CN103421101B - 一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体 - Google Patents
一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一个球孢白僵菌的C2H2型锌指蛋白BbAzf，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。卵孢素具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性，通过破坏该基因可以提高球孢白僵菌中卵孢素的产量，获得的球孢白僵菌基因敲除子对农林害虫有较高的毒力。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf。
本发明涉及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体，含有抗除草剂的筛选基因Bar。
本发明涉及球孢白僵菌BbAzf基因的敲除突变体，该突变体可以大量产生红色色素——卵孢素。与球孢白僵菌野生型菌株相比，BbAzf突变体对农业害虫菜青虫有较高的毒力。
背景技术
真菌发育的一个重要方面是产生次生代谢物。这些次生代谢物尽管对真菌的生长和发育不是必需的，但却是真菌在生态环境中的稳定或致病动植物不可缺少的。部分真菌次生代谢物在生物技术和医药领域有着重要的作用，展示了广谱的抗生素、抗病毒、抗肿瘤、抗高胆固醇和免疫抑制活性，如青霉素和环孢菌素等；而另外一些则对动物或人类健康构成了威胁，如黄曲霉素和T-2毒素等。因此，长期以来，真菌次生代谢物的研究一直受到研究者的广泛关注。昆虫病原真菌在生长发育或致病昆虫的过程中产生的一些次生代谢物被证明与真菌的毒力相关，如白僵菌素（Beauvericin）、破坏素等。Xu et al.从球孢白僵菌中克隆了白僵菌素的非核糖体酶合成基因BbBeas，并分析了该基因对菌株毒力的影响。结果显示，当敲除BbBeas后，菌株不能产生球孢白僵菌素，对Galleria mellonella，Helicoverpa zea，Spodoptera exigua等昆虫的毒力显著降低。在接种后7天，野生型菌株可造成约70～98％的死亡率，而基因敲除突变株仅有10～23％的死亡率(Xu et al.，2008)。此外，Wang et al.通过比较基因组学手段克隆了绿僵菌的破坏素（Destruxins）合成酶基因DtxS1。研究发现产破坏素株系的宿主范围广，而不产破坏素株系的宿主范围窄(Wang et al.，2012)。这些研究表明，昆虫病原真菌产生的对昆虫具有毒性的次生代谢物在真菌侵染致病昆虫的过程中发挥着重要的作用，可望利用其提高菌株的毒力或开发出新型的生物农药。但目前从昆虫病原真菌中鉴定出来的与真菌毒力相关的次生代谢物还相对较少，已知的多数次生代谢物也仅知道其化学结构，缺乏对其合成基因及调控机理的深入认识。
球孢白僵菌是我国应用较为广泛一种昆虫病原真菌，在发育过程中会产生一种次生代谢物——卵孢素(Eyal et al.，1994)。卵孢素是一种红色的羟基苯醌衍生物，具有抗菌和抗肿瘤活性(Mao et al.，2010)，其活性机制主要是通过还原反应改变蛋白质和氨基酸上的巯基，从而使酶失活或者抑制ATPase活性。卵孢素也可以抑制Herpes simplex病毒－IDNA聚合酶的活性，从而抑制病毒活性（for a review，Strasser et al.，2000）。此外，研究发现卵孢素具有杀虫活性。尽管卵孢素在医药领域及害虫防治等领域具有广阔的应用前景，但目前仅确定了卵孢素的化学结构，对其合成基因、调控机制及与菌株毒力关系的认识还是空白。目前，卵孢素人工合成的成本较高，还没法进行大规模的生产，因此建立卵孢素的生物合成途径及调控机制可为生物发酵生产卵孢素奠定基础。
卵孢素已证实具有杀虫、抗菌及抗病毒活性，在害虫防治、植物抗病及医药卫生领域具有广阔的应用前景，但利用人工合成的方法获得卵孢素成本较高。目前关于真菌中卵孢素的生物合成途径及调控机制还不清楚，也没有通过基因工程手段获得高产卵孢素菌株的报道，因此利用真菌发酵法获得卵孢素的得率较低。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一个球孢白僵菌的C2H2型锌指蛋白基因BbAzf，解决人工合成成本较高，不能进行大规模的生产的问题。
本发明还提供所述C2H2型锌指蛋白基因BbAzf的基因敲除载体。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现：
一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf，其特征在于，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。
进一步，本发明还提供一种球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体，其特征在于，通过破坏BbAzf基因以提高球孢白僵菌中卵孢素的产量，获得BbAzf的球孢白僵菌基因敲除子；
破坏该基因的方法，包括如下步骤：
1）以球孢白僵菌基因组作模板扩增得到BbAzf基因的左臂BbAzfL和右臂BbAzfR，亚克隆到pGEM-T上，获得pGEM-BbAzfL和pGEM-BbAzfR；
2）分别用XbaI/HindIII酶切pGEM-BbAzfR，EcoRI酶切pGEM-BbAzfL，回收BbAzfR和BbAzfL片段，分别构建进pK2-bar载体，得pK2-BbAzfL-bar-BbAzfR；
3）将pK2-BbAzfL-bar-BbAzfR转入根癌农杆菌LBA4404后，利用根癌农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化，并经PCR筛选获得基因敲除子。
进一步，所述球孢白僵菌基因敲除子，应用于治疗农林害虫的真菌杀虫剂。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明利用基因敲除技术破坏掉白僵菌中的一个锌指蛋白基因BbAzf，突变菌株大量产生卵孢素，对昆虫表现出较高的毒力。该球孢白僵菌的BbAzf敲除突变体，该突变体可在1/2SDB培养基上产生卵孢素。该突变体，即产卵孢素的菌株，较野生型菌株具有更高的杀虫活性，可有效提高球孢白僵菌的防治效果。
本发明提供的C2H2型锌指蛋白基因BbAzf，该基因编码的蛋白具有四个C2H2结构域，并具有一个推测的核定位信号KPKKKWC。
本发明C2H2型锌指蛋白基因BbAzf可进行BbAzf基因破坏的敲除载体，含有BbAzf上游552bp的序列和下游752bp的序列，并含有抗除草剂的Bar基因。
附图说明
图1：实时定量PCR检测BbAzf在球孢白僵菌不同发育阶段的表达情况；
利用Real-Time PCR检测球孢白僵菌野生型菌株在土豆固体培养基（PDA）培养基上培养5-20天，察氏培养基（CZM），土豆液体培养基（PDB）以及1/2沙氏液体培养基上培3d后BbAzf的表达情况。
图2BbAzf同源重组表达载体构建策略；
ORF：BbAzf基因的开放阅读框，箭头表示为ORF方向；Bar：草丁膦除草剂（phosphinothricin）抗性基因；PtrpC：来源于构巢曲霉的真菌组成性启动子；TtrpC：构巢曲霉色氨酸合成酶基因的终止子；BbAzfL：BbAzf基因5′侧翼序列；BbAzfR：BbAzf基因3′侧翼序列；A和B之间的“X”表示交换。
图3BbAzf同源重组载体图；
Bar：草丁膦除草剂phosphinothricin抗性基因；PtrpC：来源于构巢曲霉的真菌组成性启动子；TtrpC：构巢曲霉色氨酸合成酶基因的终止子；AzfL：BbAzf基因5′侧翼序列；AzfR：BbAzf基因3′侧翼序列；KanR，卡那霉素抗性基因。
图4PCR扩增BbAzf基因敲除子；
ER137，ER276：异源重组转化子；⊿BbAzf为基因破坏突变体⊿BbAzf212，⊿BbAzf228和⊿BbAzf394；Vec：质粒pK2-BbAzfL-bar-BbAzfR；WT：球孢白僵菌野生菌株Bb0062；M15：DNA marker15（MBI）。
图5各菌株在1/2SDB培养基中颜色变化情况；
WT，球孢白僵菌野生型菌株；1-3，BbAzf同源重组菌株，同源重组菌株△BbAzf228，△BbAzf212、△BbAzf394。各菌株在液体1/2SDB培养基中培养72h。
图6突变体产红色色素的HPLC分析；
层析柱为C18柱（5μm，2.1×150mm，ZORBAX，SB-C18，Agilent），流动相A为0.01％乙酸，B为乙腈。流速0.2ml/min，30％B，时间6min。A，人工合成的卵孢素；B，从BbAzf基因敲除菌株中纯化的红色色素。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
本发明所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
一.BbAzf基因的克隆及表达分析
【实施例1】
从球孢白僵菌中克隆了一个具C2H2结构域的锌指蛋白，核苷酸序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
该序列编码的氨基酸与已知真菌的C2H2型锌指蛋白(Asparagine-rich Zinc Finger protein)有33-40%的同源性。因此，推测该基因是球孢白僵菌中一个新的C2H2型锌指蛋白转录因子，将其命名为BbAzf。利用实时定量PCR分子Bbazf真菌发育不同阶段的表达情况。RNA提取试剂盒为BIO-RAD公司的AurumTM total RNA mini kit，cDNA合成试剂盒是MBI Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit。球孢白僵菌的actin为内标，引物序列为Pact-1:GTCAAGTCATCACCATTGGC和Pact-2:GAGGAGCAATGATCTTGACC。用于Bbazf实时定量PCR检测的引物序列为Pazfrt-1:CAGCTTGGCAATATGAAGAC和Pazfrt-2：AACATGGGGTAACGGCTGCTG。
实时定量PCR结果显示（图1），在营养生长和产孢等不同发育阶段，BbAzf基因的转录水平存在显著差异。在土豆培养基上培养5d后Bbazf表达量最高，而后随着培养时间的进一步的延长，表达量则逐步下降。该表达模式与真菌孢子的形成具有一致性，分生孢子在5d时开始形成，而培养两周后已完全产孢。
二、BbAzf同源重组载体的构建及转化
【实施例2】
为了分析BbAzf的功能，在BbAzf基因的核苷酸序列的上下游分别选取了部分序列（AzfL552bp和AzfR752bp）作为同源重组时的置换片段。扩增BbAzfL片段的引物为PHrL-up和PHrL-down（PHrL-up：ACTCGAATTCCTCGAGACTCAAAGAGCTCTTGGTGC，EcoRI和XhoI；PHrL-down：ATGCGAATTCAAAGTCTCTCCATGAGATGC，EcoRI），扩增BbAzfR片段的引物为（PHrR-up：ATGCTCTAGATGCTCATGGGAGCAAGAC，XbaI；PHrR-down：ACTGAAGCTTACTAGTAAGAGGGTCACTCTTGAC，SpeI，HindIII）扩增体系为：10×Ex Taq PCR Buffer（含Mg2+）2μl，10mmol/L dNTP2μl，5μmol/L引物1μl，基因组DNA模板1μl，Ex Taq DNA聚合酶5U/μl0.2μl，加水至20μl体系。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，30s；循环30次；72℃延伸10min。
（一）主要构建流程如下：
1）以球孢白僵菌基因组作模板扩增得到BbAzfL和BbAzfR，亚克隆到pGEM-T上，获得pGEM-BbAzfL和pGEM-BbAzfR；
2）用XbaI和HindIII酶切pGEM-BbAzfR，回收BbAzfR片段，构建进相同酶消化的pK2-bar，得pK2-bar-BbAzfR；
3）载体pK2-BbAzfR-bar用EcoRI切成线性片段并经磷酸化处理后，回收线性片段；EcoRI酶切pGEM-BbAzfL得BbAzfL片段，并克隆进pK2-bar-BbAzfR，得pK2-BbAzfL-bar-BbAzfR。用XhoI和BamHI酶切验证连接方向，切下1.7kb的片段为正向连接，切下950bp的片段为反向连接。
基因敲除构建策略如图2所示，构建载体如图3所示。
（二）农杆菌转化方法如下：
1、取农杆菌感受态细胞置于冰浴中，将约5-50ng的质粒DNA加入到冰浴解冻的细胞悬液中，轻轻混匀后冰上放置5min；
2、将该细胞悬液转至冰预冷的电击杯中，将其置于电转化仪（Bio-Rad）脉冲12ms后立即加入1ml预冷的YEB培养基；
3、将细胞悬液转至1.5ml离心管中，28℃、180r/min摇床培养3h后，5000r/min离心5min，弃上清液，留下约100μl的液体重悬菌体，混匀后均匀涂布于YEB固体培养基（含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素）中，28℃倒置培养2d，获得含有载体pk2-BbAzfL-bar-BbAzfR的农杆菌菌株。
三、同源重组转化子的筛选
【实施例3】
以野生型球孢白僵菌为转化受体，参照Fang等人的方法（Fang et al，2004），利用根癌农杆菌介导的遗传转化法进行转化，所用培养基及具体转化方法如下：
（一）转化过程中所用的培养基：
2.5×MM盐溶液（1L）：KH2PO43.625g，K2HPO45.125g，NaCl0.375g，MgSO4.7H2O1.250g，CaCl2.2H2O0.165g，FeSO4.7H2O0.0062g，(NH4)2SO41.250g。各药品分开溶解，定容后无需高压灭菌，室温储存。
IM培养基（1L）：400ml2.5×MM盐溶液，5ml Glycerol，8.5g MES。调pH至5.3，121℃灭菌15min。
M-100微量元素母液（500ml）：MnCl2.4H2O30mg，ZnCl2200mg，H3BO370mg，FeCl3.6H2O50mg，Na2MoO4.2H2O20mg，CuSO4.5H2O200mg。
M-100盐母液（1L）：KCl8g，KH2PO416g，MgSO4.7H2O2g，NaSO44g，CaCl21g，M-100微量元素母液8ml，定容后4℃保存。
M-100培养基（1L）：Glucose10g，KNO33g，M-100盐母液62.5ml，定容到1L，调pH至7.0，高压灭菌。
将含有质粒载体的根癌农杆菌单菌落接种到YEB液体培养基中（含50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素），28℃、200rpm摇床过夜培养（16～20h）。取3ml菌液6000rpm、10min离心，弃上清液，用等量的IM液体培养基（含有200μM乙酰丁香酮和10mM Glucose）重悬菌体，并调整浓度至OD660为0.15，然后于28℃，180rpm摇床培养6h。在此期间先将微孔滤膜平铺于IM固体培养基上，用Tween80（0.5%v/v）配制浓度为2×104个/ml的孢悬液。将上述孢悬液和预培养后的农杆菌菌液等体积混均后，取100μl菌液涂布于IM固体培养基平板上的微孔滤膜上（上海半岛实业有限公司），22℃共培养48h。将共培养之后的微孔滤膜转至一筛培养基M-100+60μg/ml草丁膦除草剂上继续筛选，26℃培养大约5d直到有抗性菌落出现。将抗性菌落再次转移至筛选培养基M-100+ppt（60μg/ml）上进行二次筛选。26℃培养5-7d后，获得抗性菌落。
将上述抗性菌落进行PCR验证，引物为120yzR1（5′-ACTTGTGCCTCGTGCTTGC-3′）和120yzL1(5′-AATCGTTTTGGCGTTGGC-3′）。基因敲除转化子将扩出3kb的片段，而野生型将扩出1.7kb片段，异源转化子能扩出1.7kb和3kb两条片断。PCR扩增体系：10×ExTaq PCR Buffer（含Mg2+）2μl，5mmol/l dNTP2μl，引物120yzL11μl，引物120yzR11μl，DNA模板1μl（50ng），Ex Taq DNA聚合酶5U0.2μl，加水至20μl体系。扩增的程序：94℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃3min循环32次，72℃延伸10min。扩增结果如图4所示，筛选获得了3个基因敲除突变体，⊿BbAzf212，⊿BbAzf228和⊿BbAzf394。表型观察发现，Bbzf基因敲除子在1/2SDB（Sabouraud Dextrose Broth，BD，USA）液体培养基中培养2天后，培养液呈红色（图5）。
四、红色素的提取及鉴定
【实施例4】
参照Mao等（2010）的方法提取色素，稍有变动，具体方法如下：将野生型菌株，基因破坏突变体，分别接种于1/2SDB培养基中26℃摇床培养。三天后，10000rpm，10min离心收集发酵液，加入等量的乙酸乙酯抽提。将乙酸乙酯相转移至1.5ml离心管中，真空浓缩至粉末。用三氯甲烷重新溶解样品，室温放置2min，加入（甲醇：水=1：1）的混合液，混匀后10000rpm，离心5min。取上清液加入2-3倍体积乙酸乙酯使至饱和，混匀后置于4℃冰箱直至红色晶体析出。将色素的甲醇溶液样品通过HPLC/MS分析，确定收集样品的化学成分。色谱条件为：色谱柱为C18（5μm，2.1×150mm，ZORBAX，SB-C18，Agilent）；由AB两相系统组成，其中A为0.01%乙酸，B为乙腈。洗脱条件30％B，时间6min，流速为0.2ml/min，检测波长为287nm，进样量2μl。HPLC结果如图6所示，纯化红色素与人工合成的卵孢素有相同的保留时间。质谱结果显示：红色色素与卵孢素在阴离子模式（NEG ION Mode）下的m/z(rel.int)为305.0[M-H]，阳离子模式未检测到峰，可见该化合物的分子量为306，与预期的卵孢素分子量完全一致。
五、生物测定
【实施例5】
供试试虫为采集于野外的3龄菜青虫。用0.05%（v/v）无菌Tween-80收集培养了20d左右的野生型菌株，同源重组菌株△BbAzf228、△BbAzf394的新鲜孢子，充分涡旋分散孢子后用四层擦镜纸过滤，调节孢子浓度为2×107个孢子/ml。将试虫浸泡于孢子悬浮液中30s，接种后用吸水纸吸去多余水分，用甘蓝叶饲养，于26℃培养。每天清理3次，每间隔12h统计其死亡率。每个菌株重复3次，每次重复30头菜青虫。同时用无菌的0.05%（v/v）Tween-80作为阴性对照。结果显示，接种BbAzf突变体后48h，约88%的菜青虫死亡，而接种了野生型菌株的虫子没有出现感染现象。在60h后，被BbAzf突变体感染的死亡率达90%，而被野生型球孢白僵菌菌株感染的菜青虫死亡率仅为42%。由此推断，破坏BbAzf可增加球孢白僵菌对昆虫的致病力。体外分析显示，将卵孢素注射入菜青虫体内48h后，约50%的试虫死亡，虫体变软、发黑，部分死尸体壁呈现出红色。这表明卵孢素与菌株毒力相关。
<110> 西南大学
<120> 一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体
<130> 1
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 1473
<212> DNA
<213> 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）
<220>
<223> SEQIDNO.1核苷酸序列
<400> 1
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<211> 481
<212> PRT
<213> 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）
<220>
<223> SEQIDNO.2所示的氨基酸序列
<400> 2
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Claims (2)
1.一种球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体，其特征在于，通过破坏BbAzf基因以提高球孢白僵菌中卵孢素的产量，获得BbAzf的球孢白僵菌基因敲除子；所述球孢白僵菌BbAzf具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列；
破坏该基因的方法，包括如下步骤：
1）以球孢白僵菌基因组作模板扩增得到BbAzf基因的左臂BbAzfL和右臂BbAzfR，亚克隆到pGEM-T上，获得pGEM-BbAzfL和pGEM-BbAzfR；
2）分别用XbaI/HindIII酶切pGEM-BbAzfR，EcoRI酶切pGEM-BbAzfL，回收BbAzfR和BbAzfL片段，分别构建进pk2-bar载体，得pk2-BbAzfL-bar-BbAzfR；
3）将pk2-BbAzfL-bar-BbAzfR转入根癌农杆菌LBA4404后，利用根癌农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化，并经PCR筛选获得基因敲除子；
其中，载体pK2-BbAzfR-bar用EcoRI切成线性片段并经磷酸化处理后，回收线性片段；EcoRI酶切pGEM-BbAzfL得BbAzfL片段，并克隆进pK2-bar-BbAzfR，得pK2-BbAzfL-bar-BbAzfR；
含有BbAzf上游552bp的序列和下游752bp的序列，并含有抗除草剂的Bar基因。
2.如权利要求1所述球孢白僵菌基因敲除子，应用于治疗农林害虫的真菌杀虫剂。
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