CN103413751B - 一种在离子阱质量分析器中进行的串级质谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于质谱分析技术领域，具体为一种在离子阱质量分析器中进行的串级质谱分析方法。该方法具体包括离子选择性隔离、碰撞诱导解离和质量扫描分析三个阶段。本发明在碰撞诱导解离阶段，通过改变射频信号的周期大小，即通过改变加载在离子阱上的射频电压的频率，使得具有一定质荷比的母体离子被共振激发而获得能量，这些被共振激发的高能量离子与离子阱中的中性分子发生碰撞而发生解离，生成产物离子，以实现串级质谱分析。该方法的优点在于,它仅通过软件设置改变碰撞诱导解离阶段的扫描周期即可实现碰撞诱导解离，可以显著简化串级质谱分析的实验装置和方法。

Description

一种在离子阱质量分析器中进行的串级质谱分析方法

技术领域

本发明属于质谱分析技术领域，具体涉及一种在离子阱质量分析器中实现串级质谱分析的方法。

背景技术

质谱作为一种强大的分析技术，可以实现对化合物的定性、定量分析，广泛的应用于药物分析、环境监测、国家安全、法医、蛋白质组学等领域。众所周知，质谱仪可以通过串级质谱（Tandem MS）分析对化合物的的结构进行表征和分析。串级质谱的分析过程具体为：第一阶段为隔离，对于待分析的样品中的离子，选定某一特定质荷比（m/z）的离子将其隔离，被隔离的离子成为母离子（parent ion）；第二阶段为碰撞诱导解离（CollisionInduced Dissociation，简称CID），母离子与中性的气体分子例如氦气、氩气、氮气等发生碰撞，碰撞产生的能量沉积到母离子上，导致母离子自身内能增加，最终母离子发生碎裂，得到碎片离子；第三阶段，碎片离子进行质量分析，得到碎片离子的质谱峰，MS/MS分析完成。如碎片离子中选定某一特定质荷比的离子隔离，将其作为母离子，继续上述过程，如此往复下去，可以实现多级质谱分析。CID是使用最广泛、研究最透彻的解离技术。

在众多种类的质谱仪中，四极杆质谱仪和四极离子阱质谱仪是公认的最适合实现碰撞诱导解离的装置。其中，四极杆质谱仪又称为四极滤质器，仅能让某一特定质量数的离子通过，故在四极杆中进行串级质谱分析时，需要在空间上将多个四极杆串联，一般采用三段四极杆的组合，即三重四极杆。三重四极杆质谱一般具有较大的体积。四极离子阱（Quadrupole Ion Trap,简称QIT）可以在一个阱中实现离子的隔离、解离、质量分析等步骤，在串级质谱方面具有独特的优势。

离子阱质量分析器的工作原理是通过求解Mathieu二次线性微分方程组，获得具有一定质荷比的离子在电场中的运动状态和结果。Mathieu方程根据带电离子在离子阱内受电场的作用符合牛顿第二定律得到，它描述了离子在四极电场中的运动轨迹及运动结果等。以三维离子阱为例，通过解Mathieu方程（马修方程）得到:

$a=-\frac{16\mathrm{eU}}{m(r_0^2+2z_0^2){\mathrm{\Ω}}^2},$ $q=\frac{8\mathrm{eV}}{m(r_0^2+2z_0^2){\mathrm{\Ω}}^2}$

式中:a是与直流电压成正比的阱参数，q是与射频电压成正比的阱参数，U为离子阱电极上所加直流电压，V为离子阱电极上所加射频电压，Ω为射频电压的频率，r₀为环电极半径，z₀为轴向半径。通过对离子阱电极上施加电场变化，阱内的不同质荷比的离子依次从离子阱内逸出，并被探测到。在离子阱内运动的离子被称为稳定的，即位于稳定区内。被逐出离子阱的离子被称为不稳定的，即离子位于稳定区外。按稳定图分析，离子阱进行质量分析时，不同质荷比的离子，在具有时序变化的电场作用下，依次运动到稳定区外，即从离子阱中弹出并被安装在阱外的离子探测器接受到，完成质量分析。

经过近二十多年的发展，共振激发（resonance excitation）技术已经成为离子阱上普遍采用的离子弹出和解离的方法。通常共振激发是通过在离子阱中用于离子弹出的方向上的一对电极上，施加一个辅助的交流电压（AC），也称为偶极激发电压（dipolarexcitation voltage）实现的，该电压具有特定的频率和幅度，且一对电极上的电压幅度、频率相同，相位相差180度。束缚在离子阱中的离子，在射频电压的作用下的运动具有一个久期频率（secular frequency，ω），不同质荷比的离子具有不同的久期频率。久期频率与射频电压的频率（Ω）之间存在如下关系：

$\mathrm{\ω}=\frac{\mathrm{\β}}{2}\mathrm{\Ω}$

β为系数，也是离子阱稳定图中的一参数，将两者相关联。当偶极激发电压的频率与某一特定质荷比的离子的久期频率相同时，该离子发生共振，其在偶极激发电压施加的方向上运动加剧，最终离子从电极上的小孔或狭缝中弹出，被离子探测器收集。当偶极激发电压的频率与某一特定质荷比的离子的久期频率相偏离时，此时仍然会有共振发生，但幅度显著降低，使得离子不足以弹出，此时离子进行的低幅度共振导致离子与阱中中性气体分子的碰撞加剧，完成碰撞诱导解离。偶极激发电压的频率、幅度和持续的时间均会对碰撞诱导解离的结果产生影响。共振激发的技术虽然可以获得较高的碎裂效率，但是仍存在弊端和不足。原因在于，只有某一固定质荷比的离子会发生共振，该离子碎裂后得到的碎片离子的质荷比均发生变化，变大或变小，此时碎片离子的久期频率与AC的频率不同，不会发生共振，即不会进一步的解离，最终得到的串级质谱图中的碎片信息收到限制。

在非专利文献1和非专利文献2中介绍了一种实现串级质谱的方法，即采用偶极直流电压施加在一对电极上。当某一特定质荷比的离子被隔离后，此时偶极直流电压施加，该离子在直流电压的作用下，偏离阱的中心，运动速率加快，同时射频电压还对该离子具有一定的加热效应。最终导致离子的内能显著提高，最终发生解离。由于偶极直流电压碰撞诱导解离不采用共振的方式，对离子的质荷比没有限定，故即使母离子碎裂，子离子仍然会进一步在偶极直流的作用下解离，最终得到的串级质谱图中碎片峰的信息会更加丰富，偶极直流电压驱动的碰撞诱导解离与传统的共振激发方法不同，是一种非共振激发的方法，能够得到更丰富的碎片离子信息，是目前解离方法的一个重要创新。但是，该方法要求必须有一个额外的直流电源用于提供直流电压，通过电路的改造实现偶极直流施加的方式，同时偶极直流电压具有时序变化并且需要精确控制，故对仪器的硬件部分的要求必将变得更加严苛和复杂。

非专利文献1：B.M.Prentice,W.Xu,Z.Ouyang,S.A.McLuckey,DC potentialsapplied to an end-cap electrode of a3D ion trap for enhanced MSnfunctionality.International Journal of Mass Spectrometry2011,306,114-122.

非专利文献2：B.M.Prentice,S.A.McLuckey,Dipolar DC CollisionalActivation in a"Stretched"3-D Ion Trap:The Effect of Higher Order Fields onrf-Heating.Journal of the American Society for Mass Spectrometry2012,23,736-744.

发明内容

本发明的目的是提出一种可以显著简化实验装置和实验流程的串级质谱分析方法。

离子阱的驱动电压主要是射频电压（radio frequency，简称RF）。目前，驱动离子阱的射频电压可以有两种类型，一种是传统的正弦波驱动，另一种是数字方波驱动。本发明提出的方法在两种工作模式下均适用。

下文以数字方波为例进行说明。在数字方波驱动的离子阱中，用于束缚离子的方波的幅值一般为几百伏，且为一定值。离子阱工作时，通过方波频率的扫描，实现离子的共振弹出。用于离子共振激发的偶极激发方波同束缚方波一样，均由相同的方式产生和控制，但是其幅值较低一般在10伏以内，其频率与束缚方波保持一固定的比例关系。束缚方波和用于离子弹出的偶极激发方波的波形均为对称波形，即具有50%的占空比。

使用与马修方程中类似的参数（a，q）来描述离子在数字化方波离子阱中的稳定情况。当一个质量为m、电荷为e的离子在纯四极场中运动时，参数（a，q）可表示为：

$a_z=\frac{8\mathrm{eU}}{m{r}_0^2{\mathrm{\Ω}}^2},$ $q_z=\frac{4\mathrm{eV}}{m{r}_0^2{\mathrm{\Ω}}^2}---\left(1\right)$

其中，r₀是离子阱的场半径，U是矩形方波的直流分量，V是矩形方波的交流分量，Ω是矩形波的频率。本发明实验过程中矩形方波的占空比均为50%(方波)，且不含直流分量，因此U=0，V等于方波高电平和低电平的差值的一半(半峰值)。数字离子阱参数主要是q_z值，其表达式如下：

$q_z=\frac{{\mathrm{eVT}}_{\mathrm{RWF}}^2}{m{r}_0^2{\mathrm{\π}}^2}---\left(2\right)$

其中T_RWF为数字矩形方波（束缚电压）的周期，离子弹出时的q_z值主要受到数字矩形方波的周期的影响。当束缚方波电压幅值V固定不变时，改变方波的周期可实现不同q_z值。

在数字化离子阱中，质量分析是通过对方波信号的频率进行扫描而实现的，为保证所有的离子都在同一个q_z值上被共振激发出离子阱外，共振激发信号的频率也随着方波信号的频率一起扫描。共振激发信号可由方波信号的分频产生，若分频数为n，则共振激发信号的频率ω_exc为：

ω_exc=Ω/n (3)

离子的共振频率(secular frequency)ω_s与数字束缚电压信号频率Ω之间的关系可以用参数β_z来表示：

ω_s=β_zΩ/2 (4)

当数字束缚电压信号为方波时，β_z与q_z存在下述关系：

${\mathrm{\β}}_z=\frac{1}{\mathrm{\π}}\arccos \left[\cos \left(\mathrm{\π}\sqrt{q_z/2}\right)\cosh \left(\mathrm{\π}\sqrt{q_z/2}\right)\right]---\left(5\right)$

当外加的共振激发信号的频率和离子的共振频率相等时，离子发生共振激发现象而被逐出离子阱外，根据式（3）和（4）可得：

β_z=2/n (6)

当分频数n确定时，便可通过式（5）和（6）计算得到离子弹出时的q_z值，记作q_ejection。此时，离子的质荷比可表示为：

$m/e=\frac{V}{q_{\mathrm{ejection}}{r}_0^2{\mathrm{\π}}^2}{T}^2---\left(7\right)$

其中T表示数字束缚电压的周期。

可以看出，当幅度V保持不变时，对数字束缚电压的频率进行线性扫描并不是对质荷比的线性扫描。为实现对质荷比的线性扫描，可实施如下的周期扫描方式：设数字束缚电压的初始周期为T_start，持续N个周期数后，将周期增大一个固定的步长T_step，此时数字束缚电压的周期变为T_start+T_step。然后再持续N个周期数，依此类推。则对于扫描过程中的任意一步i，有：

T_i=T_start+iT_step (8)

$t_i=\underset{j=0}{\overset{i-1}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{NT}}_j+T_{i}N/2=({t_{\mathrm{step}}i}^2/2+T_{\mathrm{start}}i+T_{\mathrm{start}}/2)---\left(9\right)$

其中t_i表示第i步时经过的时间，以第i步的中间时刻(即第i步持续N/2个周期数时)为准。通过式（8）和（9）联立可以消去变量i，得到：

$T_i=\sqrt{{T_{\mathrm{start}}}^2-T_{\mathrm{start}}{T}_{\mathrm{step}}+({2T}_{\mathrm{step}}/N)t_i}---\left(10\right)$

T_i代表离子被逐出离子阱时刻所对应的数字束缚电压的周期。把T_i代入到式（7）中就可以看出，质荷比与时间t_i成线性关系，即实现了对离子质荷比的线性扫描。

无论是数字方波还是正弦波电压用于离子阱中束缚离子，只要采用通过共振激发的方式将离子弹出离子阱时，均需要施加一个偶极激发电压，即一对幅度相同、相位完全相反的交流电压分别施加到离子阱的一对电极上，离子从该电极所在的方向弹出。

鉴于以上理论基础，本发明提供一种在离子阱质量分析器中进行的串级质谱分析方法，依次分为离子选择隔离、碰撞诱导解离和质量扫描分析三阶段，其中：

所述离子选择隔离阶段，被选择的母离子被隔离，被隔离的母离子在离子阱工作电压产生的电场作用下，通过与中性气体分子的碰撞冷却被束缚在离子阱中；

所述碰撞诱导解离阶段，通过改变加载在离子阱电极上的离子激发射频电压信号周期的大小，即通过改变加载在离子阱上的离子激发射频电压的频率，也即改变了离子共振激发的周期，使得具有一定质荷比的离子被具有某一周期或频率的离子激发射频电压共振激发而获得较高的能量；在周期的作用下，母离子获得能量和被激发,被激发的母体离子通过与离子阱中的中性分子发生碰撞并解离，产生碎片离子，碎片离子在离子阱中经过冷却后被束缚，以进行后续的质量分析；

所述质量扫描分析阶段，当离子经碰撞诱导解离过程后,束缚电压幅值不变，周期从小往大的方向进行线性扫描，从而实现对离子质荷比的线性扫描，碎片离子在偶极激发电压的作用下，发生共振激发，最终从离子引出电极的引出孔或引出槽中被逐出，被设置在离子阱外的离子探测器检测获得离子的质谱信号。

所述碰撞诱导解离阶段具体内容进一步描述如下：

在此阶段中，数字束缚射频电压的电压幅度和占空比不变，选定数字束缚射频电压的周期值，且初始周期与终止周期值不变，再选定某个分频数n，即选定离子激发射频电压与数字束缚射频电压两者之间频率关系β值（n=β/2），由于β值的关系，离子共振激发射频电压的周期值也随着改变且占空比不变，随着离子共振激发射频电压的变化，离子之间实现共振运动产生碰撞能量。

本发明中，在所述碰撞诱导解离阶段，选择隔离的母离子被在数字束缚射频工作电压下产生的电场作用下束缚，适量增加通入离子阱内的中性冷却气体，增加碰撞能量。

本发明中，在所述碰撞诱导解离阶段，施加离子激发射频电压信号波形是正弦波电压或者数字方波电压，或者其它波形。

本发明中，在所述碰撞诱导解离阶段，数字束缚射频电压的周期大小,将根据实验需要加以改变和调节。

本发明中，在所述碰撞诱导解离阶段，数字束缚射频电压的频率和幅度为定值。

本发明中，在所述碰撞诱导解离阶段，离子激发射频电压与数字束缚射频电压频率比值为任意值。

本发明中的串级质谱分析方法对离子阱的种类没有要求，可以是三维离子阱、二维线形离子和各种结构的矩形离子阱,可以是离子阱阵列，也可以是场调节离子阱等。

本发明中的串级质谱分析方法，改变偶极激发电压信号周期施加的时间不受限制，可以是几毫秒，也可以是几百毫秒等,其时间长短由实验需要决定。

本发明中的串级质谱分析方法，实现碎片离子的质量分析的方式采用共振激发的方式，质量分析方式不会对串级质谱分析结果产生影响。

本发明方法的优点在于,它仅通过软件的控制改变周期大小即得到离子碰撞能量,从而实现解离，可以显著简化实验装置和实验流程。

附图说明

图1用于驱动离子阱的方波和正弦波的波形示意图。其中，（a）为对称方波的波形示意图，（b）为对称正弦波的波形示意图。

图2为实施例1的仪器实验平台结构示意图。

图中标号：1-离子源；2-导引杆；3-检测器；4-离子阱；5机械泵；6-涡能泵；7-冷却气。

图3为实施例1中采用的离子束缚方波电压和偶极激发方波电压施加方式示意图。

图4为实施例1的实验结果，对母离子的选择性隔离的质谱图，样品采用利血平（m/z=609）。

图5为实施例1的实验结果，通过改变方波电压的周期，产生离子共振碰撞，实现碰撞诱导解离后的质谱图，β值为0.3478，持续时间为40ms；(a)周期为1.450μs；(b)周期为1.460μs；(c)周期为1.465μs；(d)周期为1.470μs。

图6为采用传统的正弦波电压驱动离子阱，偶极激发电压也采用正弦波时的离子束缚电压和偶极激发电压施加方式示意图。

图7为采用数字方波电压驱动线形离子阱，偶极激发电压采用数字方波时的离子束缚电压和偶极激发电压施加方式示意图。

具体实施方式

实施例1

本技术方案采用数字方波电压驱动离子阱，通过改变偶极激发电压的周期实现母离子的碰撞诱导解离，此方案已进行了实验验证，具体内容如下。

该方案中的离子阱选择矩形离子阱进行测试。仪器实验平台如图2所示，本实验室自行设计和加工的电喷雾电离源-矩形离子阱质谱仪器系统（ESI-RIT-MS）。仪器由三级差分真空系统构成，离子阱所在第三级真空腔内真空度可达到3×10^-3Pa。电喷雾电离源产生的离子通过取样锥孔进入二级真空腔，经过一段长度为200毫米的四极离子导引进入矩形离子阱中，完成质量分析。氦气作为冷却气从阱的后端盖电极上的小孔中引入用于离子冷却。试剂：利血平（Reserpine,m/z=175，上海阿拉丁试剂有限公司），配制成5×10^-5M的溶液，溶剂采用甲醇∶水=50∶50，其中含有0.05%的醋酸。

数字直接合成（DDS）的方法产生低电平的方波电压，一般为5V的TTL电平。经过快速开关（switches）和MOSFET场效应管的放大后，得到幅度在0-500V_0-p范围内连续可调的高压方波用作束缚电压。偶极激发电压通过束缚电压的分频得到，即偶极激发电压与束缚电压的频率之间存在一比例关系，系数为β/2，β值小于1。即偶极激发电压信号的周期改变可以通过改变束缚电压信号的周期而实现。方波的周期、扫速、对称性和时序可以通过软件精确控制。矩形离子阱上的方波电压的施加方式如图3所示。一对幅度相同、相位完全相反的方波束缚电压分别施加到离子阱x和y方向的两对电极上。离子从x方向弹出，偶极激发电压与方波束缚电压耦合后施加到一对x方向电极上。

通过进行常规的质量扫描的方法，可以得到一张样品离子的完整谱图。此时偶极激发电压的波形为对称波形，其频率为束缚方波的频率的三分之一，即β值为2/3，幅度为一定值。随着束缚方波的频率扫描，不同质荷比的离子依次到达共振点发生共振，从阱中弹出被离子探测器检测。串级质谱分析从时间上主要分为三个阶段。

串级质谱分析第一阶段，将利血平离子隔离，并通过冷却将其束缚在阱中，此时偶极激发电压不施加。此时在该阶段后直接进行质量扫描，得到的是只有一个609质谱峰的谱图，如图4所示。

串级质谱分析第二阶段，通过改变束缚电压周期从而改变偶极激发电压的周期，同时，该电压的波形为对称波形，占空比为50%，幅度保持不变。β值为小于1的某个值，在偶极激发电压周期变化的作用下，母离子发生解离，得到碎片离子，经过冷却后被束缚。束缚电压信号的周期改变通过软件完成。

串级质谱分析第三阶段，偶极激发电压的波形为对称波形，即占空比等于50%，β值为2/3。碎片离子在偶极激发电压的作用下，发生共振，最终从电极的引出孔或引出槽中弹出被检测，完成串级质谱分析。

初步的实验结果表明，在串级质谱分析的第二阶段，即碰撞诱导解离阶段，β值固定在0.3478，束缚电压信号周期分别为1.450μs、1.460μs、1.465μs、1.470μs时，母离子利血平离子发生了不同程度的碎裂，如图5(a)-5(d)所示。

本发明中，还可采用传统的正弦波电压驱动离子阱，偶极激发电压也采用正弦波，通过改变偶极激发电压周期产生离子共振碰撞能量，实现母离子的碰撞诱导解离。射频电压和偶极激发电压的施加如图6所示。

本发明中，采用具有双曲面电极的离子阱，可以是三维离离子阱也可以是采用双曲面电极的线形离子阱，两者的中心截面结构相同，射频电压和偶极激发电压的施加如图7所示，还可将一对幅度相同、相位完成相反的数字方波电压分别施加到双曲面离子阱的x方向和y方向的两对电极上，通过改变偶极激发电压信号周期，实现母离子的碰撞诱导解离。

Claims (9)

1.一种在离子阱质量分析器中进行的串级质谱分析方法，其特征在于：依次分为离子选择隔离、碰撞诱导解离和质量扫描分析三个阶段；其中：

在所述离子选择隔离阶段，被选择的母离子被隔离，被隔离的母离子在离子阱工作电压产生的电场作用下，通过与中性气体分子的碰撞冷却被束缚在离子阱中；

在所述碰撞诱导解离阶段，通过改变束缚电压的周期改变加载在离子阱电极上的离子激发射频电压信号周期的大小，从而改变了离子共振激发射频电压的周期，使得具有一定质荷比的离子被具有某一周期或频率的离子激发射频电压共振激发而获得较高的能量；被共振激发的离子与离子阱中的中性分子发生碰撞并发生解离产生碎片离子，碎片离子在离子阱中经过冷却后被束缚，以进行后续的质量分析；

在所述质量扫描分析阶段，离子阱中的离子在离子阱电极上加载的偶极激发电压的作用下，发生共振激发，最终从离子引出电极的引出孔或引出槽中被逐出，并被设置在离子阱外的离子探测器检测而获得离子的质谱信号。

2.根据权利要求1所述的串级质谱分析方法，其特征在于：在所述碰撞诱导解离阶段，保持数字束缚射频电压的电压幅度和占空比不变，选定数字束缚射频电压的周期值，且初始周期与终止周期值不变；再选定某个分频数n，即选定离子激发射频电压与数字束缚射频电压两者之间频率关系值，n=/2；由于值的关系，离子共振激发射频电压的周期值也随着改变且占空比不变，随着离子共振激发射频电压的变化，离子之间实现共振运动产生碰撞能量。

3.根据权利要求1所述的串级质谱分析方法，其特征在于：在所述质量扫描分析阶段对离子质荷比进行线性扫描。

4.根据权利要求1所述的串级质谱分析方法，其特征在于：在所述碰撞诱导解离阶段，所施加的离子激发射频电压信号波形是数字方波或者正弦波。

5.根据权利要求2所述的串级质谱分析方法，其特征在于：在所述碰撞诱导解离阶段中，增加通入离子阱内的中性冷却气体。

6.根据权利要求2所述的串级质谱分析方法，其特征在于：所述碰撞诱导解离阶段，数字束缚射频电压的频率和幅度为定值。

7.根据权利要求2所述的串级质谱分析方法，其特征在于：在所述碰撞诱导解离阶段，离子激发射频电压与数字子束缚射频电压频率比值为任意值。

8.根据权利要求1所述的串级质谱分析方法，其特征在于：所述离子阱为三维离子阱，或者二维线形离子阱。

9.根据权利要求1所述的串级质谱分析方法，其特征在于：所述离子阱为离子阱阵列，或者为场调节离子阱。