CN103408640B - 一种替考拉宁的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种替考拉宁的纯化方法，所述方法采用真空冷冻干燥法对含替考拉宁溶液进行浓缩干燥，获得高纯度替考拉宁粗粉与精粉。本发明方法一方面克服了在替考拉宁盐析结晶过程，包夹金属盐离子，降低纯品效价的不足；另一方面避免了在结晶过程中大量使用易挥发、有毒、污染环境的丙酮等有机溶剂。该发明方法最大限度地简化工艺，降低生产设备的投入，减少对环境的污染，经济环保，能有效提高替考拉宁的纯度和生产效率，有利于在规模化生产中开发应用。

Description

一种替考拉宁的纯化方法

技术领域

本发明属于化学领域，涉及一种纯化替考拉宁的方法。

背景技术

替考拉宁是继万古霉素之后开发的另一种抗耐药菌的糖肽类抗生素，其主要对革兰阳性需氧菌和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别是对MRSA所致感染有很好的疗效，是目前临床上为数不多的对多重耐药性金葡菌和肠球菌仍有抗菌活性的药物之一。与当前国际上公认的抗耐药菌抗生素万古霉素相比，替考拉宁具有与之相似的抗菌活性，相同的作用机制，相近或更优的临床疗效，而且毒性反应更低，特别是肾毒性更低，也不会发生使用万古霉素后引发的“红人综合征”。

替考拉宁是游动放线菌发酵生产的由多种成分组成的混合物，结构复杂，对热、酸、碱稳定性差，生产过程中容易引起失活和分解，且发酵液中替考拉宁的含量较低，一般都需要较复杂的分离纯化过程。目前公布的两项替考拉宁的纯化方法专利（专利号200710107185.6和20071016615.5）中提出了向替考拉宁浓缩液中添加丙酮进行结晶或盐析结晶的方法。但是该两项专利中提及的工艺繁琐，生产设备投入大，超滤浓缩会增加浓液杂质浓度，并且所使用的有机溶剂易污染环境，盐析结晶过程中还会容易包夹金属盐离子，引入杂质，降低样品纯度与效价。

真空冷冻干燥是先将湿料冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在较高的真空度下，使冰直接升华为水蒸气，再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品的技术。干燥过程是水的物态变化和移动的过程。这种变化和移动发生在低温低压下。因此，真空冷冻干燥的基本原理就是低温低压下传质传热的机理。近年来，在西药制备方面，已有研究显示，利用该法制备某些药品，药品结构稳定，生物活性基本不变；药物中的易挥发性成分和受热易变性成分损失很少。例如，呋脲苄西林钠的合成中，使用冷冻干燥技术进行浓缩结晶，纯度达到86%，收率达到92.8%。在门冬酰胺酶的制备工艺中，通过使用冷冻干燥技术，得到了纯度、比酶活等指标符合《中华人民共和国药典2010年版》相关规定的结晶品。

但是，上述应用冷冻干燥技术进行结晶的技术，目前通常只限制用于相对较纯，例如纯度达到70%或以上的物质中，用以进一步提高纯度。对于存在较多干扰物质的物质，例如发酵液，目前尚没有任何相关的研究或报道。

发明内容

本发明的目的之一在于克服以上现有的技术的缺陷，提供一种工艺简便，经济，安全，低污染的替考拉宁制备方法。

本发明的另一目的在于提供得率进一步得到提升的高纯度替考拉宁的纯化方法。

为解决以上问题，本发明提供了一种替考拉宁的纯化方法，所述方法是将含替考拉宁溶液采用真空冷冻干燥法进行浓缩结晶。

该方法包括以下步骤：

S1.将含替考拉宁溶液冷冻至-40℃～-45℃进行预冻；

S2.抽真空，再加热至-12～-10℃进行升华干燥；

S3.再加热至20℃～25℃进行解吸干燥，最终获得高纯度的替考拉宁。

优选地，S1所述冷冻是以38～42℃/h的速率降温，达到-40℃～-45℃后保温3～4h；作为更优选的方案，S1所述冷冻是以40℃/h的速率降温。

优选地，S2所述的抽真空是使压力到达8～15Pa。

优选地，S2所述的加热过程升温速率为6～8℃/h；升华干燥过程直至升华界面达到瓶底并消失，再保温2～4h之后结束。

优选地，S3所述的加热是以8～10℃/h的速率进行升温，升温至20℃～25℃后再保温3～5h。

所述的含替考拉宁溶液可以是多种生产方法所获得的溶液，例如，该含替考拉宁溶液是游动放线菌发酵液经柱层析洗脱所得的洗脱液，进一步经活性碳处理后所得的溶液。

作为一种实施方案，替考拉宁的纯化方法如下：对含替考拉宁溶液浓缩结晶过程中采用真空冷冻干燥法。其中，真空冷冻干燥法在以38～42℃/h的冷冻速度进行预冻，样品达到-40℃～-45℃后保温3～4h，之后抽真空使压力到达8～15Pa时，以6～8℃/h的速率缓慢加热至-12～-10℃进行升华干燥，样品温度曲线重合，干燥层和冻结层的交界面到达盘底并消失再保温2～4h。之后以8～10℃/h进行加热解吸干燥，样品温度到达20℃～25℃后再保温3～5h。

冷冻干燥的结晶原理为：

溶液需过冷到冰点以后，其内产生晶核以后，自由水才会开始以冰的形式结晶，同时放出结晶热使其温度上升到冰点，随着晶体的生长，溶液浓度的增加，当浓度达到共晶浓度，温度下降到共晶点以下时，溶液就会全部冻结。溶液结晶的晶粒数量和大小除了与溶液本身的性质有关以外，还与晶核生成速率和晶体生长速率有关。而晶核生成速率和晶体生长速率这两个因素又是随温度和压强的变化而变化的，因此，我们可以通过控制温度和压强来控制溶液结晶的晶粒数量和大小。一般来说，冷却速度越快，过冷温度越低，所形成的晶核数量越多，晶体来不及生长就被冻结，此时所形成的晶粒数量越多，晶粒越细；反之晶粒数量越少，晶粒越大。

晶体的形状也与冻结温度有关。在0℃附近开始冻结时，冰晶呈六角对称形，在六个主轴方向向前生长，同时，还会出现若干副轴，所有冰晶连接起来，在溶液中形成一个网络结构。随着过冷度的增加，冰晶将逐渐丧失容量辨认的六角对称形式，加之成核数多，冻结速度快,可能形成一种不规则的树枝型，它们有任意数目的轴向柱状体，而不象六方晶型那样只有六条。

在本发明中，真空冷冻干燥的处理对象为含替考拉宁的溶液，本发明的真空冷冻干燥结晶过程，通过在低温下，用适当的冷冻温度来控制溶液晶体生长，形成合适的晶形，再经过真空状态下加热升华来干燥水份，从而获得纯化的替考拉宁。

在浓缩结晶中，对所生产的替考拉宁的纯度具有重要的影响：由于替考拉宁的溶解度随温度变化而变化的幅度不是很大，因而现行的结晶方法包括有机溶剂析出法、盐析法等无一例外的都是通过向替考拉宁的浓溶液中添加其他化学试剂而实现的，也就不可避免的残留了相应的有机溶剂或无机盐而影响到最终结晶品的比效价，降低了结晶品的纯度。为了获得较高纯度的替考拉宁，本发明方法优选采用的技术方案：应用真空冷冻干燥结晶技术，样品在低于共晶温度下，真空升华干燥而浓缩结晶，避免在浓缩结晶过程中残留相应的有机溶剂或无机盐。

同时，在冷冻干燥结晶中，以下条件的控制又会对替考拉宁的得率具有重要的影响：冷冻速率与升华速率。冷冻速度过快，生长晶粒过细，不利于升华干燥，且样品结构紧密，升华速率快时会受热不均，导致局部温度相对较高，易超过共晶温度，样品过热“沸腾”，使活性物质失活，效价损失；冷冻速度过慢，晶粒虽大，有利于升华干燥，但在慢冻过程中，活性物质结构易被破坏，也会引起效价损失。只有控制适当的冷冻速率和升华速率，才能保证样品效价损失最小，有利于提高得率。为了获得高得率的替考拉宁，优选采用以下的技术方案：以38～42℃/h的速率进行样品预冻，以6～8℃/h的升华速率进行升华干燥。

综合考虑了产品的纯度、得率等因素，本发明最为综合优选的技术方案为：以38～42℃/h的冷冻速度进行预冻，样品达到-40℃～-45℃后保温3～4h，之后抽真空使压力到达8～15Pa时，以6～8℃/h的速率缓慢加热至-12～-10℃进行升华干燥，样品温度曲线重合，干燥层和冻结层的交界面到达盘底并消失再保温2～4h。之后以8～10℃/h进行加热解吸干燥，样品温度到达20℃～25℃后再保温3～5h。

由于替考拉宁是游动放线菌发酵而得的发酵液，经本单位的层析技术和活性碳脱色方法处理后，采用真空冷冻干燥技术在浓缩结晶过程中其结晶行为是相当复杂的，规律难以摸索。并且，由于细菌发酵液的成分较为复杂，干扰物质多，对目标物的结晶行为造成多种影响，因此，发明人发现并非所有细菌发酵液都可以利用上述方法获得纯化效果，其中有一大部分的细菌发酵液应用该纯化方法，会造成目标物效价损失较为严重，或者得率过低的缺陷。这些优选的技术方案是发明人经过多次探索性的试验总结而得，部分重要的实验结果支持列举如实施例。

具体实施方式

为了进一步阐释本发明的技术方案，以下结合实施例进行说明。需要指明的是实施例是对发明内容的进一步解释，而非对保护范围的限制。

实施例1

采用现有技术的方法进行纯化

取1L由发酵液经大孔树脂的柱HZ801后所得的替考拉宁洗脱液（效价为81.085mg/ml，经HPLC分析，有效峰面积为73.7%，其它杂质峰面积为10.2%）。调节PH至4.0，加入活性碳10g，于45℃环境中速搅拌30min，滤掉活性碳得澄清滤液887ml，清液效价为69.602mg/ml，含替考拉宁61.737g。将澄清滤液边搅拌边加入60gNaCl，待NaCl全部溶解后，用1M的HCl溶液调PH至4.5，继续搅拌60min，4℃静置24h，过滤并用水清洗结晶体，得替考拉宁湿粗品，40℃真空烘干，得粗粉51.489g。样品得率为63.5%，其中结晶过程得率为83.40%。样品比效价为725U/mg。结晶过程效价损失16.6%。经HPLC分析，有效峰面积为84.7%，其它杂质峰面积为7.2%。

实施例2

取1L由发酵液经大孔树脂的柱HZ801后所得的替考拉宁冼脱液（效价为81.085mg/ml，经HPLC分析，有效峰面积为73.7%，其它杂质峰面积为10.2%）。调PH至4.0，加入活性碳10g，于45℃环境中速搅拌30min，滤掉活性碳得澄清滤液859ml，清液效价为68.598mg/ml，含替考拉宁58.926g。将澄清滤液装入冻干盘，放入真空冷冻干燥机，样品先以40℃/h的冷冻速度进行预冻至-42℃后保温4h，之后抽真空使压力到达8～15Pa时，以8℃/h升温速率缓慢加热至-12℃进行升华干燥，样品温度曲线重合，干燥层和冻结层的交界面到达盘底并消失再保温2h。之后以8℃/h进行加热解吸干燥，样品温度到达20℃后再保温3h，即得替考拉宁粗粉57.295g，样品得率为70.66%，其中冻干过程得率为97.23%。样品比效价为986U/mg。经HPLC分析，有效峰面积为88.6%，其它杂质峰面积为4.6%。冻干粉外观平整疏松，白色晶型。冻干过程效价损失2.8%，升华过程用时6h。

实施例3

进一步精纯，取上述实施例2所得的替考拉宁粗粉50g用2.5L纯水溶解至20000单位，经聚酰胺树脂，用PH4.0的30%乙醇水溶液洗脱，所收集的洗脱液2.15L，效价为21.749mg/ml。加入针用型活性碳20g，于45℃环境中速搅拌30min，滤掉活性碳得澄清滤液2L，清液效价为19.618mg/ml，含替考拉宁39.236g。脱色后装入冻干盘，放入真空冷冻干燥机，余同实施例2方法，即得替考拉宁精粉38.255g，样品得率为76.51%，其中冻干过程得率为97.49%。样品比效价为1073U/mg。经HPLC分析，有效峰面积为94.5%，其它杂质峰面积为2.9%。冻干粉外观平整疏松，白色晶型。冻干过程效价损失2.5%，升华过程用时6.5h。

实施例4

取含有替考拉宁效价为68.521mg/ml的溶液1L，装入冻干盘，放入真空冷冻干燥机，以10℃/h的冷冻速度进行慢速预冻至-40℃后保温3.5h，之后抽真空使压力到达8～15Pa时，以8℃/h升温速率缓慢加热至-12℃进行升华干燥，样品温度曲线重合，干燥层和冻结层的交界面到达盘底并消失再保温3h。之后以9℃/h进行加热解吸干燥，样品温度到达20℃后再保温5h，即得替考拉宁干粉。干粉外观疏松，部分轻微萎缩，微黄色晶型。将干粉用纯水溶解回至1L。检测效价为65.294mg/ml，样品冻干过程得率为95.29%，比效价为1007U/mg。经HPLC分析，有效峰面积为91.7%，其它杂质峰面积为3.2%。冻干过程效价损失4.7%，升华过程用时3h。

实施例5

取含有替考拉宁效价为68.521mg/ml的溶液1L，装入冻干盘，放入真空冷冻干燥机，以20℃/h的冷冻速度进行慢速预冻至-45℃后保温4h，之后抽真空使压力到达8～15Pa时，以8℃/h升温速率缓慢加热至-12℃进行升华干燥，样品温度曲线重合，干燥层和冻结层的交界面到达盘底并消失再保温2h。之后以9℃/h进行加热解吸干燥，样品温度到达20℃后再保温4h，即得替考拉宁干粉。干粉外观疏松，微黄色晶型。将干粉用纯水溶解回至1L。检测效价为66.098mg/ml，样品冻干过程得率为96.46%，比效价为1039U/mg。经HPLC分析，有效峰面积为93.2%，其它杂质峰面积为2.9%。冻干过程效价损失3.5%，升华过程用时5h。

实施例6

取含有替考拉宁效价为68.521mg/ml的溶液1L，装入冻干盘，放入真空冷冻干燥机，以60℃/h的冷冻速度进行快速预冻至-40℃后保温4h，之后抽真空使压力到达8～15Pa时，以8℃/h升温速率缓慢加热至-12℃进行升华干燥，样品温度曲线重合，干燥层和冻结层的交界面到达盘底并消失再保温2h。之后10℃/h进行加热解吸干燥，样品温度到达20℃后再保温3h，即得替考拉宁干粉。干粉外观平整紧密，白色晶型。将干粉用纯水溶解回至1L。检测效价为66.624mg/ml，样品冻干过程得率为97.23%，比效价为1081U/mg。经HPLC分析，有效峰面积为94.1%，其它杂质峰面积为2.4%。冻干过程效价损失2.8%，升华过程用时8h。

表1不同纯化技术工艺条件下样品制备情况比较

	产品纯度/%	比效价U/mg	效价损失率/%	产品得率/%
					例1	84.7	725	16.6（结晶过程）	83.40
例2	88.6	986	2.8（冻干过程）	97.23
					例3	94.5	1073	2.5（冻干过程）	97.49

表2.不同冻干条件下的样品制备情况的比较

由上述实施例及表1、2可以看出，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

结合本单位的层析技术和活性碳脱色方法对含替考拉宁发酵液进行处理后的溶液，采用上述真空冷冻干燥法进行浓缩与结晶，克服了对替考拉宁浓缩结晶或盐析结晶过程中增加了杂质浓度，降低纯度，有利于提高样品的比效价和纯度及得率，且避免在结晶过程中大量使用易挥发、有毒、污染环境的丙酮。本发明方法最大限度地简化工艺，降低生产设备的投入和减少对环境的污染，经济环保，能有效提高替考拉宁的纯度和生产效率，有利于在规模化生产中应用。

Claims (3)

1.一种替考拉宁的纯化方法，其特征在于，将含替考拉宁溶液采用真空冷冻干燥法进行浓缩结晶；包括以下步骤：

S1.将含替考拉宁溶液冷冻至-40℃~-45℃进行预冻；

S2.抽真空，再加热至-12~-10℃进行升华干燥；

S3.再加热至20℃~25℃进行解吸干燥，最终获得高纯度替考拉宁；

所述的含替考拉宁溶液是游动放线菌发酵液；S1所述冷冻是以10~60℃/h的速率降温，达到-40~-45℃后保温3~4h；S2所述的抽真空是使压力达到8~15Pa；所述的发酵液还经柱层析洗脱，所得洗脱液进一步经活性碳处理；

S2所述的加热过程升温速率为6~8℃/h；升华干燥过程直至升华界面达到瓶底并消失，再保温2~4h之后结束；S3所述的加热是以8~10℃/h的速率进行升温，升温至20~25℃后再保温3~5h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1所述冷冻是以38~42℃/h的速率降温。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，S1所述冷冻是以40℃/h的速率降温。