进一步优选地，魔芋多肽与吡格列酮（或格列美脲）的重量比为（60～1200）:（5～40）；所述的重量比是在活性组分的有效剂量的比值。例如，药物组合物中吡格列酮的有效剂量为3～120mg/d，魔芋多肽提取物的有效剂量为10～3000mg/d。
更优选地，可以给予糖尿病患者一种药物剂型进行治疗，通常，通过常规制剂技术制成含有魔芋多肽提取物和吡格列酮（或格列美脲）的固体口服制剂，包括普通片、分散片、缓释片、胶囊或注射剂。
总之，本发明与现有技术相比，具有如下突出的技术优势：
（1）该工艺有效地利用了通常的魔芋精粉加工过程的废弃物魔芋飞粉，制备得到了有重大的药物价值的魔芋多肽提取物，具有十分重要的生产意义和经济价值。
（2）本发明采用酶解法制备生物活性肽，并仿效人体消化道内的正常消化条件将魔芋蛋白切割成特定的水解片段，对水解酶的种类、用量和酶解条件进行了优化；酶解条件温和，较无机酸、碱水解有较大的优势，避免了水解过程中的环境污染问题。
（3）本发明创造性地利用超滤手段定向收集350～3500Da内的多肽片段，并使所得多肽组合物中该分子量范围内的多肽纯度高达97%，且工艺稳定，重现性高。
（4）本发明还通过药效实验证明本发明所制备的魔芋多肽提取物可以显著降低STZ诱导糖尿病大鼠的血糖、糖化血红蛋白和尿微量白蛋白水平，表明魔芋多肽提取物对糖尿病有显著的治疗作用。并且植物多肽提取物用于糖尿病的治疗时疗效确切、不良反应和副作用均明显降低，且能实现糖尿病患者的稳定降糖效果，可大大提高糖尿病患者的用药依从性。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明所述的魔芋多肽提取物、制备方法和用途仅仅进行名称上的变更、替换，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围之内。
第一部分魔芋多肽提取物的制备
实施例1从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节含有魔芋飞粉的水溶液的pH值至8.5，浸提时间为100min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.0、温度至60℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为2.5小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为碱性蛋白酶和胰蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50。
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至7.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为4.0小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:100。
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为40℃，pH为9.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，即得魔芋多肽提取物。经检测分析，魔芋多肽提取物中魔芋多肽的含量高达85.9%。
实施例2从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节含有魔芋飞粉的水溶液的pH值至9.5，浸提时间为20min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至8.0、温度至50℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为4.5小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:150。
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至9.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为2.0小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为中性蛋白酶，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:400。
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为50℃，pH为7.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。经过检测，上述方法获得的魔芋多肽提取中的魔芋多肽的含量在92.5%。
实施例3从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100，其中碱性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50，中性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50；
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为胰蛋白酶，胰蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在97.2%，活性多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
实施例4从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100；
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为碱性蛋白酶，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在92.2%，活性多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
实施例5从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100；
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为胃蛋白酶，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在96.1%，活性多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
实施例6从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为中性蛋白酶和胃蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:200；
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为胰蛋白酶，第二酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在95.4%，活性多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
实施例7从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物一种方法
（1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
（2）第一次酶解反应：
调节（1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100，其中碱性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:80，中性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:20；
（3）第二次酶解反应：
调节（2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为胰蛋白酶，胰蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
（4）超滤纯化：
将（3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物。
经过检测，上述方法获得的魔芋活性多肽提取中的活性多肽的含量在96.2%，活性多肽的分子量范围在350～3500道尔顿之间。
需要注意的是，第一酶解蛋白酶可以有很多选择，例如，可以是碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶三种，也可以是任意四种。在此不能将每一配比都写入实施例，但其也在本发明保护范围内。
第二部分本发明含有魔芋多肽提取物的药物制剂
实施例8片剂
处方魔芋多肽提取物10g
微晶纤维素350g
2%羟丙基甲基纤维素溶液适量
低取代羟丙基纤维素140g
硬脂酸镁10g
制备工艺：魔芋多肽提取物过100目筛，微晶纤维素和低取代羟丙基纤维素过80目筛，称取处方量的魔芋多肽提取物与低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素混合均匀，加入2%羟丙基甲基纤维素溶液适量制粒，40℃干燥，16目筛整粒，干颗粒中加入处方量的硬脂酸镁混匀，压片即得，共制成1000片。
实施例9片剂
处方魔芋多肽提取物40g
盐酸吡格列酮120g
微晶纤维素350g
2%羟丙基甲基纤维素溶液适量
低取代羟丙基纤维素140g
硬脂酸镁10g
制备工艺：魔芋多肽提取物和盐酸吡格列酮过100目筛，微晶纤维素和低取代羟丙基纤维素过80目筛，称取处方量的魔芋多肽提取物和盐酸吡格列酮与低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素混合均匀，加入2%羟丙基甲基纤维素溶液适量制粒，40℃干燥，16目筛整粒，干颗粒中加入处方量的硬脂酸镁混匀，压片即得，共制成1000片。
实施例10片剂
处方魔芋多肽提取物3000g
格列美脲120g
微晶纤维素350g
2%羟丙基甲基纤维素溶液适量
低取代羟丙基纤维素140g
硬脂酸镁10g
制备工艺：魔芋多肽提取物和格列美脲过100目筛，微晶纤维素和低取代羟丙基纤维素过80目筛，称取处方量的魔芋多肽提取物和格列美脲与低取代羟丙基纤维素、微晶纤维素混合均匀，加入2%羟丙基甲基纤维素溶液适量制粒，40℃干燥，16目筛整粒，干颗粒中加入处方量的硬脂酸镁混匀，压片即得，共制成1000片。
实施例11双层片
A、盐酸吡格列酮30g
羧甲基纤维素钠15g
处理琼脂10g
微晶纤维素65g
6%PVP的无水乙醇溶液适量
硬脂酸镁1g
制备工艺：盐酸吡格列酮过100目筛，羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、处理琼脂过80目筛，称取处方量的吡格列酮和羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、处理琼脂混合均匀，加入6%PVP无水乙醇溶液适量制粒，60℃干燥，16目筛整干颗粒，干颗粒中加入处方量的硬脂酸镁。
B、魔芋多肽提取物200g
微晶纤维素350g
2%羟丙基甲基纤维素溶液适量
山榆酸甘油脂140g
制备工艺：魔芋多肽提取物过100目筛，微晶纤维素过80目筛，称取处方量的魔芋多肽提取物、微晶纤维素混合均匀，加入2%羟丙基甲基纤维素溶液适量制粒，40℃干燥，16目筛整粒，干颗粒中加入处方量的山榆酸甘油脂。
C、将上述两种组分采用双层压片机冲压片即得双层片，共制成1000片。
实施例12分散片
处方魔芋多肽提取物200g
盐酸吡格列酮5g
交联聚乙烯吡咯烷酮7g
5%PVPK30无水乙醇溶液适量
微晶纤维素110g
硬脂酸镁2g
制备工艺：魔芋多肽提取物和盐酸吡格列酮过100目筛，交联聚乙烯吡咯烷酮过80目筛，称取处方量的魔芋多肽提取物、盐酸吡格列酮和交联聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，加入5%PVPK30无水乙醇溶液适量制粒，干燥后加入处方量微晶纤维素、硬脂酸镁混匀，压片即得，共制成1000片。
实施例13缓释片
魔芋多肽提取物1200g
HPMC-4M80g
8%PVP无水乙醇溶液20g
乳糖12g
硬脂酸镁0.4g
制备工艺：魔芋多肽提取物过100目筛，HPMC-4M过80目筛，称取处方量的魔芋多肽提取物和乳糖、HOMC-4M混合均匀，加入8%PVP无水乙醇溶液适量制粒，60℃干燥，16目筛整干颗粒，干颗粒中加入处方量的硬脂酸镁，混匀，异型冲压片即得，，共制成1000片。
实施例14胶囊
处方魔芋多肽提取物400g
盐酸吡格列酮40g
预胶化淀粉60g
微晶纤维素100g
6%PVP的95%乙醇溶液适量
硬脂酸镁3g
制备工艺：将处方中的魔芋多肽提取物、盐酸吡格列酮、预胶化淀粉、微晶纤维素和硬脂酸镁分别过100目筛，混匀，加6%PVP的95%乙醇溶液适量制粒，40℃烘干，18目筛整粒，胶囊充填即可，共制成1000粒。
实施例14注射液
魔芋多肽提取物60mg
氯化钠450mg
0.05mol/L氢氧化钠溶液适量
直射用水加至100ml
制备工艺：先制得氯化钠浓配溶液过滤，加入魔芋多肽提取物搅拌使溶解，注射用水加至全量，用适量0.05mol/L氢氧化钠溶液调节药液pH值为4.3，灌装灭菌，即得。
需要注意的是，魔芋多肽与吡格列酮（或格列美脲）的其他配比也能达到治疗糖尿病及其并发症的目的，优选地，魔芋多肽与吡格列酮（或格列美脲）重量比为：（10～3000）:（3～120），进一步优选地，魔芋多肽与吡格列酮（或格列美脲）的重量比为（60～1200）:（5～40）；所述的重量比是在活性组分的有效剂量的比值。例如，药物组合物中吡格列酮的有效剂量为3～120mg/d，魔芋多肽提取物的有效剂量为10～3000mg/d。在此不能将每一配比都写入实施例，但其也在本发明保护范围内。
第三部分本发明魔芋多肽提取物的药效学研究
试验例1、魔芋多肽提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白和尿微量白蛋白的影响
1、实验目的
本研究通过观察魔芋多肽提取物对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠糖化血红蛋白和尿微量白蛋白的影响，以探讨魔芋多肽提取物对糖尿病及糖尿病肾病的药物疗效。
、动物模型的建立
选用SD大鼠90只，雄性，体重（250±20）g,由中山大学动物实验中心提供。所有大鼠适应性喂养一周后，禁食12h，按照65mg/kg腹腔内一次性注射链脲佐菌素（STZ）。STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH4.5）配制成2%的STZ注射剂，10min内用完。全部大鼠在同一动物房内分笼饲养，标准饮食。连续喂养2周，测血糖、糖化血红蛋白和24h尿微量白蛋白尿β2微球蛋白，其中糖尿病大鼠（DM大鼠）的选择标准需同时满足如下三个条件：大鼠血糖高于16.7mmol/L。
、分组与给药
成模DM大鼠随机分成一个模型组和6个给药组，另外增设1个正常组，正常组选用SD大鼠，每组10只，各组均采取灌胃给药方式。具体分组及给药如下：
正常对照组：灌胃同体积的纯化水；
模型对照组：灌胃同体积的羧甲基纤维素钠；
吡格列酮组：灌胃2mg/（kg.d）吡格列酮；
格列美脲组：灌胃2mg/（kg.d）格列美脲；
魔芋飞粉组：灌胃200mg/（kg.d）魔芋飞粉；
魔芋葡甘聚糖组：灌胃200mg/（kg.d）魔芋葡甘聚糖；
提取物低剂量组：灌胃200mg/（kg.d）实施例1的魔芋多肽提取物；
提取物中剂量组：灌胃400mg/（kg.d）实施例1的魔芋多肽提取物；
提取物高剂量组：灌胃600mg/（kg.d）实施例1的魔芋多肽提取物；
复方1组：灌胃200mg/（kg.d）实施例1的魔芋多肽提取物+2mg/（kg.d）格列美脲；
复方2组：灌胃200mg/（kg.d）实施例1的魔芋多肽提取物+2mg/（kg.d）吡格列酮。
、实验方法与指标检测
DM大鼠模型成功后，继续喂养12周，期间按照上述给药方案进行给药，并进行严密观察。实验结束前一天，用代谢笼收集24h尿，使用美国核电ACE全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白（MA）检测尿微量白蛋白。末次给药后，大鼠取血，迈瑞全自动生化分析仪检测血糖；使用日本TOSOH公司HLC-723G7糖化血红红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白。收集数据，用SPSS12.0软件处理，数据用均数加减标准差表示，两组间差异性显著比较用t检验。
血糖水平是衡量糖尿病的指标，血糖浓度越大表示糖尿病的病情越严重；尿微量白蛋白（MA）是衡量肾小球和肾小管损坏程度的指标，这两个数值越大表明肾脏损坏程度越大，糖化血红蛋白水平与糖尿病的恶化程度正相关。
．实验结果
5.1魔芋多肽提取物对DM大鼠血糖的影响
实验结果表明（具体参见表1）:
（1）与模型组比较，各治疗组在降低血糖方面具有显著或极显著性差异；
（2）与魔芋飞粉组或魔芋葡甘聚糖组，提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组在降低血糖方面都具有显著性差异；
（3）与提取物低剂量组、吡格列酮组相比，复方组在降低血糖方面都具有显著性差异，这表明联合用药组与单独使用魔芋多肽提取物组或吡格列酮组相比，具有显著的进步。
表1魔芋多肽提取物对DN大鼠血糖的影响
注:▲与模型组比较，p＜0.05；
▲▲与模型组比较，p＜0.01；
★与魔芋飞粉组比较，p＜0.05；
■与魔芋葡甘聚糖组比较，p＜0.05；
#与格列美脲组相比，p＜0.05；
*与吡格列酮组相比，p＜0.05。
5.2本发明魔芋多肽提取物对DM大鼠尿微量白蛋白的影响
实验结果表明（具体参见表2）：
（1）与魔芋飞粉组或魔芋葡甘聚糖组，提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组在降低尿微量白蛋白方面都具有显著性差异；
（2）与提取物低剂量组、吡格列酮组相比，复方组在降低尿微量白蛋白方面都具有显著性差异，并取得了协同作用。
这进一步表明，本发明的魔芋多肽提取物及其含有魔芋多肽提取物和吡格列酮的药物组合物对预防和治疗糖尿病引起的肾脏损伤具有很好的作用，并且含有魔芋多肽提取物和吡格列酮的药物组合物对于影响DN大鼠尿微量白蛋白方面取得了预料不到的协同作用。因此，本发明的魔芋多肽提取物及其含有魔芋多肽提取物和吡格列酮的药物组合物可以作为制备治疗糖尿病肾病的药物使用。
表2魔芋多肽提取物对DM大鼠尿微量白蛋白（MA）的影响
注:▲与模型组比较，p＜0.05；
▲▲与模型组比较，p＜0.01；
★与魔芋飞粉组比较，p＜0.05；
■与魔芋葡甘聚糖组比较，p＜0.05；
#与格列美脲组相比，p＜0.05；
*与吡格列酮组相比，p＜0.05。
5.3本发明魔芋多肽提取物对糖化血红蛋白的影响
实验结果表明（具体参见表3）：
（1）与模型组相比，各治疗组在降低糖化血红蛋白方面都具有显著性或极其显著性差异；
（2）与魔芋飞粉组或魔芋葡甘聚糖组，提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组在降低糖化血红蛋白方面都具有显著性差异；
（3）与提取物低剂量组、吡格列酮组相比，复方组在降低糖化血红蛋白方面效果更好。
这进一步表明，本发明的魔芋多肽提取物及其含有魔芋多肽提取物和吡格列酮的药物组合物对治疗糖尿病及其糖尿病的并发症方面具有很好的效果。因此，本发明的魔芋多肽提取物及其含有魔芋多肽提取物和吡格列酮的药物组合物可以作为制备治疗糖尿病的药物使用。
表3魔芋多肽提取物对DM大鼠糖化血红蛋白（HbA1c）的影响
注:▲与模型组比较，p＜0.05；
▲▲与模型组比较，p＜0.01；
★与魔芋飞粉组比较，p＜0.05；
■与魔芋葡甘聚糖组比较，p＜0.05。
Claims (5)
1.一种从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物的方法，其特征在于，它包含如下步骤：
1）魔芋蛋白提取液的制备：
将魔芋飞粉加入纯水中，魔芋飞粉与纯水重量比为1:50，搅拌混匀得含有魔芋飞粉的水溶液；用NaOH溶液调节上述水溶液的pH值至9.0，浸提时间为50min，然后离心处理，去除不溶物，即得魔芋蛋白提取液，其中含有魔芋飞粉蛋白；
2）第一次酶解反应：
调节步骤1）中所得的魔芋蛋白提取液的pH至7.5、温度至55℃，加入第一酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第一次酶解液，所述的第一酶解蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶，第一酶解蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:100，其中碱性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50，中性蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为3:50；
3）第二次酶解反应：
调节步骤2）中所得的第一次酶解液的pH至8.0、温度至37℃，加入第二酶解蛋白酶，恒温搅拌酶解，酶解时间为3小时，即得第二次酶解液，所述的第二酶解蛋白酶为胰蛋白酶，胰蛋白酶与魔芋飞粉蛋白的重量比为1:300；
4）超滤纯化：
将步骤3）所得到的第二次酶解液，在温度为45℃，pH为8.0，选择350Da和3500Da的滤膜将第二次酶解液中350Da～3500Da分子量的魔芋多肽进行分离，获得的分离液即为魔芋多肽提取物,所述的魔芋多肽提取物中含有魔芋多肽97%，总酸1.2%，全糖1.1%，铵盐0.7%，且魔芋多肽的分子量为350～3500Da。
2.根据权利要求1所述的从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物的方法获得的魔芋多肽提取物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
3.根据权利要求1所述的从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物的方法获得的魔芋多肽提取物在制备治疗糖尿病并发症的药物中的用途，所述的糖尿病并发症为糖尿病肾病。
4.包含权利要求1所述的从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物的方法获得的魔芋多肽提取物的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂还含有赋形剂，并且所述的药物制剂为片剂、胶囊剂或注射剂。
5.包含权利要求1所述的从魔芋飞粉中制备魔芋多肽提取物的方法获得的魔芋多肽提取物的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中还含有吡格列酮或格列美脲。
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