CN105355537B - 离子阱低质量数截止值串级质谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于质谱分析测试技术领域，具体为离子阱低质量数截止值串级质谱分析方法。包括离子选择隔离、碰撞诱导解离和质量分析三个阶段。在碰撞诱导解离阶段，通过扫描数字方波电源的频率，从低频率向高频率进行线性扫描，并在实施过程中同时加载一定的激发方波电压，实现被分析母体离子的激发和解离，并可以检测到母体离子低质量数碎片离子产物。本发明优点在于不需要改变硬件和设备，通过软件控制即可实现数字方波电源的频率变化,解决了传统离子阱质谱仪在串级质谱过程中低质量数检测的主要难点；还进一步提升离子阱质谱仪的串级质谱解离效率，丰富了碎片离子信息，有助于对母离子结构的分析；从而提高了离子阱质谱仪的性能和应用领域。

Description

离子阱低质量数截止值串级质谱分析方法

技术领域

本发明属于质量分析技术领域，具体涉及一种在离子阱质量分析器中进行的低质量数截止值串级质谱分析的方法，通过线性扫描射频工作电压频率实现离子串级质谱分析过程中产生的低质量数碎片离子的分析方法和技术。

背景技术

质谱仪作为一种可以进行快速、高灵敏化学成分分析的科学分析仪器，其应用领域越来越广泛，已是现代科学研究最广泛的分析技术之一，已应用于生命科学、食品安全、环境检测、国防、制药、化工等领域，其作用越来越重要。众所周知，质谱仪一个重要的特征是串级质谱分析功能，可以通过串级质谱分析对化合物的的结构进行表征和分析。串级质谱的分析过程具体为：第一阶段为离子隔离，对于待分析的样品中的离子，选定某一特定质荷比（m/z）的离子将其选择隔离，被选择隔离的离子称为母离子（parent ion）；第二阶段为碰撞诱导解离（Collision Induced Dissociation，简称CID），母离子与中性的气体分子例如氦气、氩气、氮气等发生碰撞，碰撞过程中产生的能量沉积到母离子上，导致母离子自身内能增加，最终母离子发生解离，得到碎片子离子；第三阶段，碎片离子进行质量分析，得到碎片离子的质谱峰，MS/MS 分析完成。如碎片离子中选定某一特定质荷比的离子隔离，将其作为母离子，继续上述过程，如此往复下去，可以实现多级质谱分析。碰撞诱导解离技术是使用最广泛、研究最透彻的解离技术。

在目前使用的众多种类质谱仪中，四极质谱仪是最常用最适合实现碰撞诱导解离的一种质谱仪。四极质谱仪主要包含四极杆质谱仪和四极离子阱质谱仪，其中，四极杆质谱仪核心关键部件为四极杆质量分析器，又叫四极滤质器，仅能让某一特定质量数的离子通过，故在四极杆中进行串级质谱分析时，需要在空间上将多个四极杆质量分析器串联，一般采用三段四极杆质量分析器的组合，即三重四极杆。一组四极杆质量分析器对离子进行选择，中间一组四极杆质量分析器对已选择的离子进行碰撞诱导解离，得到碎片离子，最后一组四极杆质量分析器对已碰撞诱导解离后的碎片离子进行质量分析，最终得到质谱图。三重四极杆质谱仪一般具有较大的体积。而四极离子阱质谱仪（Quadrupole Ion Trap, 简称QIT）可以在一个离子阱质量分析器中实现离子的隔离、解离、质量分析等步骤，是目前唯一一个可以在单质量分析器重实现串级质谱分析的四极质量分析器，在串级质谱方面具有独特的优势。

离子阱质谱分析中的低质量截止值(Low Mass Cutoff, LMCO)是指用离子阱质谱进行串级质谱分析时，经碰撞解离(Collision-induced Dissociation, CID) 方法产生的碎片离子中，一些质荷比较小的离子往往测量不到。如在现有的很多商业离子阱质谱仪中，质荷比低于母体离子质荷比约三分之一的碎片离子将无法被检测到，它常常也被称为三分之一定则。很显然，由于低质量截止值的限制，将会导致串级质谱分析中约三分之一质量范围的碎片信息的丢失。在某些时候，低质量数离子信号的丢失将会直接影响分析小分子的结构，和一些多肽的定量分析结果。

下面首先讨论低质量截止值，即LMCO 的产生原因，再给出解决方法。

根据马修方程，对于任何存储于离子阱中的离子，其稳定与否，取决于以下：

（1）

上式中，q_z为离子阱的工作参数，V为离子阱工作电压，Ω=2πf为离子阱工作电压的角频率，f是工作电压的频率，m为离子质量， e为离子所带电荷， r₀ 为离子阱的场半径。

变化（1）有：

（2）

对于一般正弦波射频离子阱而言，稳定离子的q_z范围为0～0.908。由（2）可以看出，对于任何一个离子阱质量分析器来说，当其工作条件一定时，即离子阱的r₀ ，工作电压V，和电压频率一定，它都有一个与qz=0～0.908对应的离子质量存储范围，最小离子质荷比为

。

通常，一个离子阱的工作电压的频率f是一定的，且在离子阱对某一母体离子作串级质谱分析时，其工作电压V和q_z值也是一定的，因此，可由（2）式计算出此时母体离子质荷比m_p/e所对应的q_p为：

（3）

由于在CID 过程中，离子阱的工作条件是不变的，即V，Ω，r₀ 都不变，所以产生的每一种碎片离子m_d所对应的q_d为：

（4）

所以有：

或

（5）

LMCO定义为离子阱在CID过程中所能测量到的最小离子与母体离子的质量比值。

前面已述的，只有当一个离子的q小于0.908时，它才可以稳定地被存储在离子阱中，即离子阱中可以存在并被测量到的最小离子m_d为（此时q_d=0.908）：

（6）

由此可以看出，离子阱中可以存储的最小碎片离子的大小完全取决于进行母体离子CID时所选择的q_p 值。

理论上讲，为了能够测量尽可能小的碎片离子，克服LMCO对离子测量的不利影响，CID过程中所选择的q_p 值应越小越好。但另一方面，对于一个射频离子阱来说，它的q_p 值是由离子阱的工作电压所决定的，如果工作电压太低，不仅会影响离子阱的离子束缚和存储能力，还会影响离子阱的串级质谱分析效率。因此，离子阱工作时的q_p值必须选择一个合适的范围，例如，Thermo Finnigen LTQ 离子阱质谱的q_p值就设定为0.25，它所对应的LMCO为0.275。

其实，三重四极杆的CID之所以可获得较宽的子离子谱的质量范围，不仅仅因为三重四极的碰撞室没有所谓1/3LMCO的限制，还因为在三重四极的碰撞室中，可以发生多级碰撞裂解，即一部分子离子还会继续与碰撞气体碰撞，产生第二代离子；第二代离子如果仍具有一定动能，还会继续与碰撞气体碰撞，产生第三代离子…。这个多级产物链使得三重四极杆的MSMS谱图具有较宽的质量范围，从而带来丰富的碎片信息。

而在离子阱进行传统的固定电压、频率CID时，只对一种母离子进行激发，不太可能产生多级CID产物。但如果在进行CID时，向下扫描射频电压，可以对质量数较小的子离子进一步激发，产生质量更小的第二代，第三代等碎片离子，并以此继续下去。虽然每一代的质量仅仅比上一代减小比例LMCO，最终获得的产物离子可以比原来的母离子质量减小LMCOⁿ，n为最终裂解辈数，即有效增加了MSMS谱图的质量范围。

但是，在每一代母离子被激发后迅速减小捕获电压，对该母离子来说，捕获势阱深度将会迅速变小。没有被裂解的母离子也将逃离势阱而消失。所以，传统的离子阱中，即使采用扫描CID，也不易得到宽范围的MSMS谱图。

数字离子阱采用全新的电压驱动方法实现离子的存储，解离，和质量分析^[20-24]。在数字离子阱的实验过程中，离子阱的工作电压是固定的，离子的质量分析是通过扫描数码电源的周期来实现的。它的原理如下：

根据（2）式可得：

（7）

即，在实验过程中若保持V, 和q_z值一定，可以通过改变工作电压的周期T实现离子的质量分析。

在本工作的实验过程中，我们固定离子阱数码工作电源的电压和频率，实现离子的存储，母离子质量选择。但在离子CID过程中，不断降低工作电源的周期T，不仅对产物离子进一步进行激发，而且持续降低待测产物离子的q值，使其不致于超出边界值(数字离子阱中边界值q=0.712)。由于采用的是频率扫描，其电压幅值不下降，每一代未裂解的母离子也不至于逃离势阱，与各代碎片离子共存于离子阱中，最终得到宽质量范围的MSMS谱图。此外，由于电源频率是由计算机控制的，实验过程中无需改变任何装置。所有步骤通过计算机软件实现。

在非专利文献1、非专利文献2都介绍了一种实现离子阱低质量数截止的方法，非专利文献1主要通过优化q_z值的方法来实现较低质量数碎片离子的检测；非专利文献2主要采用脉冲q值解离的方法，即在较高工作电压下（对应于较大的q值）进行CID的偶极激发过程，当激发过程完成后，快速降低离子阱工作电压，也即降低q值，这时可以测量到较低质荷比的碎片离子，实现对离子阱串级质谱分析中低质量数碎片产物的检测。但是，对于不同离子，所需的激发过程长短是不同的，过晚降低离子阱工作电压将导致大量的子离子（尚处于不稳定区）丢失，过早停止激发又不能有效的碎裂母离子。同时，对整个仪器的硬件及结构的要求必将变得更加严苛和复杂化。

离子阱的驱动电压主要是射频电压（radio frequency，简称RF）。目前，驱动离子阱的射频电压可以有两种类型，一种是传统的正弦波驱动，另一种是数字方波驱动。本发明提出的方法在主要应用在数字方波驱动模式下。

在数字方波驱动的离子阱中，用于束缚离子的方波的幅值一般为几百伏，且为一定值。离子阱工作时，通过对数字方波频率的扫描，在扫描阶段，在数字方波上叠加偶极共振激发信号，当离子频率与扫描时的偶极共振激发信号频率实现共振时，实现离子的共振弹出。用于离子共振激发的偶极激发方波同束缚方波一样，均由相同的方式产生和控制，但是其幅值较低一般在0~10伏以内，其频率与束缚方波保持一固定的比例关系。束缚方波和用于离子弹出的偶极激发方波的波形均为对称波形，即具有50%的占空比。

在传统的数字离子阱工作中，串级质谱分析方法一般是固定射频工作电源的某一频率，使其母离子偏离离子束缚中心，产生运动动能，转换成内能，发生离子解离，得到离子产物。本发明讲述的是在碰撞解离阶段，将射频工作电源的频率实现从低往高的线性扫描，使其母离子发生碎裂，同时可以检测到母离子解离的最小质荷比碎片离子。

无论是数字方波还是正弦波电压用于离子阱中束缚离子，只要采用通过共振激发的方式将离子弹出离子阱时，均需要施加一个偶极激发电压，即一对幅度相同、相位完全相反的交流电压分别施加到离子阱的一对电极上，离子从该电极所在的方向弹出。

对于目前已知的常规的数字方波驱动或是正弦波驱动离子阱而言，在实现碰撞诱导解离过程中，所得到的碎片离子中，在低于母离子质荷比一定比值的碎片离子是检测不到的，低质量数的碎片离子信号的丢失直接影响到对母离子结构分析的结果。

技术文献

1：Yang Y H, Lee K, Jang K S, Kim Y G, Park S H, Lee C S, Kim B G.Anal. Biochem.,2009,387(1): 133-135.

2：Meany D L, Xie H W, Thompson L V, Arriaga E H, Griffin T J.Proteomics.,2007,7(7): 1150-1163。

发明内容

本发明的目的是提出一种便捷简单的离子阱低质量数截止值串级质谱分析方法，通过线性扫描射频工作电压频率实现离子串级质谱分析的低质量数碎片离子的分析，其能显著简化实验装置和方法，同时可以检测到低质荷比的碎片离子，获得更丰富的碎片离子信息。

本发明提出的离子阱低质量数截止值串级质谱分析方法，在母离子解离阶段，通过线性扫描射频工作电压频率实现离子串级质谱分析的低质量数碎片离子的分析，依次包括离子选择隔离、碰撞诱导解离和质量扫描分析三个阶段；具体过程如下：

（1）离子选择隔离阶段，将选择的母体离子被隔离出来，被隔离的母体离子在离子阱射频工作电压产生的电场作用下，通过与中性气体分子的碰撞冷却被束缚在离子阱中；

（2）碰撞诱导解离阶段，在离子阱质量分析器中，施加射频工作电压，幅度保持不变；同时，通过对施加在离子阱电极上的射频工作电压频率进行线性扫描，在该过程中加载一定的偶极激发电压，驱动母离子在射频工作电压频率线性扫描过程中获得能量被激发，偏离离子阱束缚离子中心地带，被激发的母体离子产生高速运动，与离子阱中的中性分子发生碰撞并解离，产生母离子解离的最低质量数碎片离子，最低质量数的碎片离子在离子阱中经过冷却后被束缚；

（3）质量扫描分析阶段，当母体离子经碰撞诱导解离后，对射频工作电压信号从高频往低频进行线性扫描，碎片离子在偶极激发电压的作用下，发生共振激发，弹出离子阱，最终从离子引出电极的引出孔或引出槽中被逐出，被安置在离子阱外的离子探测器检测到，获得离子的质谱信号。

本发明中，步骤（2）中，射频工作电压的频率是从低频率向高频率进行线性扫描，所述偶极激发电压的频率是也是从低频率向高频率进行线性扫描。

本发明中，步骤（2）中，所述射频工作电压是数字方波电压、正弦波电压、三角波形电压或者其它形式波形电压信号。

本发明中，步骤（2）中，所述最低质量数的碎片离子，是母离子结构碎裂解离过程中的最低质量数。

本发明中，步骤（2）中，所述母离子解离的最低质量数碎片离子与其他质量分析器产生的最低质量数碎片离子的截止值一致。

本发明中，步骤（2）中，所述射频工作电压的扫描频率区间大小不受限制，将根据实验需要加以改变和调节。

本发明中，步骤（2）中，所述偶极激发电压频率与射频工作电压频率比值为任意值。

本发明中，步骤（2）中，所述数字方波射频工作电压的幅度为0~1000V_0-p。

本发明中，步骤（3）中，所述偶极激发电压频率与射频工作电压频率比值为任意值。

本发明中，步骤（3）中，偶极激发电压的幅值为0.1~10V_0-p。

本发明中，在于整个解离过程持续的时间不受限制，具体根据实验需求加以调节。

本发明中，串级质谱分析方法对离子阱的种类没有要求，可以适用于任何四极离子阱质量分析器，包括三维离子阱，二维线形离子阱，或者其它任何几何形状的离子阱质量分析器。

本发明中，所述中性气体为惰性气体，如：氦气、氩气或氮气。

本发明中的串级质谱分析方法，实现碎片离子的质量分析的方式采用共振激发的方式，质量分析方式不会对串级质谱分析结果产生影响。

本发明方法的优点在于：它仅通过软件的控制改变射频工作频率，母离子偏离束缚中心，得到离子碰撞能量,从而实现解离，得到最小质量数的碎片离子，显著简化实验装置和方法的同时解决了离子阱质量分析器的低质量截止（Low mass cut off, LMCO）的问题。

附图说明

图1用于驱动离子阱的方波和正弦波的波形示意图，图1（a）对称方波的波形示意图，图1 （b）对称正弦波的波形示意图。

图2 为实施例1的仪器实验平台结构示意图。

图3 为实施例1中采用的数字射频方波工作电压施加方式示意图。

图4 为实施例1中离子阱工作时序示意图。

图5 为实施例1的实验结果，对母离子的选择性隔离的质谱图，样品为利血平（m/z=609）。

图6为传统的方法的碰撞诱导解离利血平的实验结果，在碰撞解离阶段通过固定某一频率，实现碰撞诱导解离后的质谱图。

图7为本发明中实施例1利血平的实验结果，在碰撞解离阶段通过线性扫描射频工作电压频率，实现碰撞诱导解离后的质谱图，得到更多的低质量数离子离子。

图8为本发明中实施例1所述的实验方法，选用样品脑啡肽（m/z=556）得到的低质量数碎片离子。

图9 为采用传统的正弦波电压驱动离子阱，在碰撞解离阶段使用本发明中线性扫描工作频率方法实现碰撞解离的施加方式示意图。

图10为采用传统的数字方波电压驱动其他结构的离子阱，在碰撞解离阶段使用本发明中线性扫描工作频率方法实现碰撞解离的施加方式示意图。

具体实施方式

实施例1

本技术方案采用数字方波电压驱动离子阱，通过改变射频工作电压的占空比实现母离子的碰撞诱导解离，目前此方案已进行了实验验证，具体内容如下。

该方案中的离子阱选择矩形离子阱进行测试。仪器实验平台如图2所示，本实验室自行设计和加工的电喷雾电离源-离子阱质谱仪器系统（ESI-IT-MS）。仪器由三级差分真空系统构成，离子阱所在第三级真空腔内真空度可达到3×10-3Pa。电喷雾电离源产生的离子通过取样锥孔进入二级真空腔，经过一段长度为200毫米的四极离子导引进入矩形离子阱中，完成质量分析。氦气作为冷却气从阱的后端盖电极上的小孔中引入用于离子冷却。试剂：脑啡肽（YGGFL，m/z=556）；利血平（Reserpine, m/z=175，上海阿拉丁试剂有限公司），配制成5×10-5 M的溶液，溶剂采用甲醇∶水=50∶50，其中含有0.05%的醋酸。

数字直接合成（DDS）的方法产生低电平的方波电压，一般为5V的TTL电平。经过快速开关（switches）和MOSFET场效应管的放大后，得到幅度在0-1000V_0-p范围内连续可调的高压方波用作束缚电压。偶极激发电压通过束缚电压的分频得到，即偶极激发电压与束缚电压的频率之间存在一比例关系，系数为β/2，β值小于1。射频工作电压方波的周期、扫速、对称性和时序可以通过软件精确控制。一对幅度相同、相位完全相反的方波束缚电压分别施加到离子阱x和y方向的两对电极上。离子从x方向弹出，偶极激发电压与方波束缚电压耦合后施加到一对x方向电极上。

通过进行常规的质量扫描的方法，可以得到一张样品离子的完整谱图。在本次实验中，射频工作电压的幅值优选为150~250V_0-p；其偶极激发频率为束缚方波的频率的三分之一，即 β 值为2/3，幅度为0.1~10V_0-p，优选0.2~2 V_0-p。随着束缚方波的频率扫描，不同质荷比的离子依次到达共振点发生共振，从阱中弹出被离子探测器检测。串级质谱分析从时间上主要分为三个阶段。

串级质谱分析第一阶段，将被测样品利血平母离子隔离，并通过冷却将其束缚在阱中，此时偶极激发电压不施加。此时在该阶段后直接进行质量扫描，得到的是只有一个609质谱峰的谱图，如图4所示。

串级质谱分析第二阶段，改变该阶段的射频工作电压信号频率，对所加载的射频信号频率进行从低到高的线性扫描，离子在阱内受到射频工作电压频率的线性扫描变化，母离子偏离束缚中心，与阱内的中性气体分子发生多次碰撞，同时产生的一次碎片离子在频率不断变化过程中，再次与阱内的中性气体分子和其他碎片离子发生碰撞碎裂，经过多次的碰撞碎裂，得到母离子解离过程中最低质量数的碎片离子，在此过程中射频工作电压信号的幅度不变，同时在该阶段施加偶极激发电压，β值为0.3333，幅值为0.1-10V_0-p，优选0.2~2 V_0-p。

串级质谱分析第三阶段，在该阶段中，对射频工作电压信号从高频向低频进行线性扫描。β值为2/3。离子阱阱内的碎片离子在偶极激发电压的作用下，发生共振，最终从电极的引出孔或引出槽中弹出被检测，完成整个串级质谱分析，得到串级质谱分析谱图。

先按照常规方法实现碰撞解离实验，在碰撞解离实验阶段中，选择射频工作电压某一固定频率，使得离子偏离束缚中心，实现碰撞解离，得到的解离谱图如图4所示；在通一实验装置中，不改变任何硬件实施，只在碰撞解离阶段改变射频工作电压的频率，得到初步的实验结果表明，在串级质谱分析的第二阶段，即碰撞诱导解离阶段， β值固定在0.3333，射频工作电压频率从540kHz扫描到560kHz时，得到的母离子利血平离子碰撞解离谱图，如图6 所示。在本实验研究过程中，使用样品利血平应用于本发明方法，射频工作电压频率从500kHz线性扫描到596.3kHz时，得到的母离子脑啡肽碰撞解离谱图，如图7所示。通过传统的解离方法和本发明中讲述的新方法得到碰撞解离谱图对比可以发现，本发明的新方法得到了更多的低质量数碎片离子，其方法简单，同时得到了更多有关母离子结构的信息。

本发明中，还可采用其他波形信号电压驱动离子阱，在碰撞解离阶段通过改变射频工作电压信号的频率，实现母离子的碰撞诱导解离，实现低质量数的检测。

本发明中，该方法同样可应用于在其他任何结构的四极离子阱质量分析器上，可以是三维离子阱也可以是采用双曲面电极的线形离子阱，只要在碰撞解离阶段通过改变射频工作电压信号的频率，都可以实现母离子的解离，获得最低质量数的碎片离子。

Claims (9)

1.离子阱低质量数截止值串级质谱分析方法，其特征在于依次包括离子选择隔离、碰撞诱导解离和质量扫描分析三个阶段；具体过程如下：

（1）离子选择隔离阶段，将选择的母体离子被隔离出来，被隔离的母体离子在离子阱射频工作电压产生的电场作用下，通过与中性气体分子的碰撞冷却被束缚在离子阱中；

（2）碰撞诱导解离阶段，在离子阱质量分析器中，施加射频工作电压，幅度保持不变，同时，通过对施加在离子阱电极上的射频工作电压频率进行线性扫描，在扫描过程中加载一定的激发电压，驱动母离子在数字方波频率线性扫描过程中获得能量被激发，偏离离子阱束缚离子中心地带，被激发的母体离子产生高速运动，与离子阱中的中性分子发生碰撞并解离，产生母离子解离的最低质量数碎片离子，最低质量数的碎片离子在离子阱中经过冷却后被束缚；

（3）质量扫描分析阶段，当母体离子经碰撞诱导解离后，对射频工作电压信号从高频往低频进行线性扫描，碎片离子在偶极激发电压的作用下，发生共振激发，弹出离子阱，最终从离子引出电极的引出孔或引出槽中被逐出，被安置在离子阱外的离子探测器检测到，获得离子的质谱信号；

其中，射频工作电压的频率是从低频率向高频率进行线性扫描，所述偶极激发电压的频率也是从低频率向高频率进行线性扫描。

2.根据权利要求1所述的串级质谱分析方法，其特征在于步骤（2）中，所述射频工作电压是数字方波电压、正弦波电压或三角波形电压。

3.根据权利要求2所述的串级质谱分析的方法，其特征在于步骤（2）中，所述射频工作电压的扫描频率区间大小不受限制，将根据实验需要加以改变和调节。

4.根据权利要求3所述的串级质谱分析的方法，其特征在于步骤（2）中，所述射频工作电压的幅度为0~1000V_0-p。

5.根据权利要求1所述的串级质谱分析的方法，其特征在于步骤（3）中，所述偶极激发电压频率与射频工作电压频率比值为任意值。

6.根据权利要求5所述的串级质谱分析的方法，其特征在于步骤（2）、（3）中，偶极激发电压的幅值为0.1~10V_0-p。

7.根据权利要求1所述的串级质谱分析的方法，其特征在于整个解离过程持续的时间不受限制，具体根据实验需求加以调节。

8.根据权利要求1所述的串级质谱分析的方法，其特征在于所述离子阱质量分析器为三维离子阱、二维线形离子阱或者其它任何几何形状的质量分析器。

9.根据权利要求1所述的串级质谱分析的方法，其特征在于所述中性气体为惰性气体。

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