CN103396892B - 由胶体生成三酰基甘油 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了由已被从油产品中分离出的胶体来生成三酰基甘油的方法。胶体用具有PLC活性的酶处理，这导致二酰基甘油和磷酸酯的形成，并且用具有PLA活性的酶处理，这导致溶磷脂和游离脂肪酸的形成。然后，来自这两个分开的反应的二酰基甘油和游离脂肪酸在酶的存在下结合，生成新的三酰基甘油分子。

Description

由胶体生成三酰基甘油
本申请是申请日为2009年01月06日、申请号为200980107965.8、名称为“由胶体生成三酰基甘油”的发明申请的分案。
本申请要求2008年1月7日由Christopher L.G.Dayton提交的美国申请系列号11/970,270，名称为“由胶体生成三酰基甘油(GENERATION OFTRIACYLGLYCEROLS FROM GUMS)”的优先权。
发明背景
本发明涉及一种由从油精炼方法中回收的胶体来生成三酰基甘油的方法。更加特别地，本发明涉及处理来自植物油的各种磷脂和卵磷脂(共同被称作”胶体”)以生产或“生成”三酰基甘油(甘油三酸酯或油)的酶方法。本文描述的发明是基于2007年1月30日提交的美国专利申请系列号11/668,921和2007年9月11日提交的美国专利申请系列号11/853,339中公开的发明基础上进一步研发获得的，上述两者均受让给共同受让人，而且作为参考并入本发明中。
由压制或溶剂萃取方法获得的粗制植物油，是三酰基甘油、磷脂、固醇、生育酚、游离脂肪酸、微量金属、以及其它微量化合物的复杂混合物。为了生产口味平和、颜色浅且保质期长的优质色拉油，希望去除磷脂、游离脂肪酸和微量金属。被这样去除的磷脂被称作”胶体”，已经在现有技术中通过各种方法实现，包括水脱胶、酸脱胶、碱脱胶和酶脱胶。这些脱胶方法中的绝大部分包括随着胶体的分离的可观的油损耗。
前面提到的专利申请公开了通过用PLA酶和PLC酶两者处理油组合物而从油组合物中去除磷脂的方法。可以依序或同时用两种酶处理。令人吃惊地发现，两种酶一起使用时与任一种单独使用时相比，酶反应动力学比预期的进行得要快得多。此外发现，当两种酶一起使用时，即使反应条件对其中至少一种酶并非最优化，反应也进行得比预期更快。同时还发现两种酶一起使用时，反应可以在少于约一小时中进行，而且可以进行得快达约三十分钟。
PLA和PLC酶与油组合物的反应，预期会产生某些必须从被处理过的油中去除的反应副产物。这些副产物包括由PLC酶从磷脂分裂的含磷酸酯部分、由PLA酶从磷脂分裂的游离脂肪酸、和由游离脂肪酸从磷脂分裂而得到的溶磷脂。溶磷脂和任何含磷酸酯的副产物必须从被处理过的油组合物中去除，而且期望前面提到的其它反应副产物会与溶磷脂一起在被称作”胶体”的重部分中去除。
美国专利U.S5,061,498涉及一种重整脂肪和油的方法，其包含在少量水存在下用两种或更多种不同种类的脂肪酸特异性和/或位点特异性不同的脂肪酶来处理包含偏甘油酯的脂肪和油，以获得包含低含量偏甘油酯的脂肪和油。在公开的实施方案中，使用脂肪酶P是因为它会与甘油骨架上的三个位点中的任何一个反应。理想的脂肪酸，例如油酸可以被加入到包含偏甘油酯的组合物中，并使用特异于该理想的脂肪酸的脂肪酶，例如脂肪酶F。脂肪酶F的存在促进优选的脂肪酸的反应超过其它可能存在的脂肪酸，而脂肪酶P的存在促进了优选的脂肪酸在偏甘油酯上任何位点的酯化。水含量优选地低于1500ppm，特别是10到200ppm。
本发明的目的是提供一种处理分离的胶体以获得否则将会损耗掉的可用的油产品的方法。
发明概述
为促进在前面提到的两项专利申请中描述的工作，对已经从PLA/PLC处理过的油中分离的胶体进行分析。预期胶体将包含游离脂肪酸和二酰基甘油，其以与原始油组合物中存在的已经跟酶反应的磷脂量成比例的量存在。相反，令人吃惊地发现，实际存在比理论所预期的要少的游离脂肪酸和二酰基甘油。由这个令人吃惊的结果得出结论：游离脂肪酸和二酰基甘油分别是PLA和PLC与磷脂反应的副产物，它们在PLA和PLC酶的存在下彼此反应，形成有用的三酰基甘油，因此实际上生成PLA/PLC处理方法开始前不存在的新的油分子。因此，发现了不管这些磷脂是使用什么样的方法分离的，PLA和PLC酶的组合可以用来处理分离的磷脂，以生成新的三酰基甘油分子。
因此，本发明包括由油胶体生成三酰基甘油的方法，该方法包括(a)提供包含一定量油胶体的油组合物，所述胶体包含磷脂，(b)从所述油组合物中分离所述油胶体，以提供基本不含油胶体的第一部分和包含所述分离的油胶体的第二部分，(c)用一种或多种具有PLA活性的酶处理所述第二部分，以生成游离脂肪酸，和(d)用一种或多种具有PLC活性的酶处理所述第二部分，以生成二酰基甘油，从而所述脂肪酸和所述二酰基甘油在至少一种所述酶的存在下彼此反应，形成三酰基甘油。
附图说明
图1图示说明了磷脂和三酰基甘油的构型。
图2图示说明了磷脂的三个立体专一位点。
图3图示说明了可以附着在磷脂的磷酸酯部分的四种常见官能团的结构。
图4图示说明了酶对磷脂分子的四个不同的攻击位点。
图5图示说明了磷脂在PLA酶和水的存在下反应，产生溶磷脂和脂肪酸。
图6图示说明了磷脂在PLC酶和水的存在下反应，产生二酰基甘油和磷酸酯。
图7图示说明了磷脂酰胆碱的结构。
图8图示说明了含磷胆碱的结构。
发明详述
磷脂的去除产生了伴随植物油精炼的几乎全部损耗。如图1所示，磷脂在甘油骨架两端中的一端包含一个磷酸酯基团，而三酰基甘油包含三个脂肪酸。为了区分衍生物，采用立体专一编号(“Sn”)系统。图2描述了磷脂的三个立体专一位点。
磷脂的磷酸酯基团是“亲水的”或“好水的”，其含义为磷酸酯自身和官能团X两者都被水吸引。磷脂的脂肪酸链R1和R2是“亲脂的”或“好脂质的”，指它们都被脂质吸引。因为磷脂分子同时具有亲水的官能团和亲脂的脂肪酸链两者，因此其为杰出的天然乳化剂。当从植物油中去除磷脂时，磷脂的乳化性质将引起两个磷脂分子和一分子三酰基甘油被同时去除。
磷脂的在图1中用“X”指示的含磷酸酯官能团决定了其亲水性质的程度。图1中的官能团X可以为数个各种已知类型中的任一种，其中一些在图3中说明。
包含官能团-胆碱和-乙醇胺的磷脂对水具有最大的亲和性，而酸、酸式盐(例如钙、镁和铁)、以及肌醇对水具有低得多的亲和性。磷脂酸和磷脂酸的盐一般被称作“不可与水结合的磷脂”或NHP。磷脂在油中一般被检测为“磷含量”，其单位为每百万分之一。表1阐述了主要油籽作物中存在的典型磷脂量，以及各种官能团以油中存在的磷脂的百分比所示的分布。表2阐述了卵磷脂(大豆胶体)中存在的磷脂的典型分布。在表2中，“现状”指典型磷脂组合物，其与夹带的油(2分子磷脂和1分子油)一起从植物油中去除，产生的丙酮不溶物含量为67％。“标准化”指不存在任何油的磷脂组合物，产生的丙酮不溶物含量为100％。表3阐述了主要类型磷脂、溶磷脂、和相应的非脂质含磷化合物的分子量。表3中使用的和本申请中的术语溶磷脂，指其一个脂肪酸基团已经被脂肪酶分裂的磷脂。油酸的分子量是282.48，而其中的脂肪酸以油酸(C18:1)存在的二酰基甘油的分子量是620.99。
表1
来自常见油籽的油中的典型磷脂量和分布
大豆油 芥花籽油 葵花油
P(ppm) 400-1200 200-900 300-700
PC(-胆碱) 12％-46％ 25％-40％ 29％-52％
PE(-乙醇胺) 8％-34％ 15％-25％ 17％-26％
PA(-酸) 2％-21％ 10％-20％ 15％-30％
PI(-肌醇) 2％-15％ 2％-25％ 11％-22％
表2
大豆胶体的典型的磷脂量和分布
“现状”百分比 “标准化”百分比
磷脂酰胆碱 33.9 47.2
磷脂酰乙醇胺 14.3 19.9
磷酯酰丝氨酸 0.4 0.6
磷脂酸 6.4 8.9
磷脂酰肌醇 16.8 23.4
总计 71.8 100.0
表3
典型的磷脂和化合物的分子量
磷脂可以通过数个不同方法被部分或全部从植物油中去除，最常见的是水脱胶、酸脱胶、碱精炼、和酶脱胶。本发明的由胶体生成油的方法可以用在来源于任一这些方法的胶体上；为了说明的目的，酶脱胶将被更详细地解释。
酶脱胶，也被称作”酶精炼”，在目标为从油中全部去除磷脂时使用。一般地，酶脱胶处理的现有技术已经在先前已通过一种其它方法脱胶(典型地为水脱胶)的油上实践。为供食品应用，酶脱胶的油可以依序进行漂白和除臭，工业中称作”物理精炼”的方法。酶脱胶比水、酸或碱脱胶提供更高的油产量，从而提高经济效益。
酶反应通过从分子上分裂了不同的官能团，改变了磷脂的性质。官能团和分裂产物一般地可以被称作“脂肪原料”和“含磷原料”。酶反应降低了得到的磷脂的乳化性质，从而当胶体从油中分离时损耗更少的油，进而节省了油。对磷脂显示活性的酶一般被称作”磷脂酶”。磷脂酶的类型是基于酶与磷脂分子反应的位点划分的，而且被称作PLA1、PLA2、PLC和PLD。不同类型的磷脂酶与磷脂分子反应的位点在图4中说明。磷脂酶B是本领域已知的另外一种酶。它去除在溶磷脂的Sn-1或Sn-2位点(图2)上存在的最终脂肪酸。各种磷脂酶及其反应产物的概述在表4中阐述。
表4
脂肪原料 含磷原料
磷脂酶A1 脂肪酸 溶磷脂
磷脂酶A2 脂肪酸 2溶磷脂
磷脂酶B 脂肪酸 甘油磷脂
磷脂酶C 二酰基甘油 含磷酸酯的头基
磷脂酶D 醇 磷脂酸
每种类型的磷脂酶都有其本身的反应速率，以及其本身就pH、水含量和温度而言的最佳反应条件。PLA单独使用时一般需要至少约4小时的反应时间，而PLC单独使用时一般需要约一小时的反应时间。为了最小化不期望的油皂化反应，已知酶处理应当在pH低于或等于8时进行，但PLA的最佳反应pH是4.5，而PLC的最佳反应pH是7.0。每种酶也具有不同的热耐受性。PLA酶将在约50℃变性而PLC酶将在约65℃变性。
具有磷脂酶活性的氨基酸序列在文献中被广泛报道并在专利中被公开，而且其中一些据报道对植物油中存在的磷脂具有活性。这全都是本领域已知的。
具有磷脂酶活性的一种商业PLA1酶产品是Novozymes的磷脂酶A1Ultra。如Novozymes应用表油&脂肪#2002-185255-01和2002-05894-03中描述的，这一产品可以在4.5＜pH＜7.0和40℃＜T＜55℃条件下，与脱胶的油和1-1.5％水-柠檬酸-NaOH缓冲液混合。在该条件下，PLA1选择性地水解甘油骨架上的磷酸酯官能团对面的脂肪酸，以产生极性溶磷脂和极性脂肪酸。如图4所示，磷脂分子失去一个疏水性官能团，即脂肪酸，留下溶磷脂，其现在具有亲水的磷酸酯基团和亲水的醇基团。现在，带有两个亲水位点，溶磷脂分子是可溶于水的，而且失去了其乳化性质。因此，在水相从油相中分离时，溶磷脂在水相中被去除，而且与其一起没有任何油被去除，同时从磷脂分裂的脂肪酸分子留在油中。在现有技术方法中该脂肪酸分子将在随后的除臭过程中去除。PLA1脱胶方法通过不与水相中的溶磷脂一起去除任何中性油，因此降低了精炼损耗，这样去除的唯一物质是来源于原始磷脂分子的不期望的溶磷脂。
可以通过测定胶体中的磷脂总量、每种类型磷脂的量、和存在的每种类型的磷脂由磷脂转化成溶磷脂发生的最终分子量改变来计算通过胶体与PLA类型的酶反应可以生成的脂肪酸的理论量。磷脂含量百分比可以通过以每百万分之一单位来测量的磷元素水平乘以31(磷的分子量，30.97)并除以10000来计算。每种类型磷脂的量可以通过胶体总量乘以对特定类型的油已知的每种类型磷脂的正常分布来计算。最后，释放的脂肪酸的量可以由每种类型的磷脂决定。
例如，对包含800ppm磷的具有“标准化”磷脂分布(表2)的粗制大豆油，假设磷脂上附着的脂肪酸是油酸(C18:1)，预期释放的脂肪酸可以按如下计算：
首先计算存在的总磷脂的百分比。
总磷脂＝(800ppm/1,000,000)×31×100＝2.48％。
然后计算存在的每种类型的磷脂的量。
磷脂酰胆碱＝(2.48×47.21)/100＝1.17％
磷脂酰乙醇胺＝(2.48×19.92)/100＝0.49％
磷脂酰丝氨酸＝(2.48×0.56)/100＝0.01％
磷脂酰肌醇＝(2.48×23.40)/100＝0.58％
磷脂酸＝(2.48×8.91)/100＝0.22％
最后，通过PLA与胶体中的每种类型磷脂反应所释放的脂肪酸的量通过每种类型磷脂的量乘以释放的游离脂肪酸(FFA)的百分比决定，脂肪酸的百分比被计算为减掉溶磷脂的量后所留下的(参看表3)，如下：
来自PC的FFA＝1.17×(1-(521.67/786.15))＝0.39％
来自PE的FFA＝0.49×(1-(479.52/744.00))＝0.18％
来自PS的FFA＝0.01×(1-(522.56/787.03))＝0.00％
来自PI的FFA＝0.58×(1-(599.50/863.98))＝0.18％
来自PA的FFA＝(0.22×(1-(457.22/721.90)＝0.08％
预期生成的游离脂肪酸总量＝0.83％
虽然酶脱胶为油加工者提供了显著的优点，它也具有某些缺点。一个缺点是酶与磷脂的反应可能是缓慢而费时的。尤其，磷脂酶A酶与磷脂的反应可能花费许多小时，取决于反应变量例如pH、温度、相对浓度和混合条件。这样的长反应时间可能对酶脱胶方法的总经济价值产生显著的负面影响。因为PLA反应的缓慢，酶脱胶通常在已经先经历了水脱胶的油组合物上进行。因此，为获得就其预期用途而言具有足够低的磷水平的产品，油可能被脱胶两次。
本领域已知，如图6所示，PLC酶通过选择性水解磷酸酯官能团与磷脂反应。反应产生二酰基甘油(“DAG”)和磷脂基团。二酰基甘油分子不再具有磷酸酯官能团而且不再需要从油中被去除。例如，图7的磷脂酰胆碱(PC)与PLC的反应将产生DAG和图8所示磷酸酯官能团，其更普遍被称作含磷胆碱或“C”。PLC脱胶方法通过保留了可溶于油的DAG，而仅去除了可溶于水的磷酸酯官能团，降低了精炼损耗。去除水相时没有损耗中性油，因为磷脂已经被破坏。但是，PLC酶并不与油中存在的全部磷脂反应。尽管已知一种PI特异性PLC，被鉴定为PI-PLC，但PLC一般不与图3所示磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇(PI)反应。但PA和PI都是在水脱胶后留在油中的不可水合的磷脂。因此已经用PLC作为唯一的酶处理的油，必须用例如碱或其它酶进一步处理以去除残留的胶体。
可以通过测定油中的磷脂百分比、该类型油中每种类型磷脂的量、和粗制油中存在的每种类型的磷脂由磷脂转化成DAG发生的最终分子量改变来计算通过胶体与PLC类型的酶反应所生成的二酰基甘油的理论值。油中的磷脂含量百分比可以通过以每百万分之一单位来测量的磷元素水平乘以31(磷的分子量，30.97)并除以10000来计算。独立的磷脂可以通过胶体总量乘以每种类型磷脂的正常分布来计算。最后，可以测定作为每种类型磷脂的反应产物的二酰基甘油的量。
例如，对于含有800ppm磷的具有”标准化”磷脂分布(表2)的粗制大豆油，假设磷脂上附着的脂肪酸是油酸(C18:1)，预期释放的二酰基甘油可以按如下计算：
首先，按上文所述来计算每种类型的磷脂的百分比。
然后通过PLC与胶体反应所释放的每种类型的二酰基甘油(DAG)的百分比，可以通过每种类型磷脂的量乘以二酰基甘油的百分比(表3)来确定，DAG的量为减掉磷酸酯基团的量后所留下的，如下：
来自PC的DAG＝1.17×(1-(165.10/786.15))＝0.93％
来自PE的DAG＝(0.49×(1-(123.10/744.00)＝0.41％
来自PS的DAG＝(0.01×(1-(166.08/787.03)＝0.01％
来自PI的DAG＝(0.58×(1-(243.00/863.98)＝0.42％
来自PA的DAG＝(0.22×(1-(100.92/721.90)＝0.19％
生成的二酰基甘油总量＝1.96％
本发明涉及磷脂和含磷油组合物的酶处理，以生成新的三酰基甘油分子。发明人发现，令人吃惊的是，使用具有PLA活性和PLC活性的磷脂酶组合，不仅会分裂特定“基团”，还重新结合了来自PLA反应的分裂的脂肪酸(FA)和来自PLC反应的二酰基甘油(DAG)，产生甘油三酸酯或油。特别地，磷脂酶A(PLA)与磷脂分子反应，产生FA和溶卵磷脂，而磷脂酶C(PLC)与不同的磷脂分子反应，产生DAG和含磷卵磷脂。来自PLA反应的FA和来自PLC反应的DAG随后在一种或多种酶的存在下通过酯化结合，产生新的三酰基甘油(TAG)分子。
当用来进一步处理已经通过方法(例如水精炼、酸精炼或碱精炼、或除PLA和PLC酶组合以外的酶精炼)被从粗制油中去除的胶体时，本发明是特别有用的。据信，在进行本发明的油生成步骤之前把胶体的pH调节到约8或更低，对已通过碱精炼分离的胶体而言是有益的。
可以依照本发明来处理的油，可以包括但不限于以下油：芥花籽油、蓖麻油、椰子油、芫荽籽油、玉米油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果核油、白芒花籽油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈软脂、花生油、油菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、大豆油、葵花籽油、塔尔油、椿油和植物油，以及以上油的任何组合。
在本发明的方法中使用的磷脂酶A酶，可以是磷脂酶A1酶或磷脂酶A2酶。在本发明中使用的磷脂酶C酶，可以是磷脂酶C和/或肌醇特异性磷脂酶C。磷脂酶A和磷脂酶C家族中的许多种类的酶是可商业购买的；而且预期这样的酶及其等价物将适合在本发明中使用。
在本发明的方法中，在本发明的酶脱胶方法中一起使用的不同磷脂酶可以在加入到要处理的油中之前混合在一起。或者，它们可以依序或同时，分别加入到油中。
本发明的脱胶方法在pH低于约8下进行，优选地在约3-7之间，而且更加优选地在约4-5之间。酶脱胶方法的pH值可以通过加入已知缓冲液来达到。柠檬酸和氢氧化钠是公知的适合这一目的的。其它缓冲剂可以在需要时使用，以在特定反应条件下调节pH。
本发明的酶脱胶方法的温度范围可以为约40-80℃，优选的范围为约40-60℃，而更加优选的范围为约45-55℃。已经发现，令人吃惊的是，在本发明的方法中，PLA脱胶可以在温度高于其自身最佳的45℃下进行，而且与PLC的最佳工作温度接近，没有过度变性。
在油生成过程已经在胶体上完成且新生成的油已经从胶体分离后，按照新生成的油产品预期的最终用途所需要的或理想的，新生成的油可以进行本领域已知的进一步加工步骤，例如漂白或除臭。
与使用现有技术的条件的对照实施例一起，本发明的各种优选的实施方案在下面的实施例中阐述。在下面各个实施例中，顶置式搅拌器是带平叶桨的Heidolph搅拌器型号Elector KG；正常搅拌在90rpm下运转而剧烈搅拌在350rpm下运转。离心机是De Laval Gyro-Tester，其安装了供连续分离的“转鼓单元”。离心机转鼓用安装的螺栓封闭。剪切混合用带G450转子定子的Ultra-Turrax均质器SD-45在10,000rpm下完成。PLA1酶为丹麦NovozymesA/S出售的Ultra(批号LYN05007)。PLC酶为加利福尼亚San Diego的Verenium Corporation出售的PurifineTM(PLC批号90BU002A1或90BU004A1)。处理过的油中残留的磷脂的量依照美国油脂化学家学会法定方法Ca 20-99，“Analysis of Phosphorus in Oil by Inductively Coupled PlasmaOptical Emission Spectroscopy”的方法来测量，其以ppm P为单位。游离脂肪酸(FFA)使用美国油脂化学家学会法定方法Ca5a-40来测量。水分使用美国油脂化学家学会法定方法Ca2c-25来测量。中性油使用下面的附录中阐述的方法来测量。包括磷脂的丙酮不溶物使用美国油脂化学家学会法定方法Ja4-46来测量。酸价使用美国油脂化学家学会法定方法Ja6-55来测量。P-31NMR方法和通过带有蒸发光散射检测器的高效液相色谱(HPLC-ELSD)对二酰基甘油(DAG)的测量，通过如Verenium Corporation(后来被称作Diversa Corporation)在美国油脂化学家学会2007年会议上“Analytical Profiling of Smail ScaleReactions of phospholipase-C mediated Vegetable Oil Degumming”报道的方法来进行。
下面的实施例中，除了酶脱胶的油中存在的游离脂肪酸(FFA)和二酰基甘油的值是通过上面阐述的而且包含在本发明中的方法所测量外，实施例1-10直接相应于前面提到的2007年9月11日提交的美国专利申请系列号11/853,339的实施例13、14、18、23、24、27、29、31、33和36。
实施例1
1999.1克含有769.5ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。在正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为40℃，然后加入2.4毫升的4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH5.0的弱缓冲液。将温度保持在40℃，加入1.5008克VereniumPurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)，接着加入30克去离子水，全部混合物剪切混合120秒。油混合物以正常速度搅拌60分钟。将温度保持在40℃，加入0.2132克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，全部混合物剪切混合120秒。油混合物在温度40℃下以正常速度搅拌60分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。在经PLC并随后经PLA1依序脱胶的油中残留的磷为6.5ppm，FFA为0.56％，而DAG为0.69％。
实施例2
2010.5克含有785.1ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下冷却到60℃。将温度保持在60℃，加入1.5316克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)和0.2073克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，接着加入30克去离子水，全部混合物剪切混合45秒。油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌60分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1结合的酶混合物中的残留的磷在中性pH下产生具有109.6ppm残留磷的脱胶的油。FFA为0.61％，而DAG为0.74％。
实施例3
2005.3克含有742.9ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为60℃，然后加入2.4毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH5.0的弱缓冲液。将温度保持在60℃，加入0.7491克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)，接着加入60克去离子水，全部混合物剪切混合45秒。油混合物以正常速度搅拌60分钟。将温度保持在60℃，加入0.1220克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，全部混合物剪切混合45秒。油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌60分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。在经PLC并随后经PLA1依序脱胶的油中残留的磷为2.2ppm。发现FFA为0.58％，而DAG为0.42％。
实施例4
2002.0克含有747.3ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为60℃，然后加入1.8毫升的4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。将温度保持在60℃，加入2.2194克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)，接着加入60克去离子水，全部混合物剪切混合120秒。油混合物以正常速度搅拌15分钟。将温度保持在60℃，加入0.2198克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，全部混合物剪切混合120秒。油混合物在温度60℃下以正常速度搅拌15分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。在经PLC并随后经PLA1依序处理的脱胶的油中残留的磷为4.6ppm残留磷。FFA为0.37％，而DAG为0.42％。
实施例5
2000.8克含有747.3ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为50℃，然后加入1.8毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。将温度保持在50℃，加入2.2500克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)，并加入0.2216克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，接着加入90克去离子水，全部混合物剪切混合45秒。油混合物在温度50℃以正常速度搅拌120分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1结合的酶混合物中的残留的磷产生具有1.8ppm残留磷的脱胶的油。FFA为0.67％，而DAG为0.40％。
实施例6
2010.0克含有810.8ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下冷却到50℃。将温度保持在50℃，加入2.2608克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)，接着加入30克去离子水，全部混合物剪切混合60秒。油混合物以正常速度搅拌60分钟。将温度保持在50℃，加入0.1172克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，全部混合物剪切混合60秒。油混合物在温度50℃以正常速度搅拌60分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1依序处理的脱胶的油中残留的磷在中性pH下具有72.6ppm残留磷。FFA为0.53％，而DAG为1.03％。
实施例7
2006.3克含有795.3ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为50℃，然后加入2.4毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH5.0的弱缓冲液。将温度保持在50℃，加入1.5373克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)和0.1168克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，接着加入90克去离子水，全部混合物剪切混合120秒。油混合物在温度50℃下以正常速度搅拌30分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1结合的酶混合物中的残留的磷在pH5.0下产生具有1.9ppm残留磷的脱胶的油。FFA为0.17％，而DAG为0.42％。
实施例8
2003.6克含有784.8ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为40℃，然后加入1.8毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。将温度保持在40℃，加入1.4603克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)和0.1021克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，接着加入40克去离子水，全部混合物剪切混合120秒。油混合物在温度40℃以正常速度搅拌120分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1结合的酶混合物中的残留的磷在pH4.5下产生具有10.7ppm残留磷的脱胶的油。发现FFA为0.48％，而且发现DAG为0.83％。
实施例9
2000.4克含有697.7ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为40℃，然后加入1.8毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。将温度保持在40℃，加入1.508克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)和0.1022克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，接着加入90克去离子水，全部混合物剪切混合120秒。油混合物在温度40℃下以正常速度搅拌30分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1结合的酶混合物中的残留的磷在pH4.5下产生具有2.2ppm残留磷的脱胶的油。FFA为0.20％，而DAG为0.41％。
实施例10
1999克含有695.1ppm磷的粗制大豆油在使用顶置式搅拌器正常搅拌下加热到75-80℃。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并剪切1分钟。用顶置式搅拌器对油正常搅拌1小时。正常速度搅拌下，让油冷却，直到油温为60℃，然后加入1.8毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物剪切混合10秒。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。将温度保持在60℃，加入1.5296克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU002A1)和0.1241克Novozymes的Ultra(PLA1脂肪酶批号LYN05007)，接着加入90克去离子水，全部混合物剪切混合120秒。油混合物在温度60℃以正常速度搅拌30分钟。然后离心经酶处理的油；并收集分离的油和湿胶。PLC和PLA1结合的酶混合物中的残留的磷在pH4.5下产生具有5.2ppm残留磷的脱胶的油。发现FFA为0.36％，而DAG为0.44％。
引用的在先专利申请中的发明的焦点是开发酶脱胶方法，其具有的反应条件用最少量的加工助剂、设备和时间，得到最低的可能残留磷值。一旦实验完成并且所有随后的分析测试完成后，令人吃惊地发现，油中生成的脂肪酸和二酰基甘油的量并不与应当产生的理论水平相匹配。假设所有PC和PE都与PLC反应，则预期DAG含量会增加约1.16到1.35％，其取决于初始磷脂含量。假设PLA1酶与所有磷脂都反应，则预期FFA含量会增加约0.77到0.83％，其再次取决于初始磷脂含量。另外，如果PLC与所有的PC和PE反应，然后因为残留的磷脂与PLA反应，对以上实施例，预期的FFA增加会是大致0.53到0.59％。DAG的最大增加为0.63％，伴随的脂肪酸增加为0.12(实施例6)，两者都远低于期望水平。
为了检测胶体是否与水结合且经物理去除、和每种酶反应的范围、以及一种酶是否比另一种酶反应占优势，对以上实施例1-10进行分离的重相或“胶体”的分析。表5是通过P-31NMR对分离的重相进行的磷脂组合物/分布分析的汇编，其表明了未反应磷脂的量、溶磷脂的量、和游离磷酸酯的量，所有的量都以样本的重量百分比来表述。(注意：由于样本微生物变质，实施例6不存在磷脂数据。)
表5
例 PC PE PI PA 溶-PC 溶-PE 溶-PI 溶-PA “C” “E” “I” “A”
1 0.00 0.00 1.73 0.00 1.81 0.22 5.71 7.01 3.82 2.75 0.00 0.81
2 0.00 0.00 0.19 0.00 1.43 2.27 6.11 4.22 4.56 3.40 0.00 0.82
3 1.02 0.00 2.77 0.00 9.55 0.21 8.30 13.25 2.47 1.34 0.00 0.50
4 0.99 0.00 4.76 0.95 5.28 0.32 5.93 10.81 3.73 1.81 0.00 0.49
5 1.62 0.00 3.35 0.78 12.29 0.21 8.28 11.91 1.49 0.89 0.00 0.46
6 - - - - - - - - - - - -
7 0.00 0.16 1.10 0.00 1.32 0.38 5.35 1.24 3.56 2.95 0.00 0.93
8 0.00 0.15 1.08 0.00 1.60 0.67 6.37 1.98 4.37 3.57 0.00 1.33
9 0.08 0.00 3.03 0.00 1.93 0.08 5.07 10.80 3.85 2.58 0.00 0.84
10 2.09 0.00 4.26 0.00 7.22 0.24 6.90 12.81 2.06 1.14 0.00 0.49
实施例1为在pH5下依序加入酶，让PC和PE先与PLC酶反应，然后让PI、PA、以及任何残留的PC和PE与PLA1酶反应。在PLA酶加入前，PLC酶在40℃下与油接触60分钟，因此让该酶与油中存在的所有PC和PE反应，从而不存在PLA酶的竞争。初始PLC反应后，加入PLA，这样PLA可以水解油中存在的残留磷脂。残留的磷，如上面记录的，成功降低到6.5ppm。初始油具有0.40％的DAG含量和0.41％的FFA，相比之下最终的油含有0.69％DAG和0.56％FFA。如果两种酶都与特定的磷脂反应，那么DAG应当增加1.29％至1.69％，而FFA应当增加0.55％至0.96％。实际发现DAG仅增加了0.29％，而FA仅增加了0.15％。胶体P-31NMR分析显示，除了PI外，所有的原始磷脂都被水解。存在显著量的溶-PI和溶-PA，以及较少量的溶-PC和溶-PE。含磷种类“C”、“E”也存在于回收的胶体中，含磷种类“A”也一样，这是令人吃惊的，因为已经报道了PLC不与PA反应。另外，没有检测到含磷肌醇。将胶体中发现的分布与原始油比较，消失了1.0％DAG和0.40％FA！
实施例2为在pH7下同时加入酶并加入1.5％的水，45秒剪切混合。两种酶在60℃下与油接触60分钟，因此酶存在彼此竞争。离心的油具有109.6ppm的残留磷；DAG增加了0.34％，而FFA增加了0.20％。收集的胶体的P31-NMR分析检测到仅有少量的PI存在，而且没有PC、PE和PA。因此，全部原始磷脂都反应了。除了“I”，胶体中检测到显著量的溶磷脂和含磷种类。令人吃惊地发现，与实施例1相比，DAG仅轻微增加，但“C”和“E”的量大于实施例1中发现的量。
实施例3为在pH5下依序加入酶并加入3％的水，并在60℃下在每种酶加入后进行45秒剪切混合。在PLA酶加入前，PLC酶与油接触60分钟，而且让两种酶再反应60分钟。离心的油包含2.2ppm磷；DAG基本上没有增加(0.40到0.42％)，而FFA仅增加了0.17％。将实施例3收集的胶体与实施例2相比较，溶磷脂种类存在较大的增加，而含磷种类全部都降低了。这些结果表明，在这些条件下，即使PLC是先加入的，PLA反应比PLC反应占优势。基于初始磷脂的消失和反应产物的出现，DAG和FFA的量应当远远大于完成的油中所存在的！
实施例4为在pH4.5下依序加入酶并加入3％的水，并在60℃下在每种酶加入后剪切混合120秒。在PLA酶加入前，PLC酶与油接触15分钟，而且让两种酶再反应15分钟。离心的油仅包含4.6ppm磷，DAG仅增加了0.02％，而FFA下降了0.04％。收集的胶体的评估显示，一些PC、PA和PI没有被水解。考虑到与酶接触受限，溶磷脂和含磷种类不像实施例3中发现的那样高，但仍然升高。
实施例5为在pH4.5下同时加入酶并加入4.5％的水，45秒剪切混合。两种酶在50℃下与油接触120分钟，因此酶在全部反应期间彼此竞争。离心的油具有1.8ppm的残留磷；DAG一点都没有增加，而FFA增加了0.26％。与前面四个实施例相比，分析的胶体显示溶磷脂种类的量出现大的增加，而含磷种类的量出现下降，其表明在反应混合物中PLA比PLC占优势。
实施例6为在pH7下依序加入酶。在PLA酶加入前，PLC酶在50℃与油接触60分钟，因此让此酶与油中存在的全部PC和PE反应，且不需与PLA酶竞争。在初始的PLC反应后，加入PLA，这样PLA可以水解油中存在的残留磷脂。残留的磷，如先前报告的，仅降低到72.6ppm。初始的油具有0.40％的DAG含量和0.41％的FFA含量，而最终的油含有1.03％的DAG和0.53％的FFA。如果两种酶都与特定的磷脂反应，则DAG应当增加1.36％至1.76％，而FFA应当增加0.57％至共计0.98％。实际发现DAG增加了0.63％，而FFA仅增加了0.12％。由于样本发生微生物变质，得不到胶体的P-31NMR分析结果。
实施例7为同时加入酶。酶在温度50℃和pH5下与4.5％的水和油样本接触总计仅30分钟。油中的残留磷仅为1.9ppm。溶磷脂种类全部降低，特别是溶-PC。含磷种类全部为实施例5胶体分析中发现的两倍，其表明在这些条件下PLC比PLA占优势。但是，DAG含量与初始油相比基本上没有增加(0.40到0.41％)，同时FFA并没有增加到预期的总量0.98％，而是实际降低了0.24％，总FFA为0.17％！
实施例8为在pH4.5下同时加入酶并加入2％的水，进行120秒剪切混合。两种酶在40℃下与油接触120分钟，因此酶在全部反应期间彼此竞争。离心的油具有13.3ppm的残留磷；DAG增加了0.43，而FFA增加了0.07％。溶磷脂种类全部降低了，而含磷种类仍然比实施例7中的那些要高。
实施例9与实施例8中的反应类似，但在同时的酶反应中，加入4.5％的水而不是2％的水，而且酶接触时间是30分钟而不是120分钟。油中的残留磷为2.2ppm。油中存在的DAG的量基本上与初始油中的保持一致，而FFA由初始油中的量降低了0.21％。低的残留磷水平和所有溶磷脂种类的量提高，特别是溶-PA，表明了高的PLA酶活性。由此预期在反应过程中应当生成非常大量的FFA。含磷种类与实施例8相比轻微降低，但依照胶体中存在的含磷种类的量，DAG应当显著升高。
实施例10为在pH4.5下同时加入酶并加入4.5％的水，进行120秒剪切混合。酶在60℃下与油接触30分钟。油中残留的磷为5.2ppm。油中存在的DAG的量基本上与初始油中的保持一致(0.40至0.44)，而FFA由初始油中的量降低了0.05％；同时与实施例3保持大致相同量的胶体中的副产物。实施例3和10的反应条件是不同的，但就得到的含磷种类、DAG和FFA而言，结果是大致相同的，其表明反应对形成TAG是非常稳健的。
下面的表6总结了上述各个实施例1-10的初始油中的：初始磷、DAG和FFA，以及处理过的油中存在的DAG和FFA的理论值(如果初始油中的所有磷脂都与酶反应)，和处理过的油中的磷、DAG和FFA的测量值。
表6
*理论DAG仅包括由磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺生成的。
**理论FFA仅包括由磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸生成的。
胶体P-31NMR分析确认了，如在“正常”水和/或酸脱胶方法中一样，胶体没有与水结合并从油中被物理分离，但是被PLC和PLA酶水解。分析确认了分裂的含磷种类的形成和溶-卵磷脂的产生(表5)。但是，没有解释为什么处理过的油中DAG和FFA水平降低。现有技术中未能找到说明为什么显著量的DAG和FFA似乎消失了的信息。
Dayton等的美国专利申请系列号11/668,921和美国专利申请系列号11/853,339公开了一种用酶组合从植物油中去除各种磷脂以生产脱胶的油的酶方法，其中反应时间可以为一小时或更少。发明人揭示了PLC酶和PLA酶之间的协同效应，将反应的动力学由酶单独使用时的二到六小时提高到两种酶一起使用时的一小时或甚至更少。
本发明是建立在这些处理过的油的这些随后分析中所发现的DAG和FFA水平出乎意料地低的基础上的。基于这些结果，本发明在此展示发现：PLA和PLC显然在包含磷脂和其PLA/PLC水解副产物的脂质基质中协同相互作用以产生三酰基甘油。不愿受限于理论，相信来自PLC水解的分裂的二酰基甘油副产物和来自PLA水解的分裂的脂肪酸，在酶脱胶方法条件下结合，创造了新的三酰基甘油。提出如下理论：两种酶的接近或定位、或两者，允许在反应水相中释放二酰基甘油和脂肪酸的过程中形成三酰基甘油。
另外一系列实施例在使用如以前的现有技术中描述的传统水脱胶方法处理的粗制大豆油产生的胶体上进行。湿胶直接由工业水脱胶方法获得。湿胶被用作原材料，以排除油中存在的主要的三酰基甘油，同时保持可能在“典型”脱胶基质中存在的所有其它次要成分。胶体的P-31NMR分析仅检测到磷脂酰种类，没有检测到溶磷脂或含磷种类。磷脂组合物数据在下面表7中列举。由工业水脱胶方法获得的胶体，其二酰基甘油含量为1.5％。
两个对照实施例在每种酶的最佳反应条件下实施，以确定基础情况，供实验的进一步分析。第一个对照在适合磷脂酶C酶的中性pH下进行，而第二个实验在对磷脂酶A酶最佳条件，pH4.5下进行。
实施例11
对照：在中性pH下的磷脂酶C(PLC)-将50克大豆湿胶加入到500ml圆底烧瓶中。加入10克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU004A1)。原料用顶置式桨叶搅拌器混合，其配置了不锈钢圆桨叶以适合烧瓶的曲率，速率约150rpm。用覆盖烧瓶以防止水的蒸发。湿胶和酶在连续搅拌下加热到45℃。系统保持八小时。然后拆卸装置，并收集被水解的胶体。将胶体放置到离心管中，并在5000rpm离心15分钟，以将轻相(“油”)从重相(“胶体”)中分离。
回收的油中的DAG含量被测定为32.6％，与1.5％的初始DAG相比，相差31.1％。DAG含量的巨大增加是与PLC反应一致的，其中DAG并不进一步反应。重相P31-NMR分析获得的磷脂谱，确认了磷脂酰基团已经被水解为含磷基团。出乎意料地，检测到少量的“I”，以及少量的所有溶磷脂基团。因此在这一实施例的反应条件下PLC确实具有部分的PLA活性。
实施例12
对照：在pH4.5下的磷脂酶A(PLA)-将50克大豆湿胶加入到500ml圆底烧瓶中。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并混合5分钟。然后加入1.8毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物混合另外5分钟。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。加入2克Novozymes的(PLA1脂肪酶批号LYN05007)。原料用顶置式桨叶搅拌器混合，其配置了不锈钢圆桨叶以适合烧瓶的曲率，速率约150rpm。用覆盖烧瓶以防止水的蒸发。湿胶和酶在连续搅拌下加热到45℃。系统保持八小时。然后拆卸装置，并收集被水解的胶体。将胶体放置到离心管中，并在5000rpm离心15分钟，以将轻相(“油”)从重相(“胶体”)中分离。
回收的油中的DAG含量被测定为含有3.8％，其增加了2.3％。重相P31-NMR分析获得的磷脂谱，确认了磷脂酰基团水解为对应的溶磷脂基团，这是与PLA反应一致的。检测到非常少量的“C”和“E”以及“A”。PLA不具有任何显著的PLC活性。
实施例13
在中性pH下的PLA-将50克由工业脱胶离心获得的大豆湿胶加入到500ml圆底烧瓶中。加入2克Novozymes的(PLA1脂肪酶批号LYN05007)。原料用顶置式桨叶搅拌器混合，其配置了不锈钢圆桨叶以适合烧瓶的曲率，速率约150rpm。用覆盖烧瓶以防止水的蒸发。湿胶和酶在连续搅拌下加热到45℃。系统保持八小时。然后拆卸装置，并收集被水解的胶体。将胶体放置到离心管中，并在5000rpm离心15分钟，以将轻相(“油”)从重相(“胶体”)中分离。回收的油中的DAG含量被测定为含有2.6％，仅增加了1.1％DAG。磷脂谱显示所有“原始”胶体都被水解，但与实施例12中的对照条件相比，发现溶磷脂和含磷衍生物的量降低。这表明在该实施例的反应条件下，PLA酶不生成DAG、油、或含磷种类，但确实生成溶磷脂种类和脂肪酸。
实施例14
在中性pH下的PLC和PLA-将50克由工业脱胶离心获得的大豆湿胶加入到500ml圆底烧瓶中。加入10克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU004A1)和2克Novozymes的(PLA1脂肪酶批号LYN05007)。原料用顶置式桨叶搅拌器混合，其配置了不锈钢圆桨叶以适合烧瓶的曲率，速率约150rpm。用覆盖烧瓶以防止水的蒸发。湿胶和酶在连续搅拌下加热到45℃。系统保持八小时。然后拆卸装置，并收集被水解的胶体。将胶体放置到离心管中，并在5000rpm离心15分钟，以将轻相(“油”)从重相(“胶体”)中分离。
与只使用PLC时获得的32.6％DAG含量相比，回收的油中的DAG含量被测定为仅含7.8％。磷脂谱确认了所有磷脂酰基团都被水解为含磷基团和溶磷脂基团。除了“I”的量轻微降低外，检测到与实施例11中检测到的大致相同量的含磷基团“C”、“E”和“A”。溶-PE轻微降低而溶-PC和溶-PA都是实施例11中发现的量的大致2倍，但不是大的增加。溶-PI和溶-PA的量比实施例11中发现的量显著升高，因为PLA也在反应基质中并将PI和PA转化成其溶磷脂形式。
P-31NMR分析不仅确认了与对照实施例11中约相同量的磷脂发生PLC转化成其含磷基团，还确认了残留的磷脂酰基团被转化成其溶磷脂形式，表明了PLA转化。这是令人吃惊的结果，因为该pH条件不是对PLA转化最佳的。油中存在的DAG量应当大致为33％，而不是HPLC分析测定的7.8％！
实施例15
在pH4.5下的PLC和PLA-将50克由工业脱胶离心获得的大豆湿胶，加入到500ml圆底烧瓶中。加入2.0克的50％w/w柠檬酸溶液，并混合5分钟。然后加入1.8毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物混合另外5分钟。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。加入10克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU004A1)和2克Novozymes的(PLA1脂肪酶批号LYN05007)。原料用顶置式桨叶搅拌器混合，其配置了不锈钢圆桨叶以适合烧瓶的曲率，速率约150rpm。用覆盖烧瓶以防止水的蒸发。湿胶和酶在连续搅拌下加热到45℃。系统保持八小时。然后拆卸装置，并收集被水解的胶体。将胶体放置到离心管中，并在5000rpm离心15分钟，以将轻相(“油”)从重相(“胶体”)中分离。
回收的油的DAG含量与实施例14中相同，为7.8％。磷脂谱确认，如实施例12到14中一样，所有磷脂酰基团完全水解为含磷和溶磷脂基团。检测到与实施例11中检测到的大致相同量的含磷基团“C”、“E”、“I”和“A”。溶-PC和溶-PE比实施例11中发现的量显著升高。跟实施例13一样，溶-PI和溶-PA的量比实施例11中发现的量显著升高，因为PLA也在反应基质中并将PI和PA转化成其溶磷脂形式。如脱胶实施例1到10中一样，实际发现的DAG量低于基于P-31NMR分析而预期的量，这表明生成的DAG和FFA在随后的TAG生成中被消耗。
P-31NMR分析不仅确认了与对照实施例11中约相同量的磷脂发生PLC转化成其含磷基团，还确认了残留的磷脂酰基团被PLA转化成其溶磷脂形式。油中存在的DAG量应当大致为33％，而不是HPLC分析测定的7.8％！
表7总结了通过P31NMR获得的磷脂谱，所有数字表述为由实施例11-15的反应混合物分离的重相的重量％，其显示了未反应的磷脂酰部分、通过PLA转化生成的溶磷脂基团、和通过PLC转化生成的含磷基团。
表7
下面的表8总结了上面各个实施例11-15的初始胶体中的初始DAG和酸价(AV)，以及最终的油中存在的DAG和FFA的理论值(如果初始油中的所有磷脂都与酶反应)，和最终油中存在的实际DAG。由于FFA测量方法需要的油比从这些实验中可得到的要多，因此最终的FFA没有被测量。在每个这些实施例中，在回收的油中都发现DAG比预期要少，其进一步支持了结论：DAG与FFA反应生成TAG，从而消耗了DAG。
表8
*理论DAG仅包括由磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺生成的。
**理论FFA包括当PLA反应时，由所有磷脂生成的。当PLC和PLA一起反应时，仅计算来自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和磷脂酸的FFA。
***酸价(AV)是中和一克样本中的酸所必需的氢氧化钾毫克数(1)。AV是磷脂和游离脂肪酸两者贡献的可滴定酸度的表征(2)。
****因为进行滴定需要大量样本，因此没有测量FFA。
除了规模为两倍之外，下面的实施例16在方法步骤方面与实施例15完全相同。这一实施例的目的是在PLA/PLC酶反应之前和之后对全部样本执行质量平衡，以证实三酰基甘油由磷脂PLA/PLC水解的反应副产物生成。
实施例16
在pH4.5下的PLC和PLA-将100克由工业脱胶离心获得的大豆湿胶加入到500ml圆底烧瓶中。加入4.0克50％w/w柠檬酸溶液，并混合5分钟。然后加入3.6毫升4摩尔氢氧化钠溶液，混合物再混合5分钟。柠檬酸和碱形成pH4.5的弱缓冲液。加入20克Verenium的PurifineTM(PLC脂肪酶批号90BU004A1)和4克Novozymes的(PLA1脂肪酶批号LYN05007)。原料用顶置式桨叶搅拌器混合，其配置了不锈钢圆桨叶以适合烧瓶的曲率，速率约150rpm。用覆盖烧瓶以防止水的蒸发。湿胶和酶在连续搅拌下加热到45℃。系统保持八小时。分析“现状”初始胶体和酶处理过的混合物两者的样本的水分、胶体百分比和中性油含量。中性油含量通过下面附录中阐述的方法测量。然后分析分离的中性油的二酰基甘油含量。结果在表9中列出。
表9
初始胶体 酶处理过的胶体
水分(％) 24.0 32.7
胶体百分比(“现状”) 55.8 27.3
胶体百分比(“干”) 73.4 41.4
中性油百分比(“现状”) 20.2 38.7
中性油百分比(“干”) 26.5 58.6
DAG(％) 1.5 13.2
初始湿胶分析典型地应用于由大豆油的工业水脱胶处理获得的湿胶。样本中的非水原料中，胶体大致为73％而中性油大致为27％。对来自实施例16的“酶处理过的胶体”的分析证明存在的磷脂绝大部分被PLA/PLC酶水解，如胶体所显示的由73下降到41％，同时三酰基甘油的量显示由26.5％增加到58.6％。理论上，通过该方法预期生成的二酰基甘油的量为40.2％，但实际发现仅为13.2％。可以得出结论，用于油脱胶、纯化或卵磷脂改性的PLC和PLA酶的组合生成三酰基甘油或油。
已经公开了通过用PLA和PLC酶的组合处理胶体而由含磷脂酰的油胶体生成三酰基甘油的方法，其中PLC反应的DAG副产物和PLA反应的FFA副产物在酶的存在下彼此结合，形成新的TAG分子。这两种不同的酶可以同时或依序与胶体反应；使用依序方法时，酶可以用任何次序加入。酶与胶体的反应时间可以是约四小时或更少，而且可以低达约三十分钟。具有PLA活性的酶可以选自磷脂酶A1酶和磷脂酶A2酶。PLA酶可以以约2ppm活性酶或更低、或1ppm活性酶或更低、或低达0.5ppm活性酶或更低的浓度，存在于反应混合物中。具有PLC活性的酶可以选自磷脂酶C酶和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C酶。PLC酶可以以约30ppm活性酶或更低、或20ppm活性酶或更低、或低达10ppm活性酶或更低的浓度，存在于反应混合物中。
酶反应可以在温度范围约40-80℃下进行，优选的范围是约40-60℃。pH范围可以为约3-7。以实验室规模进行时，酶反应可以通过剪切混合，优选地约四十五秒或更多来进行。如本领域技术人员所公知的，随着方法按比例放大到工业水平，可以预期分配至剪切混合的时间将增加。同样地，含磷原料的丙酮沉淀将允许回收生成的油，该方法是脱油卵磷脂的生产领域中公知的。
尽管本发明优选的实施方案已经在本文中阐述，如在本申请时已知的，包含本发明方法的其它实施方案对本领域那些技术人员将是显而易见的，而且所有这样的实施方案及其等同物都被本申请覆盖，包含在本申请的权利要求范围内。
附录
下面的方法被用来测定本申请中实施例的中性油。
定义
该方法测定湿胶、溶胶体或粗制油皂脚中发现的中性油总量。
范围
适用于胶体、溶胶体和皂脚。
参考
A.O.C.S.方法G5-40
A.O.C.S.方法Ca2c-55
A.O.C.S.方法Ja4-46
仪器
1.带刻度的量筒-100ml
2.带刻度的量筒-50ml
3.带刻度的量筒-25ml
4.一次性离心管-50ml(聚丙烯)
5.分液漏斗-500ml
6.烧杯-500ml
7.烧杯-400ml
8.烧杯-250ml
9.玻璃搅棒
10.离心机
11.干燥器
12.蒸汽浴
13.烤箱-105℃
试剂
1.氢氧化钾溶液(KOH)-14％重量比。
2.氯化钠(NaCl)-试剂级。
3.乙醇-SDA Formulas 30和3A均可使用，50％体积比。10体积95％乙醇与9体积蒸馏水混合。
4.乙醇-SDA Formulas 30和3A均可使用，10％体积比。2体积95％乙醇与17体积蒸馏水混合。
5.石油醚-ACS级。
6.丙酮-ACS级。
7.去离子水或蒸馏水
8.氮气-纯净且干燥
方法
1.在选取样本后立即对样本进行％水分处理。注意：AOCS 2c-55，由于肥皂样本在130℃起泡沫，因此温度降低到105℃。时间增加到4小时。
2.彻底混合样本并立即称重。
3.称取5克(误差不超过0.0001g)样本到预先称重的50ml一次性离心管中。(注意：包括盖子和烧杯(供在天平上盛装离心管))。
4.向样本中加入35ml冷的丙酮(保持在冰浴中)，并用玻璃搅棒充分混合。用玻璃棒打碎卵磷脂沉淀。注意：丙酮将变为亮黄色。
5.盖上离心管。
6.离心丙酮5分钟，从而将胶体从丙酮中分离。
7.将丙酮倒入250ml烧杯中。
8.重复步骤4至7四次。
a.最后一次萃取后，去除胶体并将其放入预先称重的一次性干燥盘中。让过剩的丙酮蒸发。
b.将样本放置在105℃通风烤箱过夜。
c.在干燥器中冷却到室温，并称重干燥盘和样本的内容。
d.计算原始样本和折干计算的胶体百分比。
9.将丙酮层倒入500ml分液漏斗(“A”)中。
10.向分液漏斗中加入50ml水。混合。
11.加入50ml石油醚(P.E.)。混合。
12.向分液漏斗中加入一撮NaCl(～1/4汤匙的食盐)。混合。
13.让两层分开。将底层(丙酮/水)，其包括任何乳液移出，并将其加入到新的分液漏斗(“B-1”)中。不要丢弃P.E.层。
14.向来自步骤13的丙酮/水中加入50ml石油醚(P.E.)。混合。
15.让两层分开。将底层(丙酮/水)，其包括任何乳液，移入新的分液漏斗(“B-2”)中。
16.向来自步骤13、分液漏斗“A”的原始P.E.萃取物中加入石油醚层。
17.重复步骤14至16两次。可以将丙酮/水层加入到上面用过的漏斗“B-1”中。一旦最后一次萃取完成，可以丢弃丙酮/水层。
18.向装有P.E混合物的分液漏斗中加入100ml的50％乙醇。
19.加入10ml的14％KOH。轻柔混合。
20.向分液漏斗中加入50ml的50％乙醇。混合。
21.让各层完全分开。不要让P.E.层与酒精/KOH层保持接触超过30分钟。不要丢弃P.E.层。
22.将酒精/KOH层移出，并放置在新的分液漏斗中。
23.向装有酒精/KOH层的分液漏斗中加入50ml的P.E.。混合。
24.让各层分开。收集酒精/KOH层到新的分液漏斗中。将P.E.层加入到来自步骤21的P.E.中。
25.重复步骤23和24。
26.在装有P.E.层的分液漏斗中，加入25ml的10％酒精，剧烈震荡。让各层分开。去除酒精层。丢弃酒精层。
27.重复步骤26两次。向第三次“洗涤液”(酒精层)加入两滴酚酞，以检测该层是否为中性。如果该层变为粉红色，重复步骤26。
28.将P.E.层倒入已经预先干燥的去皮烧杯中，并在干燥器中冷却。在蒸汽浴上在温和的氮气气流下蒸发P.E.。
29.一旦P.E.已经被去除，将烧杯放置在烤箱中，105℃，30分钟。
30.在干燥器中冷却到环境温度并称重。
31.重复称重直到重量达到恒定(当连续30分钟干燥时间内重量损失(或增加)不超过0.1％时，则重量达到恒定。)
计算
中性油，％(现状)＝中性油质量/样本质量×100
中性油，％(折干计算)＝{中性油质量/样本质量}/{100-％水分}×100
胶体，％(现状)＝干燥的胶体质量/样本质量×100
胶体，％(折干计算)＝{干燥的胶体质量/样本质量}/{100-％水分}×100

Claims (18)

1.生成三酰基甘油的方法，所述方法包括：
(a)提供包含一定量油胶体的油组合物，所述胶体包含磷脂，
(b)用一种或多种磷脂酶A酶处理所述油组合物以生成游离脂肪酸，其中所述处理在40-60℃的温度和3-7的pH下进行不超过四小时，且其中所述酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2，
(c)用一种或多种磷脂酶C酶处理所述油组合物以生成二酰基甘油，其中所述处理在40-80℃的温度和8或更低的pH下进行不超过30分钟，其中所述酶是磷脂酶C或肌醇特异性磷脂酶C，
(d)在步骤(b)或(c)的至少一种磷脂酶A或C酶的存在下使所述脂肪酸和所述二酰基甘油反应，形成三酰基甘油。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和(c)同时发生。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)发生在步骤(c)之前。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)发生在步骤(b)之前。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述pH为3-7。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述油组合物包含粗制油。
7.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)或(d)中，所述磷脂酶C酶以30ppm活性酶或更少的量存在。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述磷脂酶C酶以20ppm活性酶或更少的量存在。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述磷脂酶C酶以10ppm活性酶或更少的量存在。
10.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)或(d)中，所述磷脂酶A酶以2ppm活性酶或更少的量存在。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述磷脂酶A酶以1ppm活性酶或更少的量存在。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述磷脂酶A酶以0.5ppm活性酶或更少的量存在。
13.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)或(c)中的处理包括剪切混合所述油组合物和相应地磷脂酶A或磷脂酶C酶以得到混合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述剪切混合持续的时间是至少45秒。
15.如权利要求13所述的方法，其中步骤(b)或(c)的处理进一步包括向所述混合物加入一定量水。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述水量为所述混合物的至少1.5％重量。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述水量为所述混合物的至少3.0％重量。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述水量为所述混合物的至少4.5％重量。
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