CN103421060A - 氨基苷类化合物柱后衍生制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽药残留分析技术领域，公开了一种氨基苷类化合物与邻苯二甲醛柱后衍生化反应检测分析方法。氨基苷类化合物与邻苯二甲醛发生反应，形成荧光试剂，具有独特的激发波长和发射波长。对该反应的条件进行优化选择，结果表明，在碱性条件下，氨基苷类化合物与邻苯二甲醛极易发生快速反应，适合柱后衍生。衍生产物在λex＝235nm、λem＝465nm时具有最大的荧光强度。最小检出量为10μg/L，结果重现性良好，4个浓度，5次单独重复的变异系数小于15％。本发明各项指标均能满足氨基苷类抗生素残留量分析对检测水平的要求，灵敏度有较大的提高。
Description
技术领域
本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及氨基苷类化合物柱后衍生制备方法及应用，本发明的方法可用于氨基苷类抗生素在可食性动物产品中的残留分析。
背景技术
氨基苷类是临床上常用的一类抗生素，其基本结构是由苷元和氨基糖分子通过氧桥连接而成，包括庆大霉素、链霉素、双氢链霉素、卡那霉素、壮观霉素、新霉素及人工合成的妥布霉素、阿米卡星、奈替米星等。氨基苷类抗生素作用机理是影响蛋白质生物合成的多个环节阻止蛋白质的合成。氨基苷类抗生素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有作用，对革兰氏阴性菌作用较强。在兽医临床上主要用于金葡菌、大肠杆菌、放线杆菌、变形杆菌所致的各种感染，如呼吸道感染、肺炎、胆道感染、化脓性腹膜炎、尿路感染等；庆大霉素还可局部应用于烧伤感染和皮肤感染等。随着畜牧业的发展，氨基苷类抗生素在畜牧业中的应用越来越广泛，在动物体内的残留问题也日益严重。氨基苷类抗生素及其残留对人、畜均有明显的毒副作用：链霉素、庆大霉素、卡那霉素等的主要毒性反应为第八对脑神经的损害，引起耳鸣，头昏，眩晕等，若用量较大可致听力减退，重听，甚至有耳聋的可能。庆大霉素还有肾脏损害，心肌损伤，过敏反应等，这些虽然较少见但是也是一个不可忽略的危害。链霉素还有潜在的致畸作用等。因此开展以完善这类药物残留检测工作，满足残留监控计划和食品、质检领域的需要，具有很重要的意义。由于氨基苷类抗生素化学结构复杂，没有特定的紫外吸收，须通过衍生转化才能分析检测。国外大部分采用柱前衍生或柱后衍生荧光检测的方法。目前没有动物源食品中氨基苷类抗生素检测的行业标准，因此非常有必要建立动物源食品中氨基苷类抗生素检测的行业标准。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种氨基苷类化合物柱后衍生制备方法及应用，本发明的方法可用于氨基苷类抗生素在可食性动物产品中的残留分析。本发明克服了液相法柱前反应检测不易找到合适的流动相及反应过程中难以控制的缺陷，通过柱后衍生化有效的提高了高效液相色谱和荧光检测这类药物残留的灵敏度以及扩大了检测的适用范围。本发明的主要技术路线是在碱性条件下，首先通过高效液相色谱将衍生化试剂邻苯二甲醛进行分离后，再以邻苯二甲醛为衍生化试剂，与氨基苷类化合物进行柱后衍生化反应，利用荧光检测器进行检测表明：氨基苷类化合物与邻苯二甲醛反应产物的荧光强度高，即该方法灵敏度高。
实现本发明的具体技术方案如下所示：
本发明方法所述的衍生化试剂为邻苯二甲醛，该物质与氨基苷类化合物发生衍生化反应具有反应快速，反应产物荧光活性高等特点。在反应器的反应温度为45℃时，反应即刻完成，衍生物在λex＝235nm、λem＝465nm时具有最大的荧光强度。衍生化反应的具体条件为：衍生化反应体系中衍生化试剂为邻苯二甲醛；反应体系最佳pH值为10～11；衍生化试剂邻苯二甲醛的流速为0.3mL/min。衍生化反应的方程式如下：
式中，R为氨基苷类化合物的取代基。
本发明克服了液相法柱前反应检测不易找到合适的流动相及反应过程中难以控制的缺陷，通过柱后衍生化有效的提高了高效液相色谱和荧光检测这类药物残留的灵敏度以及扩大了检测的适用范围。
附图说明
图1：氨基苷类药物(卡那霉素、安普霉素、庆大霉素浓度为100μg/L，新霉素浓度为500μg/L)标准溶液衍生物色谱图。
图2：牛奶样品空白色谱图。
图3：牛奶添加氨基苷类药物(卡那霉素、安普霉素、庆大霉素浓度为20μg/L，新霉素浓度为100μg/L)衍生物色谱图。
具体实施方式
实施例1：
本实施例首先建立氨基苷类化合物标样高效液相色谱(HPLC)分离检测方法，然后确立与邻苯二甲醛进行衍生化反应的条件，最后对样本进行分析检测。
具体步骤如下：
1、氨基苷类化合物的净化处理
用磷酸缓冲液(称取氯化钠8.50g，磷酸氢二钠3.58g，磷酸二氢钠3.12g，加水溶解并稀释至1000mL)和10％三氯乙酸溶液提取，C18SPE柱净化，甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴氮气吹干，用水1.0mL溶解，并转入1.5mL聚丙烯离心管，10000r/min离心10min，取上清液供高效液相色谱分析。
2、氨基苷类化合物提取物HPLC测定以及柱后衍生
色谱柱：阳离子交换柱(Cation-exchange)4mm×150mm离子交换柱。
流动相：A相磷酸氢二甲缓冲水溶液(0.1M)，B相氢氧化钾水溶液(0.1M)，C相氢氧化钾水溶液(0.1M)
梯度洗脱程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
其他技术条件：
流速：1mL/min；
检测波长：EX：235nm，Em：465nm；
进样量：50μL；
柱温：30℃；
反应器温度：45℃；
衍生液流速：0.3mL/min
3、氨基苷类化合物的标准工作曲线制备
(1)安普霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素的标准工作曲线制备
准确量取安普霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素标准贮备液适量，用磷酸缓冲液溶解并定容，制得卡那霉素、庆大霉素、新霉素和安普霉素浓度为100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L、10000μg/L的混合标准工作液。取标准工作液作高效液相色谱检测分析。
(2)安普霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素HPLC测定以及柱后衍生
按如下HPLC检测条件进行分析测定：色谱柱：阳离子交换柱(Cation-exchange)4mm×150mm离子交换柱。
流动相：A相磷酸氢二甲缓冲水溶液(0.1M)，B相氢氧化钾水溶液(0.1M)，C相氢氧化钾水溶液(0.1M)
(3)安普霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素标准溶液衍生产物检测结果
在仪器最佳工作条件下，对氨基苷类化合物的混合标准溶液分别进样，做单点或多点校准，以峰面积积分值定量，标准工作液中氨基苷类的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，在上述色谱条件下，标准溶液的液相色谱图见图1。
其中安普霉素、卡那霉素、新霉素和庆大霉素各药物的线性方程和线性相关系数见表2，各药物的线性范围为0.1～10μg/mL，相关系数R＞0.999。
表2 氨基苷类药物的标准曲线方程
本发明在牛奶中卡那霉素、安普霉素和庆大霉素检测限为10μg/L，定量限为20μg/L，新霉素的检测限为25μg/L，定量限为100μg/L。四种药物在牛奶中的最低检测限均低于相应的最大残留限量。表明本发明的分析方法和仪器条件合理可行。
实施例2：样本的测定
(1)样本的提取
选择猪肾脏、猪肌肉，牛肾脏和牛肌肉，鸡肌肉以及牛奶为试验样本，并对安普霉素、卡那霉素、新霉素和庆大霉素单个或多个进行残留的检测。牛奶中添加卡那霉素、安普霉素、庆大霉素的浓度分别依次为20μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L四个添加浓度，新霉素的浓度依次为100μg/L、500μg/L、1000μg/L和2000μg/L四个添加浓度；在猪肾脏、牛肾脏、猪肌肉、牛肌肉和鸡肌肉中添加庆大霉素的浓度依次为50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg三个添加浓度，分别设一个空白样本，每个浓度重复5次，并进行5次单独试验用常用的外标法计算回收率和变异系数
样本用磷酸缓冲液(配方同上)10％三氯乙酸溶液提取，C18SPE柱净化，甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃水浴氮气吹干，用水1.0mL溶解，并和转入1.5mL聚丙烯离心管，10000r/min离心10min，取上清液供高效液相色谱分析。
(2)样本提取物HPLC测定以及柱后衍生
高效液相色谱柱后衍生，荧光检测器，分析条件为：色谱柱阳离子交换柱(Cation-exchange)4mm×150mm离子交换柱。
流动相：A相磷酸氢二甲缓冲水溶液(0.1M)，B相氢氧化钾水溶液(0.1M)，C相氢氧化钾水溶液(0.1M)
梯度洗脱程序如实施例的表1。
其他技术条件：
流速：1mL/min；
检测波长：EX：235nm，Em：465nm；
进样量：50μL；
柱温：30℃；
反应器温度：45℃
衍生液流速：0.3mL/min；
(3)检测结果分析
经分析可知，本发明的分析方法在牛奶中卡那霉素、庆大霉素和安普霉素添加浓度为20μg/L～100μg/L的回收率为70.0％～110.0％；新霉素添加浓度为100μg/L～1000μg/L的回收率为80.0％～110.0％；在猪肾脏、牛肾脏中庆大霉素添加浓度为50μg/L～100μg/L的回收率为70％～110％，添加浓度为100μg/L～2500μg/L的回收率为80％～110％；猪、牛、鸡肌肉中庆大霉素添加浓度为50μg/L～200μg/L的回收率为70％～110％；在牛奶中庆大霉素添加浓度为50μg/L～200μg/L的回收率为70％～110％。本发明的分析方法在牛奶中的批间变异系数均在10.5％以内；猪肾脏、牛肾脏中的批间变异系数均在11.3％以内；猪肌肉、牛肌肉和鸡肌肉中的批间变异系数均在12.4％以内。本发明在牛奶中卡那霉素、安普霉素和庆大霉素检测限为10μg/L，定量限为20μg/L，新霉素的检测限为25μg/L，定量限为100μg/L；在肌肉、肾脏组织中庆大霉素的定量限为50μg/L。
以上实施结果说明，采用氨基苷类化合物与邻苯二甲醛高效液相色谱(HPLC)柱后衍生化反应检测分析方法测定的猪肾脏、肌肉，牛肾脏和肌肉，鸡肌肉以及牛奶中安普霉素、卡那霉素、新霉素和庆大霉素的添加回收率和变异系数均能满足上述药物残留量分析对检测水平的要求，灵敏度有较大的提高。同时柱后衍生化反应操作简便，反应速度快，能大大提高工作效率。
Claims (1)
1.一种氨基苷类化合物与邻苯二甲醛柱后衍生制备方法，其特征在于：在碱性条件下，首先将衍生化试剂邻苯二甲醛通过高效液相色谱进行分离后，再以邻苯二甲醛为衍生化试剂，与氨基苷类化合物进行衍生化反应，然后通过荧光检测器进行检测，所述的衍生化反应方程式如下：
式中，R为氨基苷类化合物的取代基；
衍生化反应的pH值为10～11；反应器的反应温度为45℃；衍生化试剂的流速为0.3mL/min；
高效液相色谱分离中的色谱柱为阳离子交换柱4mm×150mm的离子交换柱；流动相A相为0.1M的磷酸氢二甲缓冲水溶液，流动相B相为0.1M的氢氧化钾水溶液，流动相C相为0.1M的氢氧化钾水溶液；流动相流速1mL/min；荧光检测器激发波长235nm，发射波长465nm。
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