CN113074519B - 一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高效去除门冬胰岛素结晶干燥过程中溶剂残留的方法。本发明所述门冬胰岛素结晶干燥工艺采用初步抽真空去除大部分有机溶剂；然后加水进行保湿保压，期间需控温并适时翻料，使得门冬胰岛素的溶剂结晶体向结晶水转化；再进行抽真空，控温并适时翻料，使难去除的残留有机溶剂进一步去除；重复保湿保压及抽真空步骤，让湿固体充分接触水蒸气，在降低溶剂残留的基础上保证样品的稳定。本发明制备的公斤级胰岛素成品中乙醇残留溶剂达到3000 ppm以下，产品纯度达到99%以上。解决了现有技术中存在的溶剂残留高、质量不稳定、设备要求高、放大成本高以及不适合大规模生产的问题。

Description

一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高效去除门冬胰岛素结晶干燥过程中溶剂残留的方法。

背景技术

门冬胰岛素是利用基因重组技术生产的一种有效用于糖尿病治疗的药物。在利用基因重组技术生产门冬胰岛素的干燥过程中，一般都会用到常温真空干燥或冷冻干燥技术。在传统的胰岛素的生产工艺中，胰岛素结晶使用大量的有机溶剂脱水、真空干燥，该干燥工艺不仅具有有机溶剂残留的风险，且在常温下干燥，干燥时间较长，干燥期间，温度及干燥时间亦影响胰岛素的生物活性与纯度。CN103709244B采用正丙醇冲洗并淋洗门冬胰岛素晶体以除去毒性高的间苯二酚有机杂质，然后通过冷冻干燥除去引入的有机溶剂正丙醇，但冻干工艺增加了生产成本，设备要求较高，且不利于工业放大。CN108929376A采用中空纤维系统对胰岛素晶体或胰岛素类似物晶体进行洗涤，收集晶体，冻干，过程中增加了超滤工艺，增加了生产周期，同时采用冻干工艺，成本较高，设备要求较高。WO2020051812公开先用氯化锌和间甲酚制备门冬胰岛素晶体，再用乙醇洗涤晶体，然后将收集的晶体在15℃-35℃下直接干燥60 h-96 h，干燥过程没有加水保湿的步骤，真空压力不大于-0.08 MPa，干燥后得到的门冬胰岛素原料药中乙醇残留量较高，约10900 ppm。虽然在如今的胰岛素的生产工艺中，胰岛素结晶使用有机溶剂，通过洗涤、冻干，可以去除大部分的溶剂残留，但仍然无法使成品中溶剂残留达到更低水平，工艺中所用到的溶剂种类主要有乙醇、乙腈、异丙醇或甲苯（其中甲苯原料中可能有引入苯杂质），目前2020版本中国药典对这些溶剂有限度要求，分别为不超过(NMT) 5000 ppm、410 ppm、5000 ppm和890 ppm，其中苯溶剂的残留限度为NMT 2 ppm，这些残留溶剂将给最终产品的质量带来一定风险。

同时，使用冻干工艺，虽然在一定程度上保证质量要求，但对设备的要求较高，工艺放大成本较高，主要体现在设备成本上，一台冻干线需要投入上千万的资金，后期使用所需要的电费和维护费用也相对很多；且多为水溶液体系冻干，得到的是无定型固体，无法获得更为稳定的胰岛素晶体，在后期存放过程中，其有关物质增长比较快，产品不稳定。

如何在保证门冬胰岛素品质不变的基础上，对其进行干燥成为目前制药业，特别是门冬胰岛素制品制药业亟待解决的问题。

基于以上现有技术的缺陷和不足，很有必要提供一种工艺过程简单，可连续性操作，适合工业化生产的门冬胰岛素晶体的干燥方法来控制产品的溶剂残留，从而得到高质量的门冬胰岛素原料药。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种工艺过程简单，产品质量高，成本低，适用于工业化生产的高效去除门冬胰岛素结晶干燥过程中有机溶剂残留的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，包括如下步骤：

步骤A，将含有残留有机溶剂的门冬胰岛素湿固体放入真空干燥箱中进行抽真空干燥，控制干燥温度为15℃~30℃，干燥时间为5 h~50 h；

步骤B，往真空干燥箱中加入适量水，再次抽真空使真空度达到一定水平后关闭真空阀，保压保湿，维持一段时间，控制干燥温度为15℃~30℃，保压保湿的时间为5 h~50 h；

步骤C，继续抽真空干燥，控制干燥温度为15℃~30℃，干燥时间为5 h~50 h；

步骤D，重复步骤B中的保压保湿和步骤C，得到低残留溶剂、高纯度的门冬胰岛素原料药。

本发明所述低残留溶剂是指残留溶剂符合现形药典标准，进一步优选为乙醇残留溶剂低于3000 ppm。本发明所述高纯度门冬胰岛素原料药指代HPLC纯度＞99%。

作为本发明的进一步改进，所述残留有机溶剂为醇类溶剂、腈类溶剂或芳香烃溶剂；所述醇类溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇，腈类溶剂包括但不限于乙腈，或芳香烃溶剂包括但不限于甲苯、苯。

作为本发明的进一步改进，所述步骤A中，门冬胰岛素湿固体平铺的厚度小于30mm，优选1 mm≤厚度≤30 mm，优选1 mm≤厚度≤20 mm，更优选为5 mm≤厚度≤15 mm，厚度越小越有利于溶剂的蒸发，但是厚度太小会导致真空干燥箱干燥效率大幅度降低，即需要处理很多批次才能干燥完全。

作为本发明的进一步改进，所述步骤B中，水的加入量与门冬胰岛素湿固体的质量比为1:1~1:5，优选为1:1.6~1:2.5。水的加入量太多，会导致门冬胰岛素形成过多水合物，出现发粘的现象，破坏原有的晶型，导致稳定性下降。水的加入量太少，会导致真空干燥过程中水被完全蒸发掉，无法使门冬胰岛素的溶剂化物向门冬胰岛素的水合物转化，最终门冬胰岛素中残留的有机溶剂达不到3000 ppm以下。

作为本发明的进一步改进，步骤B中，水的加入方式为不与门冬胰岛素湿固体直接接触，优选为通过托盘或其它提供水汽的载体放入真空干燥箱中。所述的水为纯净水或不含杂质的水。提供水汽的载体包括但不限于冰块、蓝冰。本发明中水不能直接通过喷洒方式喷到门冬胰岛素湿固体表面，因为门冬胰岛素湿固体是晶体状态，与水接触会直接破坏晶型。水可以一次性加入也可以多次分批次加入，保证干燥箱中水分是充足的。主要目的是使液态水在干燥箱中能快速转变为气态，达到一定的饱和水蒸气压，促使门冬胰岛素的溶剂化物向门冬胰岛素的水合物转化，从而实现残留有机溶剂的去除。

作为本发明的进一步改进，步骤A或步骤C中的真空度为-0.70 bar~-1.0 bar，干燥温度为10℃~45℃，干燥时间为5 h~50 h。干燥温度＞45℃，会导致门冬胰岛素中杂质增多，成品颜色发黄。干燥温度＜10℃，会导致干燥时间明显延长。所述干燥温度可以为约15℃~40℃、约20℃~35℃、约25℃~30℃；所述干燥时间可以为约6 h~45 h、约7 h~40 h、约8 h~30 h、约10 h~28 h、约12 h~24 h。如无特殊说明，本发明所述的“约”为指与所述数值适当的接近，如加减10%。

作为本发明的进一步改进，步骤B中的真空度为-0.50 bar~-1.0 bar，真空干燥温度为10℃~45℃，控制湿度为20%~90%，保压保湿的时间为 5 h~50 h。干燥温度＞45℃，会导致门冬胰岛素中杂质增多，成品颜色发黄。干燥温度＜10℃，会导致干燥时间明显延长。所述干燥温度可以为约15℃~40℃、约20℃~35℃、约25℃~30℃；所述干燥时间可以为约6 h~45 h、约7 h~40 h、约8 h~30 h、约10 h~28 h、约12 h~24 h。干燥箱中的湿度主要是通过水的加入量进行控制的，湿度过高，导致晶型破坏，稳定性下降；湿度过低，会导致残留有机溶剂去除不完全。所述湿度可以为约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%，约50%~80%。

作为本发明的进一步改进，所述步骤B或C中，包括翻料和碾碎的操作，每隔0.5 h~30 h翻一次料和碾碎大固体，可以加速残留有机溶剂的去除。

作为本发明的进一步改进，所述步骤D中，重复步骤B和C 循环1-5次，优选1次，多次保压保湿和抽真空，可以加速残留有机溶剂的去除。

本发明经过大量深入的研究，发现该干燥工艺主要分为两个阶段：（1）首先去除表层较容易去除的第一类残留有机溶剂，（2）再去除与门冬胰岛素有较强结合作用的不容易去除的第二类残留有机溶剂。本发明所述的第一类残留有机溶剂和第二类残留有机溶剂仅从去除的难易程度进行分类，便于下文中对原理的更好理解。

第一阶段的原理为：附着在门冬胰岛素湿固体表面的微小液滴，属于液相，热力学参数（蒸发焓，蒸气压）同正常的溶剂接近，可以通过常规的升高温度和/或者降低气压的工艺将这类表层第一类有机溶剂从液相转为气相，从而降低溶剂残留。

第二阶段的原理推测为：在保压过程加入水有利于让门冬胰岛素湿固体均匀接触干燥箱内空气中的水分子，从而提高门冬胰岛素的湿度，当箱体内的水蒸气压达到一定水平时，门冬胰岛素的溶剂结晶体（或称门冬胰岛素的溶剂化物）向门冬胰岛素的结晶水合物转化，迫使残留有机溶剂从门冬胰岛素的溶剂结晶体中释放出来蒸发到气相中，然后使得残留有机溶剂在下一次抽真空过程被抽走；经过反复的保压保湿和抽真空过程，让门冬胰岛素湿固体充分接触水蒸气，在降低残留有机溶剂的基础上保证门冬胰岛素保持晶体结构状态，从而使晶体结构的原料药（API）相对无定型的原料药在长期放置过程中，产品有关杂质增长会较慢，产品质量稳定。由于门冬胰岛素中含有大量带电荷的氨基酸如Glu、His，和极性氨基酸如Ser。在固相状态下这些氨基酸里带有亲水性的残基会与溶剂分子如水和其他有机溶剂分子形成氢键，或者与附近其他的氨基酸上的极性残基形成氢键从而获得一定的空间构象。形成的氢键通常有N-H…O, O-H…N, O-H…O 和N-H…N等。这类溶剂分子非常类似于晶体中的结晶水，不属于液相。由于固相的门冬胰岛素并不是完整的晶体，所以与结晶水不同的是这类溶剂分子的组成和比例也不固定，而是在一定的范围内浮动。热力学参数（蒸发焓，蒸气压）同正常溶剂相比完全不同，由于这类溶剂分子的蒸发要克服晶格能（这里主要是氢键引起的），所以蒸发焓远高于正常的溶剂，蒸气压远低于正常的溶剂。常规的升高温度或者降低气压的干燥工艺都不足以驱使第二类残留有机溶剂分子脱离固相门冬胰岛素。

从热力学角度来看，第二类残留有机溶剂分子的蒸发过程可以用平衡方程式I简单的表示为：

平衡方程式I：门冬胰岛素•n第二类残留有机溶剂→门冬胰岛素+ n第二类残留溶剂（气相）

公式Ⅰ：ΔHe =ΔHee +ΔHce

n:第二类残留有机溶剂与门冬胰岛素的摩尔比例

ΔHe： 反应焓变

ΔHee：第二类残留有机溶剂的蒸发焓

ΔHce：第二类残留有机溶剂在门冬胰岛素固相中的晶格能

由于晶格能ΔHce的存在，第二类残留有机溶剂去除过程的反应焓变远大于第二类残留有机溶剂的蒸发焓。这使得常规的真空干燥很难将第二类残留有机溶剂除尽。

在门冬胰岛素固相中，与带电荷或者极性氨基酸残基形成氢键的溶剂分子除了大部分是有机溶剂以外，还有少量水，从形成氢键的角度考虑可以认为这两种溶剂分子并无太大差别，可以互相取代。

可以用以下的平衡方程式II表示：

平衡方程式II：门冬胰岛素•n第二类残留有机溶剂 + nH₂O（气相）↔门冬胰岛素•nH₂O + n第二类残留有机溶剂（气相）

这个过程类似于转晶，可以看作是门冬胰岛素的第二类残留溶剂的结晶体转化为门冬胰岛素结晶水合物的过程，反应可逆。

本发明所述的技术方案中，真空干燥箱体中加入了一定量的水。

本发明加入的水可以是使得干燥箱中的真空度降低后的一段时间内箱体中的水蒸气压能够维持在一定的水平（就是当时水温下的饱和蒸气压），直至水分挥发使得水温逐渐下降，最后导致水的饱和蒸气压下降。真空干燥箱中的残留有机溶剂（如乙醇）和水蒸气压随时间的变化可以参见附图1所示。

真空干燥箱内残留有机溶剂的蒸气压迅速降低，而水蒸气压由于有外在水源的存在，可以保持干燥箱内水蒸气压维持在一定的水平，湿度方面控制在20%RH-90%RH范围内。从前面的可逆平衡方程式II可以看出，这时门冬胰岛素的溶剂结晶体转向结晶水。也即水源的存在使得残留有机溶剂更容易从门冬胰岛素表面蒸发到气相中。

热力学上来看，有水源存在时，第二类残留有机溶剂分子的蒸发过程可以用平衡方程式II简单的表示:

平衡方程式II：门冬胰岛素•n第二类残留有机溶剂 + nH₂O(气相) →门冬胰岛素•nH₂O + n第二类残留有机溶剂(气相)

公式Ⅱ：ΔHe = ΔHee - ΔHew + ΔHce – ΔHcw

n:第二类残留有机溶剂的摩尔比例

ΔHe： 反应焓变

ΔHee： 第二类残留有机溶剂的蒸发焓

ΔHce： 第二类残留有机溶剂在门冬胰岛素固相中的晶格能

ΔHew：水的蒸发焓

ΔHcw：水在门冬胰岛素固相中的晶格能

从公式Ⅱ中可以看到，残留有机溶剂的去除过程类似于转晶的过程，水的蒸发焓变加上水在门冬胰岛素固相中的晶格能抵消了乙醇的蒸发焓和乙醇的晶格能，使得整个过程的反应焓变ΔHe大幅降低，第二类残留有机溶剂的蒸发变得更容易。

由于采用了上述技术方案，本发明取得了如下有益效果：本发明制备的公斤级门冬胰岛素成品中残留有机溶剂达到3000 ppm以下，产品纯度达到99%以上，解决了现有技术中存在的有机溶剂残留高、设备要求高、放大成本高以及不适合大规模生产的问题。同时门冬胰岛素经过本发明所述的干燥工艺后仍然保持晶体的结构，在长期放置过程中，产品有关杂质增长的速度明显要比无定型固体的慢，产品质量更稳定，在2℃~8℃条件下放置6个月，HPLC色谱纯度基本没有变化且始终维持在99.2%以上。

附图说明

图1真空干燥箱中水和残留有机溶剂(乙醇)的蒸气压变化示意图。

图2是实施例1所得门冬胰岛素原料药干品的晶型结构。

图3是实施例1中原料药的HPLC图谱。

图4是实施例1中供试品溶液的GC谱图。

图5是实施例1中加标供试品溶液GC图谱。

图6是实施例2中原料药的HPLC谱图。

图7是实施例2中供试品溶液的GC图谱。

图8是实施例2中加标供试品溶液的GC谱图。

图9是实施例3中原料药的HPLC图谱。

图10是实施例3中供试品溶液的GC谱图。

图11是实施例3中加标供试品溶液的GC图谱。

图12是实施例4中原料药的HPLC谱图。

图13是实施例4中供试品溶液的GC图谱。

图14是实施例4中加标供试品溶液的GC谱图。

图15是对比例1中原料药的GC图谱。

图16是对比例2中原料药的GC谱图。

图17是对比例3中原料药的GC图谱。

图18是对比例4中原料药的GC图谱。

图19是对比例3所得门冬胰岛素无定型固体的结构。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步具体的说明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

本发明所述的门冬胰岛素湿固体和甘精胰岛素湿固体依次通过基因克隆，筛选高效表达的菌种；菌种培养、发酵、提取得到胰岛素或其类似物前体；然后通过复性、酶切、纯化、结晶得到含有一定残留溶剂的高纯度胰岛素或其类似物湿固体，所述湿固体为晶体，具体制备工艺可参考本公司申请的另外1件PCT发明专利WO2020051812(公开日2020年3月19日)，其全部公开内容可直接引入到本发明中，区别是我们在干燥工艺方面做了改进，增加了加水保湿的步骤，出人意料地发现乙醇残留量明显降低了。

实施例1 (水的加入量与药物的质量比为1:2.5)

步骤A：将门冬胰岛素湿固体(乙醇溶剂残留量为117ppb)4.7 Kg装入托盘中，碾碎大的固体，控制湿固体的厚度为8.8 mm，放入真空干燥箱内，关闭箱门，开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为-0.884 bar ~ -0.886 bar。开加热器，过程控制温度为22℃，真空干燥24 h，以除掉大部分容易去除的残留有机溶剂。

步骤B保压保湿：关闭真空阀，缓开放空阀，当真空压力降为零时，打开真空干燥箱门，碾碎大固体，进行翻料，然后在真空干燥箱内放入托盘并加入1.9Kg纯水，打开真空泵进行抽真空，使真空压力为-0.867 bar ~ -0.884 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，控制湿度在50%RH-80%RH，温度控制在22℃进行保压保湿。12 h后，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后打开真空泵进行抽真空，使真空压力达到-0.867 bar ~ -0.884 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，使温度控制在22℃，继续进行保压保湿12 h。

步骤C抽真空干燥：打开真空泵，使真空压力为-0.793 bar ~ -0.851 bar，温度控制在22℃，抽真空干燥12 h后关闭真空泵，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后继续进行抽真空干燥12 h。

步骤D：重复步骤B中的保压保湿24 h和步骤C中抽真空干燥24 h，唯一的区别是循环过程中未添加水。

干燥结束后经称量最终得到3.591 kg门冬胰岛素原料药干品，该门冬胰岛素原料药干品仍然保持晶体结构状态，其晶体结构用透反两用偏光显微镜检测，结果参见附图2，且API在长期放置过程中，产品有关杂质增长较慢，产品质量稳定。取样检测门冬胰岛素纯度，纯度为99.25%（具体HPLC液相色谱图如图3所示，出峰时间为23.247min的主峰为门冬胰岛素原料药）。另外取上述门冬胰岛素原料药干品0.24074 g作为供试品，检测有机溶剂残留，结果乙醇溶剂残留为2403 ppm，乙腈、异丙醇、甲苯和苯溶剂残留均未检出（供试品溶液的GC气相色谱图如图4所示，加标供试品溶液的GC气相色谱图如图5所示，残留溶剂的峰面积如表1所示）。

表1

储备溶液的配置：

（1）乙醇储备溶液：精密称取乙醇747.99 mg，用二甲基亚砜(DMSO)配制成乙醇贮备溶液的溶度为29.9196 mg/mL。

（2）乙腈储备溶液：精密称取乙腈64.24 mg，用DMSO配制成乙腈贮备溶液的溶度为2.5696 mg/mL。

（3）异丙醇储备溶液：精密称取异丙醇767.84 mg，用DMSO配制成异丙醇贮备溶液的溶度为30.7136 mg/mL。

（4）甲苯储备溶液：精密称取甲苯125.33 mg，用DMSO配制成甲苯贮备溶液的溶度为5.0132 mg/mL。

（5）苯储备溶液：精密称取苯146.33 mg，用DMSO配制成苯贮备溶液的溶度为11.7064 μg/mL。

对照溶液的配置：分别取上述贮备溶液适量，用DMSO稀释，配制成乙醇对照溶液的浓度为299.196 μg/mL，乙腈对照溶液的浓度为25.696 μg/mL，异丙醇对照溶液的浓度为307.136 μg/mL，甲苯对照溶液的浓度为50.132 μg/mL，苯对照溶液的浓度为0.117 μg/mL。

供试品溶液的配置：类似上述方法，称取一定量的供试品，配成一定浓度的贮备溶液，用配制好的供试品贮备溶液配成供试品溶液。

加标供试品溶液的配置：类似上述方法，使用对照品贮备溶液和供试品贮备溶液按照一定比例混匀配制成加标供试品溶液。

按下列公式计算供试品中乙醇、乙腈、异丙醇和甲苯残留溶剂的量，以ppm计；

残留溶剂的含量百分比=4(C/W)[r_U/(r_ST-r_U)]

其中：

4：折扣系数；

C: 对照溶液中各残留溶剂的浓度，单位μg/mL；

W: 供试品的重量，单位g；

r_U: 供试品溶液中各残留溶剂的峰面积；

r_ST: 加标供试品溶液中各残留溶剂的峰面积。

根据计算公式4(C/W)[r_U/(r_ST-r_U)]，计算结果如下：

。

实施例2（水的加入量与药物的质量比为1:1）

步骤A：将门冬胰岛素湿固体(乙醇溶剂残留量为117ppb)5.8Kg装入托盘中，碾碎大的固体，控制湿固体的厚度为10.1 mm，放入真空干燥箱内，关闭箱门，开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为-0.939 bar ~ -0.991 bar。开加热器，过程控制温度为22℃，真空干燥24h，以除掉大部分容易去除的残留有机溶剂。

步骤B保压保湿：关闭真空阀，缓开放空阀，当真空压力降为零时，打开真空干燥烘箱门，碾碎大固体，进行翻料，翻料后在真空干燥箱内放入托盘并加入5.8Kg纯水，打开真空泵进行抽真空，使真空压力为-0.572 bar ~ -1.000 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，控制湿度在50%RH-80%RH，温度控制在22℃，12 h后，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后打开真空泵进行抽真空，使真空压力达到-0.867 bar ~ -0.884 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，使温度控制在22℃，继续进行保压保湿12h。

步骤C抽真空干燥：打开真空泵，使真空压力为-0.948 bar ~ -0.992 bar，温度控制在22℃，抽真空干燥12 h后关闭真空泵，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后继续进行抽真空12 h。

步骤D：重复步骤B中的保压保湿24h和步骤C中抽真空干燥24h，唯一的区别是循环过程中未添加水。

干燥结束后经称量最终得到3.564 kg门冬胰岛素原料药干品。该门冬胰岛素原料药干品仍然保持晶体结构状态，在API长期放置过程中，产品有关杂质增长较慢，产品质量稳定。检测门冬胰岛素纯度，纯度为99.19%（具体HPLC液相色谱图如图6所示，出峰时间为23.480min的主峰为门冬胰岛素原料药）；另外取上述门冬胰岛素原料药干品0.24060 g作为供试品，检测有机溶剂残留，乙醇溶剂残留为1068 ppm，乙腈、异丙醇、甲苯和苯溶剂残留均未检出（供试品溶液的GC气相色谱图如图7所示，加标供试品溶液的GC气相色谱图如图8所示，残留溶剂的峰面积如表2所示）。

表2

按实施例1所述公式计算供试品中乙醇、乙腈、异丙醇和甲苯残留溶剂的量，以ppm计；

根据计算公式4(C/W)[r_U/(r_ST-r_U)]，计算结果如下：

乙醇残留量=1068ppm。

实施例3(水分两次加入，水的加入总量与药物的质量比为1:2)

步骤A：将门冬胰岛素湿固体(乙醇溶剂残留量为117ppb)5.18Kg装入托盘中，碾碎大的固体，控制湿固体的厚度为9.5 mm，放入真空干燥箱内，关闭箱门，开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为-0.831 bar ~ -0.844 bar。开加热器，过程控制温度为22℃，真空干燥24h，以除掉大部分容易去除的残留有机溶剂。

步骤B保压保湿：关闭真空阀，缓开放空阀，当真空压力降为零时，打开真空干燥烘箱门，碾碎大固体，进行翻料，翻料后在真空干燥箱内放入托盘并加入1.3Kg纯水，打开真空泵进行抽真空，，使真空压力为-0.648 bar ~ -0.841 bar，控制湿度在50%RH-80%RH，温度控制在22℃，12 h后打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后打开真空泵进行抽真空，使真空压力达到-0.648 bar ~ -0.841 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，使温度控制在22℃，继续进行保压保湿12 h。

步骤C抽真空干燥打开真空泵，使真空压力为-0.842 bar ~ -0.883 bar，温度控制在22℃，抽真空干燥12 h后关闭真空泵，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后继续进行抽真空12 h。

步骤D：重复步骤B中的保压保湿24h和步骤C中抽真空干燥24h，循环过程中补加水1.3Kg。

干燥结束后最终得到4.184 kg胰岛素原料药干品。该门冬胰岛素原料药干品仍然保持晶体结构状态，在API长期放置过程中，产品有关杂质增长较慢，产品质量稳定。取样检测门冬胰岛素纯度，纯度为99.09%（具体HPLC液相色谱图如图9所示，出峰时间为23.349min的主峰为门冬胰岛素原料药）；另外取上述门冬胰岛素原料药干品0.24097 g作为供试品，检测有机溶剂残留，乙醇溶剂残留为2701 ppm，乙腈、异丙醇、甲苯和苯溶剂残留均未检出（供试品溶液的GC气相色谱图如图10所示，加标供试品溶液的GC气相色谱图如图11所示，残留溶剂的峰面积如表3所示）。

按下列公式计算供试品中乙醇、乙腈、异丙醇和甲苯残留溶剂的量，以ppm计；

表3

根据计算公式4(C/W)[r_U/(r_ST-r_U)]，计算结果如下：

乙醇残留量=2701ppm。

实施例4(水的加入量与药物的质量比为1:1.6)

步骤A：将门冬胰岛素湿固体（乙醇溶剂残留达到117ppb）6.33Kg装入托盘中，碾碎大的固体，控制湿固体的厚度为10.5 mm，放入真空干燥箱内，关闭箱门，开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为-0.872 bar ~ -0.839 bar。开加热器，过程控制温度为22 ℃。

步骤B保压保湿：关闭真空阀，缓开放空阀，当真空压力降为零时，打开真空干燥烘箱门，碾碎大固体，进行翻料，翻料后在真空干燥箱内放入托盘并加入3.96Kg纯水，关闭真空泵进行抽真空，使真空压力为-0.750 bar ~ -0.856 bar，控制湿度在50%RH-80%RH，温度控制在22℃进行保压保湿。12 h后打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后打开真空泵进行抽真空，使真空压力达到-0.867 bar ~ -0.884 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，使温度控制在22℃，继续进行保压保湿12 h。

步骤C抽真空干燥：打开真空泵，使真空压力为-0.823 bar ~ -0.883 bar，温度控制在22℃，11 h后关闭真空泵，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后继续进行抽真空11 h。

步骤D：重复步骤B中的保压保湿24h和步骤C中抽真空干燥24h，唯一的区别循环过程中未添加水。

干燥结束后最终得到4.673 kg门冬胰岛素原料药干品。该门冬胰岛素原料药干品仍然保持晶体结构状态，在API长期放置过程中，产品有关杂质增长较慢，产品质量稳定。取样检测门冬胰岛素纯度，纯度为99.14%（具体HPLC液相色谱图如图12所示，出峰时间为23.414min的主峰为门冬胰岛素原料药）；另外取上述门冬胰岛素原料药干品0.24114 g作为供试品，检测有机溶剂残留，乙醇溶剂残留为2227 ppm，乙腈、异丙醇、甲苯和苯溶剂残留均未检出（供试品溶液的GC气相色谱图如图13所示，加标供试品溶液的GC气相色谱图如图14所示，残留溶剂的峰面积如表4所示）。

表4

按下列公式计算供试品中乙醇、乙腈、异丙醇和甲苯残留溶剂的量，以ppm计；

根据计算公式4(C/W)[r_U/(r_ST-r_U)]，计算结果如下：

乙醇残留量=2227ppm。

实施例5（水的加入量与药物的质量比为1:3）

步骤A：将门冬胰岛素湿固体(乙醇溶剂残留量为117ppb)5.8Kg装入托盘中，碾碎大的固体，控制湿固体的厚度为20 mm，放入真空干燥箱内，关闭箱门，开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为-0.939 bar ~ -0.991 bar。开加热器，过程控制温度为10℃，真空干燥50 h，以除掉大部分容易去除的残留有机溶剂。

步骤B保压保湿：关闭真空阀，缓开放空阀，当真空压力降为零时，打开真空干燥烘箱门，碾碎大固体，进行翻料，翻料后在真空干燥箱内放入托盘并加入1.9Kg纯水，打开真空泵进行抽真空，使真空压力为-0.572 bar ~ -1.000 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，控制湿度在50%RH-80%RH，温度控制在10℃，25 h后，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后打开真空泵进行抽真空，使真空压力达到-0.867 bar ~ -0.884 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，使温度控制在10℃，继续进行保压保湿25 h。

步骤C抽真空干燥：打开真空泵，使真空压力为-0.948 bar ~ -0.992 bar，温度控制在10℃，抽真空干燥25 h后关闭真空泵，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后继续进行抽真空25 h。

步骤D：重复步骤B中的保压保湿50 h和步骤C中抽真空干燥50 h，唯一的区别是循环过程中未添加水。

干燥结束后经称量最终得到3.526 kg门冬胰岛素原料药干品。该门冬胰岛素原料药干品仍然保持晶体结构状态，在API长期放置过程中，产品有关杂质增长较慢，产品质量稳定。检测门冬胰岛素纯度，纯度为99.24%；另外取上述门冬胰岛素原料药干品0.24088 g作为供试品，检测有机溶剂残留，乙醇溶剂残留为2504 ppm，乙腈、异丙醇、甲苯和苯溶剂残留均未检出。

实施例6（水的加入量与药物的质量比为1:4）

步骤A：将门冬胰岛素湿固体(乙醇溶剂残留量为117ppb)5.8Kg装入托盘中，碾碎大的固体，控制湿固体的厚度为15 mm，放入真空干燥箱内，关闭箱门，开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为-0.939 bar ~ -0.991 bar。开加热器，过程控制温度为45℃，真空干燥5h，以除掉大部分容易去除的残留有机溶剂。

步骤B保压保湿：关闭真空阀，缓开放空阀，当真空压力降为零时，打开真空干燥烘箱门，碾碎大固体，进行翻料，翻料后在真空干燥箱内放入托盘并加入1.5Kg纯水，打开真空泵进行抽真空，使真空压力为-0.572 bar ~ -1.000 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，控制湿度在50%RH-80%RH，温度控制在45℃，5 h后，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后打开真空泵进行抽真空，使真空压力达到-0.867 bar ~ -0.884 bar，然后依次关闭真空阀和真空泵，使温度控制在45℃，继续进行保压保湿5 h。

步骤C抽真空干燥：打开真空泵，使真空压力为-0.948 bar ~ -0.992 bar，温度控制在45℃，抽真空干燥5 h后关闭真空泵，打开真空干燥箱，碾碎大的固体翻料一次，随后继续进行抽真空5 h。

步骤D：重复步骤B中的保压保湿5 h和步骤C中抽真空干燥5 h，唯一的区别是循环过程中未添加水。

干燥结束后经称量最终得到3.652 kg门冬胰岛素原料药干品。该门冬胰岛素原料药干品仍然保持晶体结构状态，在API长期放置过程中，产品有关杂质增长较慢，产品质量稳定。检测门冬胰岛素纯度，纯度为99.22%；另外取上述门冬胰岛素原料药干品0.24036 g作为供试品，检测有机溶剂残留，乙醇溶剂残留为1410 ppm，乙腈、异丙醇、甲苯和苯溶剂残留均未检出。

结果表明，实施例1~实施例6制备得到的门冬胰岛素原料药干品中乙醇残留量均明显低于药典标准中的5000ppm，且乙腈、异丙醇、甲苯和苯的残留量均未检出。

对比例1

大部分操作同实施例1，唯一的区别是步骤B中没有添加水，即未进行保湿处理，干燥后测定门冬胰岛素干品的纯度及有机溶剂残留情况，HPLC纯度为99.28%，其中乙醇溶剂残留数值为10900ppm，明显不符合中国药典标准要求（质量标准为NMT5000ppm），GC图谱如图15所示。

对比例2

大部分操作同实施例1，唯一的区别是步骤B中水的加入量为0.7Kg，干燥24h后发现水被蒸发干了，中间未及时添加水，干燥后测定门冬胰岛素干品的纯度及有机溶剂残留情况HPLC纯度为99.28%，其中乙醇溶剂残留数值为6300ppm，明显不符合中国药典标准要求（质量标准为NMT5000ppm），GC图谱如图16所示。

对比例3

大部分操作同实施例1，唯一的区别是步骤B中水的加入量为6Kg，干燥后测定门冬胰岛素干品的纯度及有机溶剂残留情况，HPLC纯度为99.14%，其中乙醇溶剂残留数值为2400ppm（质量标准为NMT5000ppm）GC图谱如图17所示。实验过程中发现门冬胰岛素乙醇残留溶剂虽然控制在中国药典标准范围内，但由于水加入量过多，门冬胰岛素明显出现发粘，湿度较大的现象，破坏了原本的晶型，最终得到门冬胰岛素无定型固体，用透反两用偏光显微镜检测，具体见图19；并且经过研究发现，门冬胰岛素无定型固体在后期存放过程中，其杂质增长比较快，导致色谱纯度下降迅速，产品质量不稳定。

对比例4

将门冬胰岛素湿固体放在托盘上，碾碎大的颗粒，铺平固体，使得厚度不超过10mm，放入冻干机内，罩上冻干机盖，随后开启预冻程序，-50℃预冻0.5 h-1 h，随后开启真空泵，打开真空阀，使真空压力为10 bar ~ 20 bar，冷阱温度控制在-50℃左右，冻干120h，最终得到门冬胰岛素无定型固体，在后期存放过程中，其有关物质增长比较快，产品不稳定。测定门冬胰岛素干品的纯度及有机溶剂残留情况，HPLC纯度为99.31%，其中溶剂残留数值为8400ppm，明显不符合中国药典标准要求（质量标准为NMT5000ppm），GC图谱如图18所示。

稳定性研究：

分别取适量实施例1、对比例3所得样品，采用双层药用低密度聚乙烯袋和一层铝塑复合袋包装，贮存于温度2℃~8°C条件下，分别在1、2、3和6个月进行评估，加速6个月的稳定性结果如下表5所示：

表5 加速6个月的稳定性结果

结果表明，实施例1的干燥工艺所得门冬胰岛素晶体产品，具有更好的稳定性，在2℃~8℃条件下放置6个月，HPLC色谱纯度基本没有变化且始终维持在99.2%以上（存在仪器检测误差）。而对比例3的干燥工艺所得门冬胰岛素无定性产品，在2℃~8℃条件下放置6个月，HPLC色谱纯度下降约1.6个百分点，由99.14%下降到97.59%，总杂明显增多，产品稳定性差，质量不稳定。

Claims (10)

1.一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A，将含有残留有机溶剂的门冬胰岛素湿固体放入真空干燥箱中进行抽真空干燥，控制干燥温度为10℃~45℃，干燥时间为5 h~50 h；

步骤B，往真空干燥箱中加入适量水，水的加入量与门冬胰岛素湿固体的质量比为1:1~1:5，再次抽真空使真空度达到一定水平后关闭真空阀，控制真空度为-0.5 bar~-1.0 bar，湿度为20%~90%，保压保湿，维持一段时间，控制干燥温度为10℃~45℃，保压保湿的时间为5h~50 h；

步骤C，继续抽真空干燥，控制干燥温度为10℃~45℃，干燥时间为5 h~50 h；

步骤D，重复步骤B中的保压保湿和步骤C，得到低残留溶剂、高纯度的门冬胰岛素原料药。

2.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：所述残留有机溶剂为醇类溶剂、腈类溶剂或芳香烃溶剂。

3.根据权利要求2所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：所述醇类溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇，所述腈类溶剂为乙腈，所述芳香烃溶剂为甲苯、苯。

4.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：所述步骤A中，门冬胰岛素湿固体的厚度为1 mm~30 mm。

5.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：所述步骤B中，水的加入量与门冬胰岛素湿固体的质量比为1:1.6~1:2.5。

6.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：步骤B中，水的加入方式为不与门冬胰岛素湿固体直接接触。

7.根据权利要求6所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：步骤B中，水的加入方式为通过托盘或其它能够提供水汽的载体放入真空干燥箱中。

8.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：步骤A或步骤C中的真空度为-0.70 bar~-1.0 bar。

9.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：所述步骤B或C中，包括翻料和碾碎的操作。

10.根据权利要求1所述的一种高效去除门冬胰岛素中残留有机溶剂的方法，其特征在于：所述步骤D中，重复步骤B和C 循环1~5次。

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