CN103432590A - 石墨烯量子点核靶向载药体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开石墨烯量子点核靶向载药体系及其制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：（1）将石墨烯量子点水溶液和抗癌药物水溶液灭菌；（2）将石墨烯量子点水溶液与抗癌药物水溶液按质量浓度比为5:1——50:1的比例混合得到载药体系；（3）将载药体系与细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性以及用荧光显微镜检测载入细胞的药物。本发明利用石墨烯量子点的单原子平面结构的特点，与具有多环平面结构的小分子抗癌药物通过p键结合形成在水溶液可以稳定存在的载药体系。石墨烯量子点不仅具有载药功能，同时因它的特殊结构还可增加药物对细胞的毒性。该载药体系本身毒性较低，制备方法简单，易于实施，具有载药和增强药物细胞毒性的双重功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地讲，涉及一种石墨烯量子点核靶向载药体系，以及该体系的制备方法和在抗癌药物方面的应用。
背景技术
纳米材料以其纳米级的结构特征和多样化的性能在提高药物的摄入、靶向性和疗效等方面都显示了前所未有的发展前景。多种多样的纳米材料，例如碳纳米管、纳米聚合物、纳米颗粒等在癌症治疗上的应用正在被广泛的开发研究。但是许多纳米载药只是提高了药物进入细胞的效率，而并没有改善药物进入细胞核的效率，特别是对耐药细胞的耐药性没有很有效的改善。所以纳米载药系统能否有效运送抗癌药物到细胞核仍然是亟待解决的难题。
为此，人们开发了许多提高药物的核靶向传递方法，例如改进纳米材料本身的物理化学性质，或者利用具有核靶向功能的化学或者生物小分子对纳米材料表面进行修饰，或者直接利用生物相容性良好的DNA制成纳米材料进行载药，这些方法的应用对抗癌药物在细胞核的靶向性以及抗耐药性方面都有所改善。例如用具有核靶向性的多肽TAT修饰纳米材料表面，可以较为明显地增强其进入细胞核的能力。但是这些化学以及生物分子的修饰不仅材料的制备复杂，而且可能会引起载药体系在细胞内的其它应激反应，大大限制了体系的应用。
近年来，石墨烯和氧化石墨烯以其单层的结构、独特的化学性质和良好的生物相容性，引起了生物医药领域的研究热潮。据文献报道，理论上氧化石墨烯有望提高药物在水溶液的溶解性、延长药物半衰期，缓释控药物等等。例如文献报道将氧化石墨烯表面用聚乙二醇（PEG）进行修饰，可以提高水溶性较差的抗癌药物在水中的溶解度；用叶酸修饰氧化石墨烯作为复合抗癌药物的载药体系后可以提高对有叶酸受体细胞的靶向性。但是大部分研究中氧化石墨烯的尺寸较大，而且都需要进行化学修饰，药物到细胞核的靶向性较差。
为了解决上述问题，我们发明了利用氧化石墨烯量子点载药物，该载药体系利用了量子点的尺寸较小且分布均匀，水溶液中分散性好，单原子层等特性，不需要经过任何化学修饰，就可实现将抗癌药物靶向运送到细胞核。该载药体系可以将抗癌药物运送到不同的癌细胞，在癌症治疗中具有极大的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于，针对大部分未经修饰的纳米载药体系中抗癌药物不能有效在药物发生作用的细胞核有效累积的问题，提供一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法。
本发明的第二个目的在于，提供一种石墨烯量子点核靶向载药体系。
本发明的第三个目的在于，提供石墨烯量子点水溶液在制备核靶向载药体系中的应用。
为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将石墨烯量子点水溶液和抗癌药物水溶液灭菌，所述石墨烯量子点水溶液是以Hummers法合成的氧化石墨烯水溶液为起始物，利用Photo-Fenton反应，即以H2O2为氧化剂，Fe3+为催化剂，在紫外光辐射下制备而成，将产物在超纯水中透析，去除未反应H2O2和反应产生的小分子，得到纯净的石墨烯量子点水溶液；所述抗癌药物为具有多环平面结构的小分子抗癌药物；
（2）将石墨烯量子点水溶液与抗癌药物水溶液按质量浓度比为5:1——50:1的比例混合得到载药体系；
（3）将步骤（2）获得的载药体系与细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性以及用荧光显微镜检测载入细胞的药物。
作为一个优选方案，步骤（1）所述灭菌是指用0.22μm的过滤膜过滤溶液。
作为一个优选方案，步骤（2）中所述石墨烯量子点水溶液与抗癌药物水溶液质量浓度比为15:1。
作为一个优选方案，所述抗癌药物是指多柔比星、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌和喜树碱中的一种或几种。
作为一个优选方案，当抗癌药物是多柔比星时，步骤（2）中多柔比星水溶液的浓度为10 mM。
作为一个优选方案，步骤（2）中当多柔比星水溶液的浓度为10 mM时，石墨烯量子点水溶液的浓度为0.5mg/mL。
作为一个优选方案，步骤（2）中所述混合是指在室温下摇匀混合30 min。
作为一个优选方案，步骤（3）中所述细胞指指人胃癌细胞MGC-803和人乳腺癌细胞MCF-7中的一种或几种。
为实现以上第二个目的，本发明提供按照上述方法制备获得的石墨烯量子点核靶向载药体系。
为实现以上第三个目的，本发明提供石墨烯量子点水溶液在制备核靶向载药体系中的应用，其特征在于，所述石墨烯量子点水溶液是以Hummers法合成的氧化石墨烯水溶液为起始物，利用Photo-Fenton反应，即以H2O2为氧化剂，Fe3+为催化剂，在紫外光辐射下制备而成，将产物在超纯水中透析，去除未反应H2O2和反应产生的小分子，得到纯净的石墨烯量子点水溶液；所述载药体系中的药是指具有多环平面结构的小分子抗癌药物。
具有和多柔比星相似的多环平面结构的小分子抗癌药物，均可以和石墨烯量子点通过p-p作用结合而形成载药体系。
本发明的优点在于：与现有纳米载药体系相比，本发明利用石墨烯量子点的单原子平面结构的特点，与具有多环平面结构的小分子抗癌药物通过p键结合形成在水溶液可以稳定存在的载药体系。本发明中利用的石墨烯量子点不仅具有载药的功能，同时因为它的特殊结构还可以增加药物对细胞的毒性。该载药体系本身毒性较低，制备方法简单，易于实施，具有载药和增强药物细胞毒性的双重功能。
附图说明
图1 为本发明内容的示意图。
图2为多柔比星载药体系与多柔比星单独进入MCF-7细胞的激光共聚焦图像的对照。
图3为多柔比星载药体系与多柔比星单独进入MCF-7/ADR细胞的荧光显微镜成像图像的对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.石墨烯量子点靶向载药体系将多柔比星载入人乳腺癌细胞MCF-7
一、载药体系的细胞毒性：
第一步、将0.5mg/mL石墨烯量子点水溶液和10mM的多柔比星水溶液用0.22μm的过滤膜过滤。
第二步、将两种试剂室温下摇匀混合，得到终浓度为10μM的多柔比星和依次增加浓度的石墨烯量子点的载药体系溶液。
第三步、在96孔细胞培养板上接种MCF-7细胞，密度为每孔4000-5000个细胞，在37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养12h使其贴壁后，去掉培养基并用0.1M的PBS冲洗。
第四步、96孔板中分别加入100μL不同浓度比例的载药体系溶液，与细胞在37℃下共培育24h，其中空白对照组为只加入100μL不含血清的培养基。培育结束后，在每个孔中加入5mg/mL MTT 20μL，继续培育4h，吸掉上清液，每个孔中加入150μL DMSO，混合均匀后，用酶标仪测量490nm处的吸光值，共进行6组平行样品测量。
MTT测量的结果表明，加入石墨烯量子点得到的多柔比星载药体系对MCF-7细胞的毒性比同等浓度的多柔比星对MCF-7细胞的毒性大，并且随着石墨烯量子点浓度增加，载药体系对MCF-7细胞的毒性增大。
二、将多柔比星载入MCF-7细胞：
第一步、将0.5mg/mL石墨烯量子点水溶液和10mM的多柔比星水溶液用0.22μm的过滤膜过滤。
第二步、将两种试剂室温摇匀混合，得到终浓度为1μM的多柔比星和15μg/mL的石墨烯量子点的载药体系溶液，其中多柔比星和石墨烯量子点的浓度比例在1:15。
第三步、在24孔细胞培养板上接种MCF-7细胞，密度为每孔5×104个细胞，其中，24孔板内事先放入Φ14mm的用明胶包被过的盖玻片，在37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养12h使其贴壁后，去掉培养基并用0.1M的PBS冲洗。
第四步、将500μL载药体系溶液和500μL的1μM的多柔比星溶液分别加入24孔板中与细胞在37℃下共培育4h，其中空白对照组为只加入不含血清的培养基。培育结束后，吸掉上清液并用0.1M的PBS冲洗两遍，然后用pH7.4，4%的多聚甲醛溶液室温下固定15min。吸掉固定液并用0.1M的PBS冲洗两遍，然后在每个孔中加入300μL 的0.5μg/mL染核试剂Hoechst溶液，室温下培育5min，吸掉染核试剂并用0.1M的PBS冲洗两遍。
三、载药效果检测
将贴有细胞的盖玻片分别取出，利用封片液贴在载玻片上制成细胞爬片，在荧光显微镜，或者激光共聚焦显微镜下进行成像，确定药物在细胞核的累积。如图2所示为多柔比星载药体系和多柔比星自身进入MCF-7细胞的激光共聚焦图像，从图中可见石墨烯量子点载药体系可以在同等浓度下将更多的多柔比星带入MCF-7细胞的细胞核中。
实施例2.石墨烯量子点靶向载药系统将多柔比星载入人胃癌细胞MGC-803
第一步、将0.5mg/mL石墨烯量子点水溶液和10mM的多柔比星水溶液用0.22μm的过滤膜过滤。
第二步、将两种试剂室温下摇匀混合，得到终浓度为2μM的多柔比星和依次增加浓度的石墨烯量子点的载药体系溶液。
第三步、在96孔细胞培养板上接种MGC-803细胞，密度为每孔4000-5000个细胞，在37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养12h使其贴壁后，去掉培养基并用0.1M的PBS冲洗。
第四步、96孔板中分别加入100μL不同浓度比例的载药体系溶液，与细胞在37℃下共培育24h，其中空白对照组为只加入100μL不含血清的培养基。培育结束后，在每个孔中加入5mg/mL MTT 20μL，继续培育4h，吸掉上清液，每个孔中加入150μL DMSO，混合均匀后，用酶标仪测量490nm处的吸光值，共进行6组平行样品测量。
MTT测量的结果表明，载药体系对MGC-803细胞的毒性比同等浓度的多柔比星对MGC-803细胞的毒性要大，并且随着石墨烯量子点浓度增加，此多柔比星载药体系对MGC-803细胞的毒性增大。
实施例3.石墨烯量子点靶向载药系统将多柔比星载入耐药人乳腺癌细胞MCF-7（MCF-7/ADR）
第一步、将0.5mg/mL石墨烯量子点水溶液和10mM的多柔比星水溶液用0.22μm的过滤膜过滤。
第二步、将两种试剂在室温摇匀混合30min，得到终浓度为1μM的多柔比星和15μg/mL的石墨烯量子点的载药体系溶液，其中多柔比星和石墨烯量子点的浓度比例在1:15。
第三步、在24孔细胞培养板上接种MCF-7细胞，密度为每孔5×104个细胞，其中，24孔板内事先放入Φ14mm的用明胶包被过的盖玻片，在37℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养12h使其贴壁后，去掉培养基并用0.1M的PBS冲洗。
第四步、将500μL载药体系溶液和500μL 的1μM的多柔比星溶液分别加入24孔板中与细胞在37℃下共培育4h，其中空白对照组为只加入不含血清的培养基培育结束后，吸掉上清液并用0.1M的PBS冲洗两遍，然后用pH7.4，4%的多聚甲醛溶液室温下固定15min，吸掉固定液并用0.1M的PBS冲洗两遍，然后在每个孔中加入300μL 的0.5μg/mL染核试剂Hoechst溶液，室温下培育5min，吸掉试剂并用0.1M的PBS冲洗两遍。
第五步、将贴有细胞的盖玻片分别取出，利用封片液贴在载玻片上制成细胞爬片，在荧光显微镜，或者激光共聚焦显微镜下进行成像。
如图3所示为载药体系和多柔比星单独进入MCF-7/ADR细胞的荧光显微镜成像图像。为了准确比较多柔比星进入细胞核的量，细胞核用Hoechst染核试剂染色，具有蓝色荧光，而多柔比星显红色荧光。 从图中可见多柔比星单独不能进入具有耐药性的MCF-7/ADR细胞的细胞核中，但是用石墨烯量子点载运的多柔比星体系可以将多柔比星运送到MCF-7/ADR细胞的细胞核中。
以上实施例中利用石墨烯量子点的单原子平面结构的特点，与多柔比星通过p键结合形成在水溶液可以稳定存在的载药体系。具有和多柔比星相似的多环平面结构的小分子抗癌药物，比如柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、喜树碱等均可以和石墨烯量子点通过p-p作用结合而形成载药体系。本发明中利用的石墨烯量子点不仅具有载药的功能，同时因为它的特殊结构还可以增加药物的对细胞的毒性。该载药体系本身毒性较低，制备方法简单，易于实施，具有载药和增强药物细胞毒性的双重功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1. 一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将石墨烯量子点水溶液和抗癌药物水溶液灭菌，所述石墨烯量子点水溶液是以Hummers法合成的氧化石墨烯水溶液为起始物，利用Photo-Fenton反应，即以H2O2为氧化剂，Fe3+为催化剂，在紫外光辐射下制备而成，将产物在超纯水中透析，去除未反应H2O2和反应产生的小分子，得到纯净的石墨烯量子点水溶液；所述抗癌药物为具有多环平面结构的小分子抗癌药物；
（2）将石墨烯量子点水溶液与抗癌药物水溶液按质量浓度比为5:1——50:1的比例混合得到载药体系；
（3）将步骤（2）获得的载药体系与细胞共培育，用MTT法检测细胞毒性以及用荧光显微镜检测载入细胞的药物。
2. 根据权利要求1所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述灭菌是指用0.22μm的过滤膜过滤溶液。
3.根据权利要求1所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述石墨烯量子点水溶液与抗癌药物水溶液质量浓度比为15:1。
4.根据权利要求1所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，所述抗癌药物是指多柔比星、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌和喜树碱中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，当抗癌药物是多柔比星时，步骤（2）中多柔比星水溶液的浓度为10 mM。
6.根据权利要求5所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，步骤（2）中当多柔比星水溶液的浓度为10 mM时，石墨烯量子点水溶液的浓度为0.5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述混合是指在室温下摇匀混合30 min。
8. 根据权利要求1所述的一种石墨烯量子点核靶向载药体系的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述细胞指指人胃癌细胞MGC-803和人乳腺癌细胞MCF-7中的一种或几种。
9.利用权利要求1—8中任一所述制备方法获得的石墨烯量子点核靶向载药体系。
10.石墨烯量子点水溶液在制备核靶向载药体系中的应用，其特征在于，所述石墨烯量子点水溶液是以Hummers法合成的氧化石墨烯水溶液为起始物，利用Photo-Fenton反应，即以H2O2为氧化剂，Fe3+为催化剂，在紫外光辐射下制备而成，将产物在超纯水中透析，去除未反应H2O2和反应产生的小分子，得到纯净的石墨烯量子点水溶液；所述载药体系中的药是指具有多环平面结构的小分子抗癌药物。
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