CN103394078A

CN103394078A - 一种自主加压多靶点协同止血的外伤急救用可降解止血制剂

Info

Publication number: CN103394078A
Application number: CN2013103266074A
Authority: CN
Inventors: 文爱东; 贾艳艳; 鹿成韬; 赵瑾怡; 尚刚伟
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2013-11-20

Abstract

本发明公开了一种自主加压多靶点协同止血的外伤急救用可降解制剂，包括可生物降解材料10-90%、凝血酶1-40%、纤维蛋白原1-40%、凝血因子1-40%、氨甲环酸1%-20%、去胺加压素1%-20%、钙盐0.5%-20%、局麻镇痛药0.1-5%、纳米银0.01-2%，本发明从主动和被动两个方面进行止血，从凝血机制的各个环节促进止血，可在短时间内控制出血，生物相容性好，可降解吸收、安全性好。

Description

一种自主加压多靶点协同止血的外伤急救用可降解止血制剂

技术领域

本发明涉及一种外伤急救用止血制剂，属于医药领域。

背景技术

随着军事技术的发展及新型武器的应用，加之反恐事件、自然灾害的频频发生，使得平战时的爆炸伤、软组织撕裂伤、贯通伤和烧伤的比例显著增加，其创面皮肤软组织的严重缺损、大出血、疼痛、易感染等，严重威胁伤员的生命。因此，研制开发具有高效止血、持久镇痛、预防和消除创面感染，并能有效的促进创面愈合的实用、便捷、安全、高效、多效的新型急救药器材迫在眉睫，也是提高平战时伤员生存率的关键，具有十分重要的军事意义和社会效益。

出血是战创伤救治和外科手术中威胁生命安全的难题。因此，止血成为创伤急救和治疗中的重要环节，在创伤的治疗中有多种止血法，如压迫止血法、结扎止血法、电凝止血法、血管阻断法、血管修复法及止血药物的应用。止血药物的应用非常重要，尤其是在局部将促凝物质(明胶海绵、纤维蛋白泡沫体、氧化纤维素、胶原丝等)填塞于渗血伤口内，可以促进血液凝固和提供凝血块的支架，同时这些物质可逐渐分解吸收，损伤血管也可以恢复通畅。但由于现代战争中伤情的复杂性、严酷性和作战环境的恶劣性，目前的止血药器材远不能满足现代伤情救治的需要。结合现代止血特点和要求，今后发展的止血药器材应具有如下特点：①首先应具有迅速强效止血功能（很强的止血功能）；②吸收创面渗液能力强；③缓解疼痛；④防止或消除感染；⑤具有较强的生物可降解性；⑥更加小型、携带轻便，简单易用; 无需胶布固定，无异味；⑦保质期长，能适应恶劣的战场环境和气温，特别是海水、低温、高温等情况；⑧经济，价格便宜；

不仅是完成创面的修复，还应重视减少瘢痕生成。

目前，仍没有一种适用于平战时严重爆炸伤、软组织撕裂伤、外伤动静脉大出血等较为理想的急救止血制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种多组分、多靶点、经济安全有效，能够快速制止外伤出血并可生物降解的无菌止血制剂。

本发明实现过程如下：

一种外伤急救用可降解止血制剂，各组分包括可生物降解材料10-90%、凝血酶1-40%、纤维蛋白原1-40%、凝血因子1-40%、氨甲环酸1%-20%、去胺加压素1%-20%、钙盐0.5%-20%、局麻镇痛药0.1-5%、纳米银0.01-2%，所述的可生物降解材料为明胶、微纤维胶原、壳聚糖、胶原蛋白或可降解纤维素，所述的局麻镇痛药为利多卡因、布比卡因、普鲁卡因、丙胺卡因、丁卡因、苯佐卡因中的一种或几种。

所述的凝血酶为经单甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰的牛凝血酶或基因重组凝血酶，修饰方法为在Tris-HCL缓冲液中，mPEG与凝血酶的摩尔比为3:1～15:1进行孵育。

所述的纤维蛋白原为经mPEG修饰的纤维蛋白原，修饰方法为在Tris-HCL缓冲液中，mPEG与纤维蛋白原的摩尔比为3:1～15:1进行孵育。

所述的凝血因子原为经mPEG修饰的牛凝血因子X、 V、III、IX、XI或XIII，修饰方法为在Tris-HCL缓冲液中，mPEG与牛凝血因子X、 V、III、IX、XI或XIII的摩尔比为3:1～15:1进行孵育。

所说的凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子源于牛或猪，其浓度为1-100活性单位/mg。

所述的钙盐选自氯化钙或钙钠藻酸盐。

所述的纳米银为粒径为10-100nm的医用纳米银。

上述外伤急救用可降解止血制剂的制备方法，其将凝血酶、纤维蛋白原、凝血因子、可生物降解材、氨甲环酸、去胺加压素、钙离子剂、局麻镇痛药、纳米银混合均匀，干燥，灭菌而制成。

将上述外伤急救用可降解止血制剂负载于止血棉、纱布、绷带、止血带、三角带上。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、本发明紧扣凝血的关键环节，通过多组分、多靶点协同止血，可以在短时间内抑制各种大出血；

2、本发明制备的止血剂采用辅料/散剂制剂，储存、携带、使用方便，使用时直接将药物敷/撒于出血部位，用绷带包扎即可；

3、药物中添加局部止痛药和抗感染药，可以有效缓解因创伤引起的疼痛，并预防和消除伤口感染；

4、药物中添加凝血因子和钙盐，可以有效启动造血功能障碍下的止血机制，更为全面的保障止血的有效性；

5、药物中采用经mPEG共价修饰的牛凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子V，性质稳定，可以在常温下长期储存；

6、本发明止血制剂价格便宜，使用方便简易，使用人员无需经专业培训，特别适合于无医疗环境下第一时间出血的救治，并能局部止痛和控制出血部位感染。

附图说明

图1为可生物降解材料自主加压机理；

图2为凝血酶的复合物发挥止血的机理。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步详细描述本发明。

本发明的止血制剂采用被动和主动双重机理止血。这里所说的被动止血是指采用可生物降解材料，其吸水后可以迅速膨胀形成一个网状的物理结构，在这个结构里，有助于纤维蛋白聚集成块，包括明胶、微纤维胶原、壳聚糖、可降解纤维素、胶原蛋白。主动止血指采用具有生物活性，直接参与凝血过程最终在出血部位形成血块，包括凝血酶或基因重组凝血酶、纤维蛋白原、凝血因子、钙离子剂、氨甲环酸、去胺加压素。

为减轻因出血而引起的疼痛和继发性感染，本发明含止痛成分包括利多卡因、布比卡因、布鲁卡因、丙胺卡因、丁卡因、苯佐卡因；抗感染成分包括纳米银。

本发明可降解止血制剂发挥协同止血的机理：

1）上述所说的被动止血中使用的止血材料，在出血部位可以立即膨胀，阻滞血液渗出降低血流，对血管产生一个轻的自主填压作用。不断渗出的血液填充于凝血酶和浸湿的明胶颗粒间的空隙，暴漏在高浓度凝血酶中，凝血酶催化血中可溶性纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白填充于空隙之间（图1）。此外，纤维素和明胶具有接触激活的功能，与出血部位接触后，能快速活化凝血因子XII，从而激活内部凝血系统。胶原蛋白不仅能快速活化凝血因子，还能激活静息血小板，从而达到止血目的。

2）凝血酶的复合物发挥止血的机理（图2）

凝血酶催化内源和外源可溶性纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白，形成凝块，阻止进一步出血；

凝血因子X和/或凝血因子V催化血浆中凝血酶原转变成凝血酶；

氨甲环酸抑制纤溶酶原激活，抗纤维蛋白溶解；

去胺加压素可增加血浆内促凝血因子Ⅷ的活性2-4倍。

凝血反应是一个复杂的信号级连过程，凝血酶在其中具有核心地位。本发明中的主动止血机理即是围绕凝血酶的催化生成，多靶点、多机制协同控制出血。

实施例1 自主加压多靶点协同止血可降解散剂的制备

（1）经单甲氧基聚乙二醇(mPEG)共价修饰的牛凝血酶、纤维蛋白原、凝血因子V的合成

运用活化的单甲氧基聚乙二醇（mPEG；MW=5000）对凝血酶、纤维蛋白、凝血因子v原进行了共价修饰，反应条件如下：

在0.05mM的Tris-HCL缓冲液（pH=7.8）中进行，mPEG与凝血酶的摩尔比为6:1；mPEG与纤维蛋白原的摩尔比例为7:1；mPEG与凝血因子V的摩尔比为6:1，进行孵育。

(2) 经化学修饰的凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子V的活性测定

以纤维蛋白原为mPEG修饰凝血酶的底物，以100ml 0.05mM的Tris-HCL缓冲液（PH=7.8）为溶质，配制一系列的纤维蛋白原浓度，mPEG修饰凝血酶的浓度为10U/ml，37℃孵20min，250nm下，扫描观察并记录纤维蛋白的初凝时间，从标准曲线上获得酶活性。运用Lineweaver-Burk作图法，分别求出化学修饰凝血酶与非化学修饰凝血酶的K_m。试验结果表明：化学修饰后的凝血酶K_m与非化学修饰的凝血酶无显著性差异（P > 0.05），如表1所示。

以mPEG修饰纤维蛋白原为凝血酶的底物，以100ml 0.05mM的Tris-HCL缓冲液（PH=7.8）为溶质，配制一系列的mPEG修饰纤维蛋白原浓度，凝血酶的浓度为10U/ml，37℃孵20min，250nm下，扫描观察并记录mPEG修饰纤维蛋白的初凝时间，从标准曲线上获得酶活性（阳性对照为非化学修饰的纤维蛋白原）。运用Lineweaver-Burk作图法，分别求出mPEG修饰纤维蛋白原与非化学修饰纤维蛋白原的K_m。试验结果表明：mPEG修饰后的纤维蛋白原K_m与非化学修饰的纤维蛋白原无显著性差异（P > 0.05），如表2所示。

采用纤维蛋白凝结法分析mPEG修饰凝血因子V加速凝血酶原活化的促凝活性。以100 mL 0.05 mM的Tris-HCL缓冲液（PH=7.8）为溶质，配制一系列的mPEG修饰凝血因子V（终浓度为50，100，150，200，250 μg/mL），加入终浓度为500L g/mL的凝血酶原，37 ℃下作用140 min后，加入纤维蛋白原（终浓度为1 mg/ mL），记录凝结时间。试验结果表明：mPEG修饰后的凝血因子V的凝结时间与非化学修饰的无显著性差异（P > 0.05），如表3所示。

（3）mPEG修饰的凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子V的温度稳定性

将冻干的mPEG修饰与非化学修饰的凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子V分别在40℃和50℃放置0,1,2,5,10,20,40(h)，然后运用上述活力测试法，测定其剩余活力，结果表明：mPEG修饰后的凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子V的抗高温作用比非化学修饰的好，其半衰期显著延长，在40℃内，稳定性良好，如表4所示。

（4）自主加压多靶点协同止血可降解散剂的制备

首先将0.05mg的纳米银与0.95mg的氯化钙和1mg的利多卡因研磨混匀；逐个加入3mg的氨基环酸，3mg的去胺加压素，研磨混匀；分批量加入明胶42mg，研磨混匀；再分别加入30mg经mPEG修饰的牛凝血酶（终浓度为3活性单位/mg）、10mg mPEG修饰的纤维蛋白原（终浓度为1活性单位/mg）、10mg的mPEG修饰化凝血因子V（终浓度为1活性单位/mg），均匀混合，真空干燥20min，再进行冷冻干燥，根据需求分剂量包装，C_O ⁶⁰辐射灭菌，室温储存。

实施例2

首先将0.05mg的纳米银与0.95mg的氯化钙和2mg的普鲁卡因研磨混匀；逐个加入5mg的氨基环酸，2mg的去胺加压素，研磨混匀；分批量加入壳聚糖30mg，研磨混匀；再分别加入20mg经mPEG修饰的牛凝血酶（终浓度为2活性单位/mg）、30mg mPEG修饰的纤维蛋白原（终浓度为3活性单位/mg）、10mg的mPEG修饰化凝血因子V（终浓度为1活性单位/mg），均匀混合，真空干燥20min，再进行冷冻干燥，根据需求分剂量包装，C_O ⁶⁰辐射灭菌，室温储存。

实施例3

首先将0.05mg的纳米银与0.55mg的氯化钙和0.4mg的丙胺卡因研磨混匀；逐个加入2mg的氨基环酸，3mg的去胺加压素，研磨混匀；分批量加入可降解纤维素54mg，研磨混匀；再分别加入10mg经mPEG修饰的牛凝血酶（终浓度为1活性单位/mg）、10mg mPEG修饰的纤维蛋白原（终浓度为1活性单位/mg）、20mg的mPEG修饰化凝血因子V（终浓度为2活性单位/mg），均匀混合，真空干燥20min，再进行冷冻干燥，根据需求分剂量包装，C_O ⁶⁰辐射灭菌，室温储存。

实施例4 自主加压多靶点协同止血可降解散剂大鼠肝中叶切除出血模型止血效果

将24只体重180-220g大鼠随机分为A、B组，A组为常规止血药对照组（n=6），B组为新型止血制剂，分为实施例1-3组（n=6）。根据Matsuoka的方法制备大鼠肝中叶切除出血模型。腹腔注射10%水合氯醛1mL麻醉大鼠，于肋弓下沿腹中线剪开腹肌，挤压腹部将肝中叶从切口处挤出，吸干肝脏周围腹腔液后将称重后的无菌纱布垫于肝中叶下，于肝中叶下缘以上2cm处快速切除肝中叶。根据分组立即均匀放置本品200mg于切口处，开始计时至出血停止，以无鲜红血液渗出为出血停止标准，观察A、B组止血制剂凝固过程，记录出血时间及出血量。出血时间为切除肝中叶开始至出血停止，出血量为切除前后无菌纱布重量差。试验结果表明（表5），本发明制备的止血制剂，其出血时间和出血量均明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）

实施例5 自主加压多靶点协同止血可降解散剂对凝血功能障碍大鼠股动脉切口止血作用

（1）凝血功能障碍SD大鼠模型的建立：

健康SD大鼠32只，雌雄各半，分为2组：① 对照组（n=16）；② 凝血功能障碍组（n=16）。对照组大鼠不使用任何药物，凝血功能障碍组SD大鼠尾静脉注射肝素钠注射液(常州市新华活性材料研究所生产, 120U/mg)，第1天剂量为2.3mg/kg，第2、3、4天每天剂量为0.9，mg/kg，总剂量为5mg/kg。第5天分别对实验组和对照组SD大鼠用玻片法记录凝血时间，结果显示：实验组SD大鼠凝血时间为(5.1±0.9) min，对照组SD大鼠凝血时间为(3.0±0.5) min，统计学(t检验)结果为P<0. 01，对照组与实验组SD大鼠凝血时间有显著性差异，造模成功。

（2）凝血因子V的在止血制剂中的重要性

大鼠腹腔注射10%水合氯醛1mL麻醉，仰卧位固定于鼠板，75%酒精消毒腹股沟区，无菌操作纵向切开腹股沟区皮肤，暴露皮下肌肉组织，血管钳钝性分离并暴露大鼠股动脉，剪刀剪开股动脉制造失血模型。分为不含凝血因子V组和本发明止血制剂组，每组对照组大鼠和凝血功能障碍大鼠各8只，雌雄各半。止血时间、血压变化和失血量。实验结果表明，对于正常大鼠，加/不加凝血因子V对于凝血作用没有显著性影响；然而对于存在凝血功能障碍的大鼠，加/不加凝血因子V对于凝血作用存在显著性差异，表明，在对于存在凝血功能障碍这一特殊群体，本发明止血制剂具有显著优势。

Claims

1.一种外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于各组分包括可生物降解材料10-90%、凝血酶1-40%、纤维蛋白原1-40%、凝血因子1-40%、氨甲环酸1%-20%、去胺加压素1%-20%、钙盐0.5%-20%、局麻镇痛药0.1-5%、纳米银0.01-2%，所述的可生物降解材料为明胶、微纤维胶原、壳聚糖、胶原蛋白或可降解纤维素，所述的局麻镇痛药为利多卡因、布比卡因、普鲁卡因、丙胺卡因、丁卡因、苯佐卡因中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于：所述的凝血酶为经mPEG修饰的牛凝血酶或基因重组凝血酶，修饰方法为在Tris-HCL缓冲液中，mPEG与凝血酶的摩尔比为3:1～15:1进行孵育。

3.根据权利要求1所述的外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于：所述的纤维蛋白原为经mPEG修饰的纤维蛋白原，修饰方法为在Tris-HCL缓冲液中，mPEG与纤维蛋白原的摩尔比为3:1～15:1进行孵育。

4.根据权利要求1所述的外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于：所述的凝血因子原为经mPEG修饰的牛凝血因子X、 V、III、IX、XI或XIII，修饰方法为在Tris-HCL缓冲液中，mPEG与牛凝血因子X、 V、III、IX、XI或XIII的摩尔比为3:1～15:1进行孵育。

5.根据权利要求2至4任意之一所述的外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于：所说的凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子源于牛或猪，其浓度为1-100活性单位/mg。

6.根据权利要求1所述的外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于：所述的钙盐选自氯化钙或钙钠藻酸盐。

7.根据权利要求1所述的外伤急救用可降解止血制剂，其特征在于：所述的纳米银为粒径为10-100nm的医用纳米银。

8.权利要求1所述的外伤急救用可降解止血制剂的制备方法，其将凝血酶、纤维蛋白原、凝血因子、可生物降解材、氨甲环酸、去胺加压素、钙离子剂、局麻镇痛药、纳米银混合均匀，干燥，灭菌而制成。

9.载有权利要求1所述外伤急救用可降解止血制剂的止血棉、纱布、绷带、止血带、三角带。

10.权利要求1所述可降解止血制剂在制备各种出血性外伤药物中的应用。