CN101678119A

CN101678119A - 具有可释放的键合的血管性血友病因子-和因子viii-聚合物轭合物

Info

Publication number: CN101678119A
Application number: CN200780048381A
Authority: CN
Inventors: M·J·博萨德; G·史蒂芬森; 方志豪; H·加普; S·米歇尔; 张平; F·施弗林格; P·图瑞塞克; J·希克曼; K·瓦拉迪; H·格里茨
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc; Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Baishen Co; Baxalta GmbH; Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Nektar Therapeutics
Priority date: 2006-12-27
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2010-03-24
Anticipated expiration: 2027-12-27
Also published as: WO2008082669A2; US8349800B2; BRPI0720661A2; US20120142594A1; KR101503085B1; KR20090107510A; US20130012442A1; EP2114458A2; NZ577728A; WO2008082669A3; US20080234193A1; AU2007340382B2; CA2671676A1; EP2114458B1; NO20092257L; AU2007340382A1; MX2009007145A; NO342710B1; JP2010514773A; HK1142537A1

Abstract

本发明提供了血管性血友病因子－聚合物轭合物和因子VIII－聚合物轭合物，其每一种都具有可释放的键合。还提供了制备轭合物的方法、施用轭合物的方法。

Description

具有可释放的键合的血管性血友病因子-和因子VIII-聚合物轭合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年12月27日提交的美国临时申请序列第60/877,531号的优先权权益，其通过引用整体并入本文。

发明背景

本发明一般涉及聚合物-活性剂轭合物，其具有可释放的键合(releasable linkage)从而在体内释放活性剂。此外，本发明涉及(除了别的以外)合成轭合物的方法，纯化轭合物的方法，等等。

发明背景

科学家和临床医生在他们试图将活性剂开发为适于递送给患者的形式时面临许多挑战。为多肽的活性剂，例如，常常通过注射而非口服递送。以这种方式，多肽在不暴露于胃中的蛋白质水解环境的情况下被引入系统循环。然而，注射多肽具有若干缺点。例如，许多多肽具有相对短的半衰期，因此不得不反复注射，其常常是麻烦并且痛苦的。而且，某些多肽可引起一种或多种免疫应答而导致患者的免疫系统试图破坏免疫原性的多肽或以其他方式使免疫原性的多肽失效。当然，一旦多肽被破坏或以其他方式失效，多肽就不能发挥其预期的药效活性。因此，活性剂例如多肽的递送常常是成问题的，甚至在通过注射施用这些活性剂时。

在解决通过注射递送活性剂的问题上已经获得了一些成功。例如，将活性剂与水溶性聚合物轭合产生了具有减小的免疫原性和抗原性的聚合物-活性剂轭合物。此外，这些聚合物-活性剂轭合物与它们未轭合的对应物相比，由于减少了经由肾脏的清除和/或减少了系统循环中的酶降解而常常具有大大增加的半衰期。作为具有较大半衰期的结果，聚合物-活性剂轭合物需要较少频率的给药，其反过来减少了痛苦的注射和麻烦的拜访卫生保健医师的总次数。而且，当活性剂与水溶性聚合物轭合时，仅少量溶解的活性剂显示出了在水溶性上的显著增加。

聚乙二醇由于其已证明的安全性以及其已由FDA批准用于局部和内部使用，已与活性剂轭合。当活性剂与聚乙二醇或“PEG”聚合物轭合时，轭合的活性剂通常被称为“PEG化的”。PEG化活性剂例如

PEG化干扰素α-2a(Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ)、PEG-PEG化干扰素α-2b(Schering Corp.，Kennilworth，NJ)和NEULASTA PEG-非格司亭(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)的商业成功证明施用轭合形式的活性剂显著优于未轭合的对应物。小分子例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Zalipsky(1993)Bioconjug.Chem.4(4)：296-299)和氟尿嘧啶(Ouchi等人(1992)Drug Des.Discov.9(1)：93-105)也已被PEG化。Harris等人已提供了PEG化对药物的影响的综述。Harris等人.(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2(3)：214-221。

尽管获得这些成功，但将聚合物与活性剂的轭合以产生商业上的相关药物往往是富有挑战性的。例如，轭合可导致聚合物在活性剂上的对药理活性来说必需的位点处或靠近该位点处(例如，在结合位点处或靠近该结合位点处)连接。因此这样的轭合物可能由于例如由聚合物带来的空间位阻效应而具有难以接受的低活性。当活性剂具有很少或没有其他适于连接聚合物的位点时，补救具有难以接受的低活性的轭合物的尝试被挫败。因此，需要另外的PEG化替代物。

有人提出解决这一问题和其他问题的方法是“可逆的PEG化”，其中原始的(native)活性剂(或与PEG化活性剂相比具有增加了的活性的部分)被释放。例如，癌症化疗领域中已公开了可逆的PEG化。参见Greenwald(1997)Exp.Opin.Ther.Patents 7(6)：601-609。美国专利申请公开第2005/0079155号描述了使用可逆的键合的轭合物。如这一公开中所描述的，可通过使用酶底物部分实现可逆的键合。然而，已有人指出依赖酶促活性的方法依赖于酶的有效性。参见Peleg-Schulman(2004)J.Med.Chem.47：4897-4904。以这些酶的量和活性为基础的患者差异性可造成轭合物在不同人群中的性能不一致。因此，不依赖于释放聚合物的酶促方法的另外的方法已被描述为是期望的。

美国专利第7,060,259号中描述了另一种可逆的PEG化的方法，该专利描述了(除了别的以外)水溶性前药，在该前药中生物活性剂通过可水解的氨基甲酸酯键连接于水溶性非免疫原性聚合物。如其中所描述的，在体内通过氨基甲酸酯键的水解可容易地释放生物活性剂而无需添加酶或催化物质。

另一种可逆的PEG化的方法描述于Peleg-Schulman(2004)J.Med.Chem.47：4897-4904、WO 2004/089280和美国专利申请公开第2006/0171920号中。尽管这一方法已被用于有限数量的活性剂，但这些参考文献忽视了特别适合可逆的PEG化的其他活性剂。还有一种可释放的方法描述于美国专利申请公开第2006/0293499号。

在出血性病症的领域中，有时可将蛋白质(例如，诸如血管性血友病因子(von Willebrand Factor)和因子VIII)施用于患者以应付或以其他方式改善出血性病症。由于这种蛋白质的半衰期相对短，因此通过例如可逆的PEG化来增加这些蛋白质在体内的半衰期将是有益的。因此，本发明设法解决本领域的这一需求和其他需求。

发明概述

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了下式的轭合物：

其中：

POLY¹是第一水溶性聚合物；

POLY²是第二水溶性聚合物；

X¹是第一间隔基部分；

X²是第二间隔基部分；

H_α是可电离的氢原子；

R¹是H或有机基；

R²是H或有机基；

(a)是0或1；

(b)是0或1；

R^e1，当存在时，是第一电子改变基团(electron altering group)；

R^e2，当存在时，是第二电子改变基团；并且

Y¹是O或S；

Y²是O或S；并且

(vWF/F8)是选自由血管性血友病因子部分和因子VIII部分所组成的组的含胺的生物活性剂的残基。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了制备轭合物的方法。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了含有轭合物的药物制品。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了施用轭合物的方法。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了一种构造物(cons truct)，该构造物包括结合于至少一个因子VIII部分的如本文提供的轭合物。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物，该轭合物具有与未与水溶性聚合物轭合的血管性血友病因子部分的体内半衰期相比增加到至少1.5倍的体内半衰期。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物，该轭合物具有与未与水溶性聚合物轭合的血管性血友病因子部分的体内半衰期相比增加到至少2倍的体内半衰期。

在本发明的一个或多个实施方案中，提供了因子VIII部分-水溶性聚合物轭合物，该轭合物具有与未与水溶性聚合物轭合的因子VIII部分的体内半衰期相比增加到至少1.5倍的体内半衰期。

附图简述

图1显示了依照实施例1A中展示的程序制备的轭合物组合物的典型的色谱图。

图2A显示了依照实施例2A中展示的程序制备的轭合物组合物的典型的分离谱图(profile)。

图2B显示了依照实施例2A中展示的程序制备的轭合物组合物的典型的色谱图。

图3A显示了依照实施例3A中展示的程序制备的轭合物组合物的经阴离子交换色谱后的色谱图。

图3B显示了依照实施例3A中展示的程序制备的轭合物组合物在还原条件下经SDS-PAGE分析后的凝胶。NuPAGE Novex Tris-乙酸酯凝胶(NuPAGE Novex Tris-Acetate Gel)(3-8％)和Tris-乙酸酯SDS运行缓冲液(Tris-Acetate SDS Running Buffer)。所述凝胶通过Pierce的GelCode蓝(GelCode Blue)染色剂染色。泳道1：Invitrogen的HiMark未染色的高分子量蛋白质标准品(HiMark Unstained HighMolecular Weight Protein Standard)。泳道2：rVWF标准品。泳道3：轭合物。

图3C显示了依照实施例3A中展示的程序制备的轭合物组合物在非还原条件下经SDS-PAGE分析后的凝胶。NuPAGE Novex Tris-乙酸酯凝胶(3-8％)和Tris-乙酸酯SDS运行缓冲液。通过氯化钡/碘染色剂检测PEG。泳道1：轭合物。泳道2：0.002wt/v％的PEG20K对照。泳道3：0.005wt/v％的PEG20K对照。泳道4：0.01wt/v％的PEG20K对照。

图4A和4B分别显示了依照实施例3B和3C中展示的程序制备的轭合物组合物经离子交换色谱后的色谱图。

图5显示了依照实施例4A中展示的程序制备的轭合物组合物的色谱图。

图6A和6B显示了依照实施例4A中展示的程序制备的轭合物组合物经分别使用碘化钡(Barium Iodided)染色和考马斯染色(Coomassiestaining)的SDS-PAGE分析后的凝胶。

图7显示了由电泳对原始rVWF 133P1的结构表征。图片A：还原SDS-PAGE随后银染色。图片B：还原SDS-PAGE随后考马斯染色。图片C：多克隆抗人VWF抗体的还原SDS-PAGE凝胶的免疫印迹。图片D：通过经由抗VWF抗体检测的2.5％琼脂糖凝胶电泳可见的VWF多聚体分布。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图8显示了通过使用蛋白质染色的还原SDSPAGE可见的可释放的PEG化rVWF轭合物的结构域结构。图片A：还原SDS-PAGE随后银染色。图片B：还原SDS-PAGE随后考马斯染色。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图9显示了通过对VWF和PEG特异的还原SDS-PAGE免疫印迹可见的可释放的PEG化rVWF的结构域结构。图片A：多克隆抗人VWF抗体的还原SDS-PAGE凝胶的免疫印迹。图片B：多克隆抗PEG抗体的还原SDS-PAGE凝胶的免疫印迹。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图10显示了通过低分辨率琼脂糖凝胶电泳可见的可释放的rVWF轭合物的VWF多聚体分布。图片A：在凝胶中用抗VWF抗体检测的多聚体分布。图片B：在免疫印迹后用抗PEG抗体检测的PEG化VWF多聚体。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图11显示了通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳可见的可释放的rVWF轭合物的VWF多聚体的微细结构。图片A：在凝胶中通过抗VWF抗体可见的VWF多聚体结构。图片B：免疫印迹后用抗PEG抗体检测的PEG化VWF多聚体。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图12显示了在流动条件下未修饰的rVWF存在的情况下可释放的PEG-rVWF轭合物的FVIII结合能力。正方形，空心：PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、可释放的、短)和rFVIII；正方形：PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、可释放的、长)和rFVIII；三角形，空心：PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、可释放的、短)和rFVIII；三角形：PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、可释放的、长)和rFVIII；圆形，空心：PEG化的rVWF(Lys、60K、支链、可释放的、短)和rFVIII；圆形：PEG化的rVWF(Lys、60K、支链、可释放的、长)和rFVIII；星形：原始rVWF(133池1)和rFVIII；十字：r原VWF 198(rproVWF 198)和rFVIII。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图13显示了在ADAMTS13消化的样品中VWF的VWF:CB活性的变化。正方形，空心：PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、可释放的、短)；正方形：PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、可释放的、长)；三角形，空心：PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、可释放的、短)；三角形：PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、可释放的、长)；星形：原始rVWF(133P1(133池1))。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图14显示了在通过SDS-琼脂糖凝胶可见的rVWF中ADAMTS13介导的随体带(satellite band)的形成。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图15显示了通过抗PEG免疫印迹表明的PEG化程度上变化的时间过程。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图16显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rVWF和PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、短、低)(都与rFVIII共注射)的比较。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。数据被表示为IU VWF:Ag/ml或IU FVIII/ml小鼠血浆。圆形：PEG化的rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)；三角形：原始rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)。符号显示在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值±SD。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图17显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rVWF和PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、长、低)(都与rFVIII共注射)的比较。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。数据被表示为IU VWF:Ag/ml或IU FVIII/ml小鼠血浆。圆形：PEG化的rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)；三角形：原始rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)。这些符号显示在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值±SD。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图18显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rVWF和PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、短、低)(都与rFVIII共注射)的比较。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。数据被表示为IU VWF:Ag/ml或IU FVIII/ml小鼠血浆。圆形：PEG化的rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(180IU/kg)；三角形：原始rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(190IU/kg)。这些符号显示在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值±SD。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图19显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rVWF和PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、长、低)(都与rFVIII共注射)的比较。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。数据被表示为IU VWF:Ag/ml或IU FVIII/ml小鼠血浆。圆形：PEG化的rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(190IU/kg)；三角形：原始rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(190IU/kg)。这些符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值±SD。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图20显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rVWF和PEG化的rVWF(Lys、60K、支链、短、低)(都与rFVIII共注射)的比较。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。数据被表示为IU VWF:Ag/ml或IU FVIII/ml小鼠血浆。圆形：PEG化的rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)；三角形：原始rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)。这些符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值±SD。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图21显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rVWF和PEG化的rVWF(Lys、60K、支链、长、低)(都与rFVIII共注射)的比较。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。数据被表示为IU VWF:Ag/ml或IU FVIII/ml小鼠血浆。圆形：PEG化的rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)；三角形：原始rVWF(1.6mg/kg)和rFVIII(200IU/kg)。这些符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值±SD。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图22显示了PEG化的rVWF候选物的概述。A：VWF:Ag的时间依赖性变化。B：FVIII：活性的时间依赖性变化。空心正方形：PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、短、低)和rFVIII；正方形：PEG化的rVWF(Lys、20K、支链、长、低)和rFVIII；空心三角形：PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、短、低)和rFVIII；三角形：PEG化的rVWF(Lys、40K、支链、长、低)和rFVIII；圆形：PEG化的rVWF(Lys、60K、支链、短、低)和rFVIII；圆形：PEG化的rVWF(Lys、60K、支链、长、低)和rFVIII；以及星形：原始rVWF(133池1)和rFVIII。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图23显示了VWF:Ag的剂量调整的AUC。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图24显示了与PEG化的rVWF候选物共注射时，FVIII的AUC和半衰期。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图25显示了与PEG化的rVWF候选物共注射时，FVIII的MRT。有关这一图的进一步的信息于实施例5中提供。

图26显示了通过还原SDS-PAGE及随后使用多克隆抗人FVIII抗体的免疫印迹可见的原始rFVIII(MOQ HEPES01-E)的结构域结构。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图27显示了FXa生成曲线的定量参数。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图28显示了通过还原SDSPAGE及随后的免疫印迹可见的可释放的PEG-rFVIII轭合物的结构域结构。图片A：使用多克隆抗人FVIII抗体的免疫印迹。图片B：使用针对PEG的多克隆抗体的免疫印迹。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图29显示了通过还原SDS-PAGE及随后的免疫印迹可见的可释放的PEG-rFVIII轭合物的HC和LC结构。图片A：使用单克隆抗人FVIIIHC-A2结构域抗体的免疫印迹。图片B：使用单克隆抗人FVIIILC-A3结构域抗体的免疫印迹。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图30显示了在未活化的PEG-rFVIII存在的情况下因子Xa(″FXa″)的生成曲线。星形：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；圆形：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；三角形：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；正方形：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)；十字：FVIII对照；圆形，空心：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；三角形，空心：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)；正方形，空心：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图31显示了在凝血酶活化的PEG-rFVIII存在的情况下FXa的生成曲线。星形：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；圆形：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；三角形：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；正方形：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)；十字：FVIII对照；圆形，空心：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；三角形，空心：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)；正方形，空心：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图32显示了PEG-rFVIII经由凝血酶的活化和失活。星形：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；圆形：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；三角形：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；正方形：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)；十字：FVIII对照；圆形，空心：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；三角形，空心：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)；正方形，空心：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图33显示了PEG化的FVIII轭合物的APC介导的失活。星形：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；圆形：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；三角形：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；正方形：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)；十字：FVIII对照；圆形，空心：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；三角形，空心：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)；正方形，空心：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图34显示了凝血酶活化的PEG化的FVIII轭合物的APC介导的失活。星形：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；圆形：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；三角形：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；正方形：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)；十字：FVIII对照；圆形，空心：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；三角形，空心：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)；正方形，空心：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图35显示了通过在体外加入原始rFVIII对FVIII缺乏的血浆中凝血酶生成的改善。图片A：将rFVIII MOQ HEPES 01-E加入(spikedinto)FVIII缺乏的血浆中所获得的凝血酶生成曲线；线a：无rFVIII；线b：0.0025μg rFVIII/ml；线c：0.01μg rFVIII/ml；线d：0.025μg rFVIII/ml；线e：0.1μg rFVIII/ml。图片B：原始rFVIII MOQHEPES 01-E的线性剂量响应曲线。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图36显示了使用FVIII缺乏的血浆中的PEG-rFVIII样品所获得的凝血酶生成曲线(图片A-F)和凝血酶峰值的剂量响应曲线(图片G)。星形：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；圆形：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；三角形：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；正方形：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)；十字：FVIII对照；圆形，空心：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；三角形，空心：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)；正方形，空心：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图37显示了在pH 8.1的缓冲液中孵育时FVIII比活性的恢复。图片A：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E(星形)和FVIII对照(十字)。图片B：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)(实心圆形(closed circle))和PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)(空心圆形)。图片C：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)(实心三角形)和PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)(空心三角形)。图片D：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)(实心正方形)和PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)(空心正方形)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图38显示了在pH 8.1的缓冲液中孵育时FVIII:Ag的恢复。图片A：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E(星形)和FVIII对照(十字)。图片B：PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)(实心圆形)和PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)(空心圆形)。图片C：PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)(实心三角形)和PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)(空心三角形)。图片D：PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)(实心正方形)和PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)(空心正方形)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图39显示了通过抗FVIII的免疫印迹表明的在升高的pH下孵育时FVIII的结构变化。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图40显示了通过抗FVIII HC-A2结构域的免疫印迹表明的在升高的pH下孵育时FVIII的结构变化。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图41显示了通过抗PEG的免疫印迹表明的在升高的pH下孵育时FVIII的结构变化。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图42显示了于+37℃在FVIII缺乏的血浆中孵育时PEG-rFVIII的FVIII比活性的变化。图片A：孵育时FVIII活性的变化，表示为IU FVIII：生色活性(Chrom activity)/mg蛋白质。图片B：FVIII比活性相对于初始值的变化，表示为加至血浆后立即测量的初始值的％。符号：黑色星形，原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；实心圆形，PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；空心圆形，PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；实心三角形，PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；空心三角形，PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图43显示了于+37℃在FVIII缺乏的血浆中孵育时PEG-rFVIII的FVIII抗原比蛋白质的比率的变化。图片A：孵育时FVIII抗原/蛋白质的比率的变化，表示为IU FVIII:Ag/mg蛋白质。图片B：FVIII抗原/蛋白质的比率相对于初始值的变化，表示为加至血浆后立即测量的初始值的％。符号：黑色星形，原始rFVIII MOQ HEPES 01-E；实心圆形，PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；空心圆形，PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)；实心三角形，PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)；空心三角形，PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图44显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rFVIII和PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)的比较。图片A：血浆中的绝对FVIII活性水平；实心圆形，PEG-rFVIII(320IU/kg，168μg/kg)；实心三角形，原始rFVIII(170IU/kg，25μg/kg)。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值+/-SD。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图45显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rFVIII和PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、长)的比较。图片A：血浆中的绝对FVIII活性水平；实心圆形，PEG-rFVIII(210IU/kg，164μg/kg)；实心三角形，原始rFVIII(200IU/kg，35μg/kg)。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值+/-SD。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图46显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rFVIII和PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、短)的比较。图片A：血浆中绝对FVIII活性水平；实心圆形，PEG-rFVIII(230IU/kg，94μg/kg)；实心三角形：原始rFVIII(230IU/kg，32μg/kg)。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值+/-SD。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图47显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rFVIII和PEG-rFVIII(Lys、40K、支链、长)的比较。图片A：血浆中绝对FVIII活性水平；实心圆形：PEG-rFVIII(230IU/kg，94μg/kg)；实心三角形：原始rFVIII(230IU/kg，32μg/kg)。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值+/-SD。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图48显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rFVIII和PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、短)的比较。图片A：血浆中绝对FVIII活性水平；实心圆形：PEG-rFVIII(200IU/kg，133μg/kg)；实心三角形：原始rFVIII(190IU/kg，32μg/kg)。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值+/-SD。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图49显示了在FVIII缺陷型敲除小鼠中原始rFVIII和PEG-rFVIII(Lys、60K、支链、长)的比较。图片A：血浆中绝对FVIII活性水平；实心圆形：PEG-rFVIII(170IU/kg，62μg/kg)；实心三角形：原始rFVIII(190IU/kg，32μg/kg)。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的平均值+/-SD。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图50显示了在FVIII缺陷型小鼠中原始rFVIII和PEG化的rFVIII轭合物的比较。实心圆形，PEG-rFVIII(Lys、20K、支链、短)；空心圆形，PEG rFVIII(Lys、20K、支链、长)；实心三角形，PEG rFVIII(Lys、40K、支链、短)；空心三角形，PEG rFVIII(Lys、40K、支链、长)；实心正方形，PEG rFVIII(Lys、60K、支链、短)；空心正方形，PEG rFVIII(Lys、60K、支链、长)；空心菱形，原始rFVIII。符号显示了在每个时间点获得的6个血浆样品的“归一化的％”平均值±SD(PEG-rFVIII)或在每个时间点获得的24个血浆样品的平均值±SD(原始rFVIII)。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图51显示了原始rFVIII和PEG-rFVIII轭合物的剂量调整的AUC和半衰期。图片A：曲线下面积(剂量调整的)。符号显示了各个PEG-rFVIII轭合物的平均值+/-95％置信区间；原始rFVIII的数据是所有进行的对照组的平均值+/-95％置信区间，相当于每个时间点24只动物；空心正方形：原始rFVIII；实心正方形：PEG-rFVIII。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

图52显示了原始rFVIII和PEG-rFVIII轭合物的平均滞留时间(″MRT″)。rFVIII对照(空心正方形，所有对照组的平均，每取样点24只动物)和PEG-rFVIII候选物(实心正方形)的平均滞留时间和范围。有关这一图的进一步的信息于实施例6中提供。

发明详述

在详细描述本发明之前，应理解的是本发明不限于特定的聚合物、合成技术、活性剂和类似物，因而它们可以变化。

必须注意的是，如在本说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文以别的方式明确地指出，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的所指对象。因此，例如，提到一种“聚合物”则包括单一的聚合物也包括两种或更多相同或不同的聚合物，提到一种“轭合物”则是指单一的轭合物也指两种或更多相同或不同的轭合物，提到一种“赋形剂”则包括单一的赋形剂也包括两种或更多相同或不同的赋形剂，诸如此类。

在描述和要求保护本发明中，将依照下文描述的定义使用下列术语。

如本文所用的，“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”意指包含任何水溶性的聚(环氧乙烷)。通常，依照本发明使用的PEG包含以下结构“-O(CH₂CH₂O)_m-，其中(m)为2至4000。如本文所用的，取决于末端的氧是否被取代，PEG还包括“-CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-”和“-(CH₂CH₂O)_m-。当PEG进一步含有间隔基部分时(将在下文更详细地描述)，构成所述间隔基部分的原子在与水溶性聚合物段共价连接时不会导致氧-氧键(即“-O-O-”或过氧化物键合)的形成。在整个说明书和权利要求书中，应记住的是术语“PEG”包含具有不同末端或“封端”基团等等的结构。术语“PEG”还意指含有多数即大于50％的-CH₂CH₂O-单体亚基的聚合物。关于具体形式，如下文中将更详细描述的，PEG可采用任何数量的不同分子量以及各种结构或几何形状，例如“支链的”、“线性的”、“叉状的”、“多官能的”以及类似结构。

术语“封端的(end-capped)”或“封末端的(terminally capped)”在本文可互换使用来指聚合物的末端或端点具有封端部分。通常，尽管不是必须的，封端部分包括羟基或C_1-20烷氧基基团。因此，封端部分的实例包括烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和苄氧基)，以及芳基、杂芳基、环、杂环以及类似基团。此外，可预想上述基团中每一种的饱和、不饱和、取代和未取代的形式。而且，封端基团也可是硅烷。封端基团还可有利地包括可检测的标记。当聚合物具有包含可检测的标记的封端基团时，可通过使用适合的检测器测定聚合物和/或与聚合物偶联的感兴趣的部分(例如活性剂)的数量或定位。这些标记包括，但不限于荧光剂、化学发光剂(chemiluminescer)、用于酶标记的部分、比色剂(colorimetric)(例如染料)、金属离子、放射性部分及类似物。适合的检测器包括光度计、胶片、分光计以及类似检测器。

对于聚合物或水溶性聚合物来说“非天然存在的”意指作为整体不能在自然界中找到的聚合物。然而，非天然存在的聚合物或水溶性聚合物可含有一种或多种天然存在的亚基或亚基的部分，只要总体的聚合物结构在自然界中不能找到即可。

术语“水溶性聚合物”是于室温在水中可溶解的任何聚合物。通常，水溶性聚合物将透射由同样的溶液过滤后透射的光的至少约75％，更优选地至少约95％。以重量为基准，水溶性聚合物将优选地至少约35％(按重量计)溶于水中，更优选地至少约50％(按重量计)溶于水中，还更优选地约70％(按重量计)溶于水中，并且还更优选地约85％(按重量计)溶于水中。然而，还更优选的是水溶性聚合物约95％(按重量计)溶于水中，并且最优选的是水溶性聚合物完全溶于水中。

在本发明的水溶性聚合物(例如PEG)的背景下分子量可表示为数均分子量或重均分子量。除非以其他方式指出，否则本文所有提到的分子量是指重均分子量。数均分子量和重均分子量这两种分子量的确定，可使用凝胶渗透色谱或其他液相色谱技术测量。也可使用测量分子量值的其他方法，例如使用端基分析或依数性的测量(例如凝固点降低、沸点升高或渗透压)来确定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心或粘度测量法来确定重均分子量。本发明的聚合物通常是多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有优选小于约1.2，更优选地小于约1.15，还更优选地小于约1.10，甚至更优选地小于约1.05以及最优选地小于约1.03的低多分散性值。

如本文所用的，术语“羧酸”是具有

官能团[也表示为“-COOH”或-C(O)OH]的部分，以及作为羧酸衍生物的部分，这些衍生物包括，例如已保护的羧酸。因此，除非上下文中以其他方式明确指出，术语羧酸不仅仅包括酸形式还包括相应的酯和已保护的形式。关于适合于羧酸和本文描述的任何其他官能团的保护基团，参考Greene等人，″PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS″(有机合成中的保护基团)第三版，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1999。

当连同具体的官能团使用时，术语“反应性的”和“活化的”是指易于与另一个分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与那些需要强催化剂或非常不切实际的反应条件以便反应的基团(即“非反应性的”或“惰性的”基团)相反。

术语“已保护的”、“保护基团”和“保护性基团”是指在某些反应条件下阻止或阻碍分子中特定的化学反应性官能团的反应的部分(即保护基团)的存在。保护基团将依赖于被保护的化学反应性官能团的类型以及将使用的反应条件和分子中另外的反应性或保护基团的存在(如果有的话)而变化。本领域中已知的保护基团可见于Greene等人，见前。

如本文中所用的，术语“官能团”或其任何同义词意指包含其已保护的形式。

本文所用的术语“间隔基”或“间隔基部分”是指任选地出现在一个部分和另一个部分之间的原子或原子集合。间隔基部分可以是水解稳定的或可含有一个或多个生理上可水解的或酶促可释放的键合。

如本文所用的，“有机基”包括例如烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基。

“烷基”是指长度上范围通常从约1至20个原子的烃链。这种烃链优选但不必须是饱和的并且可是支链的或直链，尽管通常直链是优选的。示例性烷基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基以及类似基团。如本文所用的，“烷基”包括环烷基(当涉及三个或更多碳原子时)和低级烷基。

如通过甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基所示例的，“低级烷基”是指含有从1至6个碳原子的烷基基团，并且可以是直链或支链的。

“环烷基”是指饱和的或不饱和的环状烃链，包括桥环、稠环或螺环化合物，优选地由3至约12个碳原子，更优选地由3至约8个碳原子组成。

“非干扰取代基(non-interfering substituent)”是当存在于分子中时通常与分子中含有的其他官能团不反应的那些基团。

如在例如“取代的烷基”中的术语“取代的”是指由一个或多个非干扰取代基取代一个或多个氢原子的部分(例如烷基基团)，所述取代基例如但不限于：C₃-C₈环烷基，诸如环丙基、环丁基以及类似基团；卤素，诸如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低级苯基；取代的苯基；以及类似取代基。“取代的芳基”是具有作为取代基的一个或多个非干扰基团的芳基。对于苯环上的取代，取代基可以在任何方位(即邻位、间位或对位)。“取代的铵”是具有作为取代基的一个或多个非干扰基团(例如有机基)的铵。

“烷氧基”是指-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C₁-C₂₀烷基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、苄基等)，更优选C₁-C₇烷基。

如本文所用的，“烯基”是指含有至少一个双键的2至15个原子长度的支链或无支链的烃基。示例性烯基包括(但不限于)乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基以及类似基团。

如本文所用的，术语“炔基”是指含有至少一个三键的2至15个原子长度的支链或无支链的烃基。示例性炔基包括(但不限于)乙炔基、正丁炔基、异戊炔基、辛炔基、癸炔基等等。

“芳基”意指每个环有5或6个核心碳原子的一个或多个芳族环。芳基包括可稠合的(如萘基中)或未稠合的(如联苯基中)多个芳基环。芳基环还可与一个或多个环状烃环、杂芳基环或杂环型环稠合或不稠合。如本文所用的，“芳基”包括杂芳基。含芳族部分(例如Ar¹、Ar²等等)意指含有芳基的结构。

“杂芳基”是含有从一至四个杂原子，优选N、O或S或者其组合的芳基基团。杂芳基环还可与一个或多个环状烃环、杂环型环、芳基环或杂芳基环稠合。

“杂环”或“杂环型”意指具有或没有不饱和或芳族特性并具有至少一个不是碳的环原子的5-12个原子优选5-7个原子的一个或多个环。优选的杂原子包括硫、氧和氮。

“取代的杂芳基”是具有作为取代基的一个或多个非干扰基团的杂芳基。

“取代的杂环”是具有从非干扰取代基形成的一个或多个侧链的杂环。

“亲电体”是指离子或原子或原子的集合，其可是离子性的，具有一个亲电中心，即寻求电子、能够与亲核体反应的中心。

“亲核体”是指离子或原子或原子的集合，其可是离子性的，具有一个亲核中心，即寻求亲电中心或与亲电体反应的中心。

“生理上可裂解的”以及“可水解的”键是在生理条件下与水反应(即被水解)的相对弱的键。在水中键水解的倾向性将不仅仅取决于连接两个中心原子的键合的一般类型还取决于与这些中心原子连接的取代基。示例性的可水解的键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺和原酸酯。

“可释放的键合”包括但不限于，生理上可裂解的键、可水解的键和酶促可降解的键合。因此“可释放的键合”是在生理条件下可经历水解或一些别的机制(例如酶催化的、酸催化的、碱催化的等等)的裂解的键合。例如，“可释放的键合”可涉及具有碱性移去(baseabstraction)质子(例如可电离的氢原子，H_α)作为驱动力的消除反应。对于本文的目的，“可释放的键合”是“可降解的键合”的同义词。

“酶促可释放的键合”意指经受一种或多种酶的降解的键合。

“水解稳定的”键合或键是指化学键，通常是共价键，其在水中基本稳定，即在生理条件下持久的时间段内不会经历水解至任何可察觉的程度。水解稳定的键合的实例包括但不限于下列：碳-碳键(例如在脂肪链中)、醚、酰胺以及类似键合。一般地，水解稳定的键合是在生理条件下表现出低于约1-2％每天的水解速率的键合。代表性的化学键的水解速率可在大部分标准化学教科书中找到。必须指出的是一些键合取决于(例如)邻近的和相邻原子以及环境条件可是水解稳定或可水解的。本领域普通技术人员可通过例如将感兴趣的含键合的分子放置于感兴趣的条件下并检测水解的证据(例如从单一分子裂解得来的两种分子的存在和数量)来确定给定的键合或键在给定的背景下是水解稳定的还是可水解的。也可使用本领域普通技术人员所知的用于确定给定的键合或键是水解稳定的还是可水解的其他方法。

术语“活性剂”、“生物活性剂”和“药理活性剂”在本文是可互换使用的并被定义为包括提供能在体内或体外被证明的一些药理(常常是有益的)作用的任何剂、药物、化合物、物质组合物或混合物。这包括食品补充剂、营养品、营养药、药物、蛋白质、疫苗、抗体、维生素和其他有益剂。如本文所用的，这些术语进一步包括在患者中产生局部或系统作用的任何生理或药理活性物质。

“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可被包含于本发明组合物中并对患者不产生显著的不利的毒理作用的赋形剂。

“药理上有效的量”、“生理上有效的量”和“治疗上有效的量”在本文可互换地用来意指对于在血流或目标组织中提供所期望的活性剂和/或轭合物水平来说所需要的聚合物-活性剂轭合物(通常以药物制品存在)的量。准确的量将依赖于许多因素例如具体的活性剂、药物制品的成分和物理特性、预期的患者群体、患者原因(patientconsideration)以及类似因素，并且可由本领域普通技术人员，基于本文提供的和相关文献中可得到的信息容易地确定。

在聚合物背景下的“多官能”意指具有3个或更多包含于其中的官能团的聚合物，其中官能团可以是相同的或不同的。多官能聚合物通常在聚合物内含有从约3-100个官能团，或从3-50个官能团，或从3-25个官能团，或从3-15个官能团，或从3至10个官能团，或含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。“双官能”聚合物意指具有两个包含于其中的相同(即同双官能(homodifunctional))或不同(即杂双官能(heterodifunctional))的官能团的聚合物。

“支链的”，与聚合物的几何结构或总体结构有关，意指具有2个或更多聚合物“臂”的聚合物。支链聚合物可具有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、6个聚合物臂、8个聚合物臂或更多。树枝状的聚合物或树枝状大分子(dendrimer)是一种特殊类型的高支链聚合物，对本发明的目的来说，其被认为具有与支链聚合物不同的结构形式。

“树枝状大分子”或树枝状的聚合物是球状的、尺寸单一分布的聚合物，其中所有键以规则的分枝模式并以重复的单元(每个提供一个分枝点)放射状地从中心焦点或核心形成。树枝状大分子表现出某些树枝状的状态特性(例如核心包裹)，使得它们与其他类型的聚合物相比是独特的。

本文描述的碱性或酸性反应物包括中性的、带电的以及其任何相应的盐形式。

术语“患者”是指患有或易于患有可通过施用本文提供的轭合物预防或治疗的疾病(condition)的活生物体，并包括人类和动物。

如本文所用的，“药物释放速率”是指系统中聚合物-活性剂轭合物的总量的一半裂解为活性剂和聚合物残基的速率(表述为半衰期)。

“任选的”和“任选地”意指随后描述的情况可发生或可不发生，以致于所述描述包括情况发生的实例和情况不发生的实例。

如本文所用的，一般在卤素被连接至分子时使用“卤”标识(例如，氟、氯、碘、溴等)，而在卤素以其独立的离子形式(例如，诸如在离去基团离开分子时)存在时使用后缀“化物”(例如氟化物、氯化物、碘化物、溴化物等等)。

在本发明讨论的背景下，应当认识到的是除非上下文中以其他方式指出，在一种结构或式方面所提供的变量的定义适用于在不同结构中重复的相同的变量。

如上文表述的，本发明包含(除了别的以外)具有可释放的键合的轭合物。

在描述本发明的示例性轭合物之前，将讨论水溶性聚合物和能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合(例如氨基甲酸酯键合)的官能团的实施方案。

关于给定的水溶性聚合物，每种水溶性聚合物(例如POLY、POLY¹和POLY²)可包含任何聚合物，只要所述聚合物是水溶性并且非肽的。尽管优选聚(乙二醇)，但本文所用的水溶性聚合物可是例如其他水溶性聚合物例如其他的聚(烷撑二醇)[也称为“聚(环氧烷烃)”]，诸如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物以及类似物、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)，诸如美国专利第5,629,384中所描述的那些。水溶性聚合物可是前述任何聚合物的均聚物、共聚物、三元共聚物、非无规嵌段聚合物和无规嵌段聚合物。此外，水溶性聚合物可是线性的但也可是如下文中将进一步详细描述的其他形式(例如，支链的、叉状的、以及类似形式)。在存在于总体结构中的背景下，水溶性聚合物具有从1至约300个末端。

在聚合物试剂包含两种或更多水溶性聚合物的实例中，总体结构中每种水溶性聚合物可是相同或不同的。然而优选的是总体结构中所有水溶性多聚物是相同类型的。例如给定的结构中所有水溶性聚合物是聚(乙二醇)聚合物是优选的。

尽管任何个别的水溶性聚合物的重均分子量可以变化，但任何给定的水溶性聚合物的重均分子量将通常在以下范围内：100道尔顿至约150,000道尔顿。然而，示例性范围包括下列范围内的重均分子量：从约880道尔顿至约5,000道尔顿的范围内；大于5,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内；从约6,000道尔顿至约90,000道尔顿的范围内；从约10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内；大于10,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内；从约20,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内；从约53,000道尔顿至约85,000道尔顿的范围内；从约25,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内；从约29,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内；从约35,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内；约880道尔顿至约60,000道尔顿的范围内；约440道尔顿至约40,000道尔顿的范围内；约440道尔顿至约30,000道尔顿的范围内；以及从约40,000道尔顿至约120,000道尔顿的范围内。对于任何给定的水溶性聚合物，具有在一个或更多这些范围内的分子量的PEG是优选的。

水溶性聚合物的示例性重均分子量包括：约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约440道尔顿、约500道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约1,500道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约4,500道尔顿、约5,000道尔顿、约5,500道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约16,000道尔顿、约17,000道尔顿、约18,000道尔顿、约19,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约45,000道尔顿、约50,000道尔顿、约55,000道尔顿、约60,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿和约75,000道尔顿。也可使用具有任何前述的总重均分子量的水溶性聚合物的支链形式(例如，由两个20,000道尔顿的聚合物组成的支链的40,000道尔顿的水溶性聚合物)。

用于制备轭合物的聚合物试剂将含有至少一种水溶性聚合物，该水溶性聚合物具有在适合以期望速率释放由其形成的轭合物的范围内的总尺寸。例如具有相对长的释放速率的轭合物可从具有某一尺寸的聚合物试剂制备，所述尺寸适合于(a)从轭合物释放活性剂前持久的循环，并且(b)从轭合物释放时适度迅速的在体内清除从轭合物释放的物类(species)。相似地，当轭合物具有相对快的释放速率时，那么聚合物试剂通常具有较低的分子量。

当PEG被用作聚合物试剂中的水溶性聚合物时，PEG通常含有大量的(OCH₂CH₂)单体[或(CH₂CH₂O)单体，取决于如何定义PEG]。如在整个描述中所用的，通过“(OCH₂CH₂)_n”中的下标n确定重复单元的数量。因此，(n)的值通常属于一个或多个以下的范围中：从2至约3400、从约4至约1500、从约100至约2300、从约100至约2270、从约136至约2050、从约225至约1930、从约450至约1930、从约1200至约1930、从约568至约2727、从约660至约2730、从约795至约2730、从约795至约2730、从约909至约2730以及从约1,200至约1,900。对于任何分子量已知的给定的聚合物，通过用聚合物的总重均分子量除以重复单体的分子量来确定重复单元的数量(即“n”)是可能的。

每种水溶性聚合物通常是生物相容并且非免疫原性的。关于生物相容性，如果单独或与另一种物质(例如活性剂)一起使用一种物质对活体组织(例如对患者施用)带来的有益的作用由临床医生(例如内科医生)评估为超过任何有害的作用，那么该物质被认为是生物相容的。关于非免疫原性，如果一种物质单独或与另一种物质一起使用对于活体组织不会产生免疫应答(例如抗体的形成)，或者如果产生了免疫应答，经临床医生评估认为这种免疫应答不认为是临床显著或重要的，那么这种物质被认为是非免疫原性的。本文描述的水溶性聚合物以及活性剂与聚合物的轭合物为生物相容的和非免疫原性的是特别优选的。

在一种有用的形式中，游离或未结合的PEG是在每端部以羟基基团封端的线性聚合物：

HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m′-CH₂CH₂-OH

其中(m′)范围通常为从0至约4,000，优选地从约20至约1,000。

上文的聚合物，α-、ω-二羟基聚(乙二醇)可以简略形式表示为HO-PEG-OH，其中应当理解的是-PEG-符号可代表下列结构单元：

-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m′-CH₂CH₂-

其中(m′)如上文定义。

本发明中有用的另一种类型的游离或未结合的PEG是甲氧基-PEG-OH，或简单地为mPEG，其中一个末端是相对惰性的甲氧基基团，而另一个末端是羟基基团。下文给出mPEG的结构：

CH₃O-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m′-CH₂CH₂-

其中(m′)如上文定义。

多臂或支链的PEG分子，例如美国专利第5,932,462号中描述的那些，也可被用作PEG聚合物。例如PEG可具有如下结构：

其中：

poly_a和poly_b是PEG主链(相同或不同)，例如甲氧基聚(乙二醇)；

R″是非反应性的部分，例如H、甲基或PEG主链；并且

P和Q是非反应性的键合。在优选的实施方案中，支链的PEG聚合物是赖氨酸双取代的甲氧基聚(乙二醇)。

此外，PEG可包括叉状的PEG。游离或未结合的叉状的PEG的实例通过下式表示：

其中：X是间隔基部分并且每个Z是通过已定义的长度的原子链连接于CH的活化的末端基团。将Z官能团连接至分支的碳原子的原子链起到系链基团(tethering group)的作用并可包括例如烷基链、醚链、酯链、酰胺链及其组合。美国专利第6,362,254号公开了能够用于本发明的不同的叉状的PEG结构。

PEG聚合物可含有具有沿着PEG链的长度而不是在PEG链的端部共价相连的反应性基团(例如羧基)的侧PEG分子。侧反应性基团可直接或通过间隔基部分(例如烷撑)与PEG相连。

除了上文描述的PEG形式外，还可用聚合物(包括任何上文描述的聚合物)中的一种或多种弱的或可释放的键合制备聚合物试剂中的每种水溶性聚合物。例如，可用经受水解的聚合物中的酯键合制备PEG。如下文所示，这一水解导致聚合物裂解为较低分子量的片段：

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O→-PEG-CO₂H+HO-PEG-

在聚合物主链中可用作可释放的键合的其他水解可释放的键合包括碳酸酯键合；由例如胺和醛反应产生的亚胺键合(参见，例如Ouchi等人(1997)Polymer Preprints 38(1)：582-3)；由例如醇和磷酸基团反应形成的磷酸酯键合；通常由酰肼和醛反应形成的腙键合；通常由醛和醇之间的反应形成的缩醛键合；通过例如甲酸酯和醇之间的反应形成的原酸酯键合；由胺基团(例如在聚合物诸如PEG的端部)和另一个PEG链的羧基基团形成的酰胺键合；由例如具有末端异氰酸酯基团的PEG和PEG醇的反应形成的聚氨酯键合；由胺基团(例如在聚合物诸如PEG的端部)和肽的羧基基团形成的肽键合；由例如亚磷酰胺基团(例如在聚合物端部)和寡核苷酸的5′羟基基团形成的寡核苷酸键合。

本领域普通技术人员应当理解的是，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包含上文中所有PEG的形式。

本领域普通技术人员应认识到基本上关于水溶性聚合物的前述讨论绝不是穷尽的而仅仅是示例性说明的，并且具有上文描述的特性的所有聚合物材料是被涵盖的。如本文所用的，术语“水溶性聚合物”既指分子也指已连接至另一个部分的水溶性聚合物残基。水溶性聚合物的下列描述不仅适用于聚合物试剂，也适用于使用所述聚合物试剂形成的相应的轭合物。

用于形成本文描述的轭合物的聚合物试剂的官能团是能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合(例如氨基甲酸酯键合)的官能团。本发明并不限于具体的官能团，只要所述官能团能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合(例如氨基甲酸酯键合)。能够与活性剂的氨基基团反应的示例性官能团包括选自由反应性的碳酸酯(例如N-琥珀酰亚胺基、1-苯并三唑基、咪唑)，碳酸卤化物(carbonate halide)(诸如碳酸氯化物和碳酸溴化物)，苯酚盐(诸如对硝基苯酚盐)等等组成的组的那些官能团。同样，作为特殊的实例，如果可获得具有将活性胺基团转换为异氰酸酯或异硫氰酸酯基团的活性剂，那么当这些组分的反应提供可释放的氨基甲酸酯键合时聚合物试剂的官能团可是羟基。

现在将进一步详细地描述示例性聚合物试剂。必须记住的是尽管任何式或结构(无论聚合物试剂的、轭合物的还是任何其他的式或结构)中未特别展示立体化学，但所提供的式或结构涵盖两种对映异构体以及含有等量的每种对映异构体的混合物(即外消旋混合物)和不等量的混合物的组合物。

示例性聚合物试剂具有下列结构：

其中

POLY¹是第一水溶性聚合物；

POLY²是第二水溶性聚合物；

X¹是第一间隔基部分；

X²是第二间隔基部分；

H_α是可电离的氢原子；

R¹是氢或有机基；

R²是氢或有机基；

(a)是0或1；

(b)是0或1；

R^e1，当存在时，是第一电子改变基团；

R^e2，当存在时，是第二电子改变基团；并且

(FG)是能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合(例如氨基甲酸酯键合)的官能团。

示例性聚合物试剂属于下式：

其中，在每个实例中，(FG)是能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合(例如氨基甲酸酯键合)的官能团；R¹是H或有机基；并且R²是H或有机基。

还有其他的示例性聚合物试剂具有如下结构：

其中，POLY¹、POLY²、X¹、X²、R¹、R²、H_α和(FG)中的每一个都如前文定义，并且R^e1是第一电子改变基团；以及R^e2是第二电子改变基团。

还有其他的示例性聚合物试剂属于下列结构：

其中对于每一个结构以及在每一个实例中，(n)独立地为从4至1500的整数。

可用许多种方法中的任何一种制备聚合物试剂。因此，聚合物试剂的合成不限于在它们的制备中使用的特定的技术或方法。

在一种制备可用于制备本文描述的轭合物的聚合物试剂的方法中，所述方法包括：(a)提供载有第一连接位点、第二连接位点和任选的第三连接位点的含芳族部分；(b)将官能团试剂与第一连接位点反应以形成载有能与活性剂的氨基基团反应的官能团的第一连接位点并形成可释放的键合例如氨基甲酸酯；以及(c)将载有活性基团的水溶性聚合物与第二连接位点和(当存在时)任选的第三连接位点反应以产生(i)经由间隔基部分载有水溶性聚合物的第二连接位点以及(ii)经由间隔基部分载有第二水溶性聚合物的任选的第三连接位点(当存在时)。在某些实例中，(b)在步骤(c)之前进行，而在其他的实例中(c)在步骤(b)之前进行。

因此，在这一制备聚合物试剂的方法中，必需的步骤是(a)提供载有第一连接位点、第二连接位点和任选的第三连接位点的含芳族部分。在合成性制备的背景下，应当理解的是“提供”材料意指获得该材料(通过，例如，合成它或商业获得它)。为了示例性说明的目的，示例性的含芳族部分为下文所示的9-羟甲基-2，7-二氨基芴。

这一含芳族部分，9-羟甲基-2，7-二氨基芴，是含芳族部分的一个实例，其具有三个连接位点：9位的羟基基团和各在2和7位的氨基基团。可以碱或盐的形式提供含芳族部分。关于9-羟甲基-2，7-二氨基芴，可使用二氢氯化物形式。可通过合成性制备和/或从商业供应者购买来提供其他含芳族部分。

已提供了含芳族部分，所述方法中的另一个步骤概括地包括将载有反应性基团的水溶性聚合物与含芳族部分上的连接位点反应。在此，可使用任何本领域已知的用于将水溶性聚合物与含芳族部分上的一个或多个连接位点连接的方法并且所述方法不限于特定的方式。例如，可将胺反应性的PEG(例如，N-琥珀酰亚胺酯封端的mPEG，其产生于诸如以二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)为缩合剂的并任选地在碱存在的情况下的N-羟基琥珀酰亚胺和CH₃O-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)-OCH₂C H₂-OCH₂COOH的反应)与载有含芳族部分的胺(例如9-羟甲基-2，7-二氨基芴)反应。

在某些实例中，载有反应性基团的水溶性聚合物与含芳族部分的反应将导致所有可能的连接位点都具有连接于其上的水溶性聚合物。在这样的情况下，必须除去至少一个水溶性聚合物以便使连接位点可供与官能团试剂反应之用。因此，例如，上一段中讨论过的N-琥珀酰亚胺酯封端的mPEG与9-羟甲基-2，7-二氨基芴的反应产生混合物，其包含(a)载有两个水溶性聚合物的物类，两个胺位点中的每个上载有一个，以及(b)载有三个水溶性聚合物的物类，两个胺位点中的每个上载有一个，以及羟基位点上载有一个。在此，通过使用尺寸排阻色谱可除去并收集较高分子量的物类。此外，可将混合物处理至高pH[例如用氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)处理混合物]，之后进行离子交换色谱(IEC)。在任何一个实例中，产物是主要含有载有两个水溶性聚合物的9-羟甲基-2，7-二氨基芴的组合物，两个胺位点中的每个上载有一个。由此第三个羟基位点可供与官能团试剂反应之用。

最后的步骤是将含芳族部分的反应性位点与官能团试剂反应。优选的方式是将含羟基的9-羟甲基-2，7-二氨基芴(载有两个水溶性聚合物，两个胺位点中的每个上载有一个)与三光气反应，之后用N-琥珀酰亚胺处理。以这种方法，能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合例如氨基甲酸酯键合(在这一实例中，“活化的碳酸酯”)的官能团在含羟基的反应性位点形成。

无论使用哪种方式，合成方法的步骤在适当的溶剂中进行。本领域普通技术人员可确定任何具体的溶剂是否适于任何给定的反应。然而，通常溶剂优选地为非极性的溶剂或极性非质子溶剂。非极性溶剂的非限制性实例包括苯、二甲苯、二噁烷、四氢呋喃(THF)、叔丁醇和甲苯。尤其优选的非极性溶剂包括甲苯、二甲苯、二噁烷、四氢呋喃和叔丁醇。示例性极性非质子溶剂包括但不限于DMSO(二甲基亚砜)、HMPA(六甲基磷酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)。

制得后，可将聚合物试剂分离。可用已知的方法分离聚合物试剂，但使用色谱法，例如尺寸排阻色谱是尤其优选的。可选地或另外地，所述方法包括聚合物试剂形成后将其纯化的步骤。再次，可使用标准的本领域已知的纯化方法纯化聚合物试剂。

聚合物试剂对水分和氧敏感并理想地在惰性气氛下例如在氩气下或在氮气下并于低温贮存。以这样的方法，减小或彻底避免与例如大气中的氧有关的可能的降解过程。在某些实例中，为避免氧化降解，可在贮存前将抗氧化剂例如丁羟甲苯(BHT)加至聚合物试剂。此外，优选将与贮存环境有关的水分的量最小化以减少与水有关的可能的损害性反应例如活性酯的水解。而且，优选将贮存环境保持黑暗以避免某些涉及光的降解过程。因此，优选的贮存条件包括下列中的一项或多项：在干燥的氩气或另一种干燥的惰性气体下贮存；在低于约-15℃的温度下贮存；在无光的条件下贮存；与适量(例如百万分之约50至约500)的抗氧化剂例如BHT一起贮存。

上述的聚合物试剂可用于与生物活性剂的轭合。例如，将活性剂上的氨基基团(例如伯胺)与能与活性剂的氨基基团反应以生成可释放的键合(例如氨基甲酸酯键合)的官能团反应。

示例性轭合物包括下式的那些：

其中：

POLY¹是第一水溶性聚合物；

POLY²是第二水溶性聚合物；

X¹是第一间隔基部分；

X²是第二间隔基部分；

H_α是可电离的氢原子；

R¹是H或有机基；

R²是H或有机基；

(a)是0或1；

(b)是0或1；

R^e1，当存在时，是第一电子改变基团；

R^e2，当存在时，是第二电子改变基团；并且

Y¹是O或S；

Y²是O或S；并且

示例性轭合物具有下列结构：

其中，对于每个结构以及在每个实例中，(n)独立地为从4至1500的整数，并且(vWF/F8)是选自由血管性血友病因子部分和因子VIII部分所组成的组的生物活性剂的残基。

可与如本文所描述的聚合物试剂轭合的生物活性剂是含胺的生物活性剂，通常，生物活性剂是具有大于约3,500道尔顿的分子量的大分子，例如多肽。药理活性多肽表示优选类型的生物活性剂。应理解的是，对于本发明讨论的目的，术语“多肽”是寡肽和蛋白质的总称。对多肽而言，与聚合物试剂偶联的胺可在N末端或多肽中氨基酸(例如赖氨酸)的含胺侧链上。

本发明还提供了制备轭合物的方法，其包括在适于在聚合物和生物活性剂之间形成共价连接的条件下将聚合物试剂与生物活性剂接触的步骤。通常以等摩尔的量(相对于所需要的适于与反应性基团反应的基团的数)或摩尔过量将聚合物加入活性剂中或表面上。例如，可将聚合物试剂以约1∶1(聚合物试剂∶活性剂)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1的摩尔比加至目标活性剂。使轭合反应进行直到基本上没有进一步的轭合发生，其一般通过随时间监测反应的过程来确定。可通过在不同的时间点从反应混合物取出等份试样并通过SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱分析或任何其他适合的分析方法分析反应混合物来监测反应的过程。一旦达到关于形成的轭合物的数量或剩余的未轭合的聚合物的数量的平稳期，则认为反应完成。通常轭合反应无论在何处发生均需要几分钟至若干小时(例如从5分钟至24小时或更久)。优选，但不必须地将所得的产物混合物纯化以分离出过量的试剂、未轭合的反应物(例如活性剂)、不需要的多轭合物类以及游离或未反应的聚合物。之后可使用分析方法例如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳和/或色谱进一步鉴定所得的轭合物。

表征轭合物的连接的程度(即与蛋白质连接的聚合物试剂的数，其经常按照轭合物的组合物范围中的平均数表示)是可能的。为确定蛋白质轭合物上的水溶性聚合物分子的平均数，可使用分析技术例如SDS-PAGE、SEC、IEC、MALDI-TOF等等。在水溶性聚合物连接之后使用TNBSA对蛋白质上残留的伯胺进行分光光度测定已得到对连接程度的定性和定量的估计。对于血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物，连接的程度在SDS-PAGE的基础上被定性的描述为低、中和高。当通过SDS-PAGE在还原条件下分析可释放的血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物的连接程度时，在样品处理和电泳期间水溶性聚合物的释放可导致对PEG化真实程度的总体上的低估。

一种确定基于PEG的聚合物连接的程度的方式是对Nag和Barker的工作的改进。参见Nag等人(1996)Anal.Biochem.237：224-231和Barker等人(2001)Anal.Biochem.290：382-385。所述方法基于在PEG存在的情况下(由于生色团本身在没有PEG存在的情况下不能被萃取至氯仿相中)生色团(硫氰酸铁铵)从水相分配入氯仿相的原理。通过链霉蛋白酶消化血管性血友病因子从轭合物游离PEG，并且随后通过硫氰酸铁铵方法确定PEG的量。使用这一原理，已开发了绕开需要氯仿萃取的反相HPLC方法以确定本文描述的轭合物的连接程度。

对于聚合物-活性剂轭合物，可将所述轭合物纯化以获得/分离不同的轭合的物类。对于低分子量(例如小于约2万道尔顿，更优选的小于约1万道尔顿)的聚合物来说可选择地，并且更优选地，可将产物混合物纯化以获得每活性剂水溶性聚合物片段的分布。例如，可将产物混合物纯化以获得平均每活性剂(例如多肽)任意处从一个至五个的PEG。最终的轭合反应混合物的纯化的策略将取决于许多因素，包括例如，所用的聚合物的分子量、具体的活性剂、期望的给药方案以及个别轭合物的残余活性和体内特性。

如果需要，可使用凝胶过滤色谱分离具有不同分子量的轭合物。即凝胶过滤色谱被用于将不同数目的聚合物比活性剂比率(例如1-聚合物、2-聚合物、3-聚合物等等，其中“1-聚合物”指1个聚合物比活性剂，“2-聚合物”指两个聚合物比活性剂，等等)在其不同的分子量的基础上(其中所述不同实质上相应于水溶性聚合物片段的平均分子量)分级。例如在一个100kDa蛋白质随机地与具有约20kDa分子量的聚合物试剂轭合的示例性反应中，所得的反应混合物将很可能含有未修饰的蛋白质(MW 100kDa)、单PEG化的蛋白质(MW 120kDa)、双PEG化的蛋白质(MW 140kDa)等等。尽管这一方法可被用于分离PEG和其他具有不同分子量的聚合物轭合物，但这一方法通常对分离蛋白质中具有不同的聚合物连结位点的位置异构体无效。例如，凝胶过滤色谱可被用于从PEG 1-聚合物、2-聚合物、3-聚合物等等的彼此的混合物中分离，虽然每一种回收的PEG聚合物组合物可含有连接于活性剂中不同反应性氨基基团(例如赖氨酸残基)的PEG。

适于进行这一类型分离的凝胶过滤柱包括可从AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)获得的Superdex和Sephadex柱。具体的柱的选择将取决于所需要的分级范围。通常使用适合的缓冲液例如磷酸盐、乙酸盐或类似缓冲液进行洗脱。可通过许多不同的方法分析收集的级分，所述方法例如(i)在280nm测定蛋白质含量的光密度(OD)，(ii)牛血清白蛋白(BSA)蛋白质分析，(iii)PEG含量的碘试验[Sims等人(1980)Anal.Biochem，107：60-63]，以及(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后用碘化钡染色。

通过使用了反相高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)的反相色谱或通过使用了离子交换柱(例如可从Amersham Biosciences获得的Sepharose 离子交换柱)的离子交换色谱进行位置异构体的分离。可用这两者中的任一种方式分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(位置异构体)。

在与本文所介绍的聚合物的偶联中使用的含胺的生物活性剂可是血管性血友病因子部分或因子VIII部分。

关于血管性血友病因子部分(″vWF″)，可用于本发明的血管性血友病因子部分包括与天然的人类血管性血友病因子具有相同活性(但不必须是相同程度的活性)的任何蛋白质并包括天然的人类血管性血友病因子的所有形式(包括单体和多聚体形式)。有用的形式包括至少两种血管性血友病因子的同多聚体(homomultimer)。血管性血友病因子部分可是生物活性衍生物，或者在仅仅被用作因子VIII的稳定剂的时候，血管性血友病因子部分可是无生物活性的形式。还应当知道的是本发明包括不同形式的血管性血友病因子部分来以组合的形式使用。例如，可用于本发明的组合物可包含不同的多聚体、不同的衍生物以及生物活性衍生物和无生物活性的衍生物。

可在两种不同的体外测定中测量血管性血友病因子部分的生物活性(Turecek等人，(2002)Semin.Thromb.Hemost.28：149-160)。瑞斯托菌素辅因子测定是在具有血管性血友病因子活性的蛋白质存在的情况下以由抗生素瑞斯托菌素诱导的新鲜的福尔马林固定的血小板的凝集为基础的。血小板凝集的程度取决于蛋白质浓度并可通过比浊(turbidimetic)测定法例如通过使用血小板凝集计来测量(Weiss等人，(1973)J.Clin.Invest.52：2708-2716；Macfarlane等人(1975)Thromb.Diath.Haemorrh.34：306-308)。第二种方法是胶原结合测定，其是以ELISA技术为基础的(Brown等人(1986)Thromb.Res.43：303-311；Favaloro(2000)Thromb.Haemost.83：127-135)。用I或III型胶原涂抹微量滴定板。将所提议血管性血友病因子部分结合至胶原表面并随后用酶标记的多克隆抗体检测。最后的步骤是底物反应，其可用ELISA读数器进行光度监测。这些方法可用于确定部分本身(因此可作为“血管性血友病因子部分”使用)以及相应的聚合物-部分轭合物的血管性血友病因子活性。

血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物和因子VIII-水溶性聚合物轭合物是有生物(iologically)活性的并与它们相应的未轭合的形式相比表现出增加的体内半衰期。可如下文的实施例5和6中所述，通过在因子VIII缺陷型的小鼠中测量轭合物、血管性血友病因子和因子VIII的药代动力学来评价体内半衰期的增加。简单地说，用与因子VIII预混的血管性血友病因子或者血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物或因子VIII-水溶性聚合物轭合物经由尾静脉快速浓注处理因子VIII缺陷型小鼠，并在不同的时间点测量血浆样品中血管性血友病因子抗原的水平。此外，可用因子VIII、或者血管性血友病因子-水溶性聚合物轭合物或因子VIII-水溶性聚合物轭合物的快速浓注处理因子VIII缺陷型小鼠，并在不同时间点测量血浆样品中因子VIII的抗原水平。可经由ELISA测定测量血管性血友病因子抗原和因子VIII抗原。

血管性血友病因子部分包括血浆源性血管性血友病因子和重组的血管性血友病因子。可通过本领域已知的任何方法生产血管性血友病因子部分。WO 86/06096中公开了一个具体的实例。

关于因子VIII部分，可用于本发明的因子VIII部分包括与天然的人类因子VIII具有相同活性(但不必须是相同程度的活性)的任何蛋白质。2,351个氨基酸，结构组织为A1-A2-B-A3-C1-C2的单链糖蛋白质的天然的人类因子VIII作为可能的因子VIII部分被包含。然而，当表达的多肽被移位至内质网的内腔中，一个19个氨基酸的信号序列被剪切，产生第二序列。此处所提供的这一第二序列缺少前19个氨基酸。应当理解的是因子VIII部分不仅限于因子VIII的“活性”形式(例如因子VIIIa)，术语“因子VIII部分”包含“前体”形式以及具有相似促凝血作用的其他物质。

对于任何给定的部分，确定该部分是否具有因子VIII活性是可能的。例如，已有意培养了具有血友病遗传突变的几种动物系以使从这样的系产生的动物具有非常低和不足的因子VIII水平。这些系可从不同的来源获得，例如但不限于，Division of Laboratories andResearch，New York Department of Public Health(纽约公共卫生局实验室和研究部门)，Albany，NY和Department ofPathology，University of North Carolina(北卡罗来纳大学病理学系)，Chapel Hill，NC。所有这些来源，例如，提供了患有犬类血友病A的犬。为测试所讨论的任何给定部分的因子VIII活性，所述部分被注射进患病的动物，做一个小切口并将流血时间与作为对照的未处理的患病动物比较。用于确定因子VIII活性的另一个方法是确定辅因子和促凝血的活性。参见例如Mertens等人(1993)Brit.J.Haematol.85：133-42。还可使用本领域普通技术人员已知的其他方法以确定给定的部分是否具有因子VIII活性。这些方法可用于确定部分本身(因此可作为“因子VIII部分”使用)以及相应的聚合物-部分轭合物的因子VIII活性。

因子VIII部分的非限制性实例包括下列：因子VIII；因子VIIIa；因子VIII:C；因子VIII:vWF；B-结构域缺失的因子VIII(和因子VIII的其他截短的形式)；杂合蛋白质，例如美国专利第6,158,888号中描述的那些；具有因子VIII活性的糖基化蛋白质，例如美国专利申请公布第US2003/0077752号中描述的那些；以及具有因子VIII活性的肽模拟物。优选的截短的因子VIII形式(被术语“B-结构域缺失的因子VIII”所包含)相当于具有人类因子VIII的氨基酸序列(具有相当于Arg⁷⁵⁹和Ser¹⁷⁰⁹之间的区域内的至少581个氨基酸的缺失)的蛋白质，更优选地其中的缺失相当于Pro¹⁰⁰⁰和Asp¹⁵⁸²之间的区域、Thr⁷⁷⁸和Pro¹⁶⁵⁹之间的区域和Thr⁷⁷⁸和Glu¹⁶⁹⁴之间的区域中的一个。

关于血管性血友病因子和因子VIII部分，还可使用保留了至少某种程度的所需的血管性血友病因子或因子VIII活性的前述的任何生物活性片段、缺失变异体、取代变异体或添加变异体。

活性剂可有利地被修饰以包括一个或多个氨基酸残基例如赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以便提供聚合物对氨基酸侧链中的原子的方便连接。用于加入氨基酸残基的技术是本领域普通技术人员所熟知的。参阅J.March，Advanced Organic Chemistry：ReactionsMechanisms and Structure(高等有机化学：反应机制和结构)，第四版(New York：Wiley-Interscience，1992)。

可从血源性来源获得活性剂。例如，可使用本领域普通技术人员已知的沉淀和离心技术从人类血浆分级出因子VIII。参见，例如Wickerhauser(1976)Transfusion 16(4)：345-350和Slichter等人(1976)Transfusion 16(6)：616-626。也可从人类粒细胞分离因子VIII。参见Szmitkoski等人(1977)Haematologia(Budap.)11(1-2)：177-187。

此外，还可从重组的方法获得活性剂。简单地说，重组方法涉及构建编码所需要的多肽或片段的核酸，将核酸克隆至表达载体，转化宿主细胞(例如，细菌、酵母或哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞)并表达核酸以产生所需要的多肽或片段。用于在体外以及原核和真核宿主细胞中产生和表达重组多肽的方法是本领域普通技术人员已知的。参见，例如美国专利第4,868,122号。

上述示例性生物活性剂意指包含，此处可适用的其类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、异构体和药学上可接受的盐形式。提到肽和蛋白质，本发明意在包含合成的、重组的、天然的、糖基化的和非糖基化的形式，以及其生物活性片段。此外，术语“活性剂”意在包含轭合之前的活性剂和轭合后的活性剂“残留”。

本发明还包括药物制品，其含有与药用赋形剂组合的如本文所提供的轭合物。一般地，轭合物本身是固体形式的(例如沉淀)，其可与适合的固体或液体形式的药用赋形剂组合。

示例性赋形剂包括，但不限于，选自由碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合组成的组的那些赋形剂。

碳水化合物例如糖，衍生的糖例如糖醇、糖醛酸、酯化糖和/或糖聚合物可作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖以及类似物；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖以及类似物；多糖，例如棉子糖、木蜜三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉以及类似物；以及糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、吡喃基山梨糖醇、肌醇以及类似物。

赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及其组合。

制品还可包括抗微生物剂以便预防或阻止微生物生长。适用于本发明的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol及其组合。

制品中也可存在抗氧化剂。抗氧化剂被用来预防氧化，由此预防轭合物或制品的其他成分的变质。适用于本发明的抗氧化剂包括，例如，抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁对甲氧酚、丁羟甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸钠、焦亚硫酸钠及其组合。

表面活性剂可作为赋形剂存在。示例性表面活性剂包括：聚山梨醇酯(例如“吐温20”和“吐温80”)和普流罗尼类例如F68和F88(其两者都可从BASF，Mount Olive，New Jersey获得)；脱水山梨醇酯；脂类，例如磷脂诸如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(虽然优选地不为脂质体的形式)，脂肪酸和脂肪酯；类固醇，例如胆固醇；以及螯合剂，例如EDTA、锌以及其他这样适合的阳离子。

在制品中酸或碱可作为赋形剂存在。可使用的酸的非限制性实例包括选自由氢氯酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸以及其组合组成的组的那些酸。适合的碱的实例包括，但不限于，选自由氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾及其组合组成的组的碱。

药物制品包括所有类型的制剂，尤其是适于注射的那些制剂，例如可被重新构成的粉末以及悬浮液和溶液。组合物中轭合物(即本文中描述的活性剂和聚合物间形成的轭合物)的量将根据许多因素而变化，但当组合物贮存在单位剂量容器(例如小瓶)内时，最好是治疗上有效的剂量。此外，可将药物制品装在注射器内。可通过反复地施用逐渐增加的量的轭合物以便确定哪个量产生临床上期望的终点，从而实验性地确定治疗上有效的剂量。

组合物中个别赋形剂的量将根据赋形剂的活性和组合物的具体需要而变化。通常，可通过常规实验，即通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低至高)的组合物，检验稳定性和其他参数，之后确定获得最佳性能而无明显的有害作用的范围，从而确定任何个别的赋形剂的最佳的量。

但通常在组合物中赋形剂以约1％至约99％重量，优选地从约5％-98％重量，更优选地从约15-95％重量的赋形剂的量存在，浓度最优选的低于30％重量。

这些前述的药用赋形剂与其他的赋形剂一起被描述于″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″(雷氏药学理论和实践)，第19版，Williams & Williams，(1995)、″Physician′s DeskReference″(医生的案头参考)，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)以及Kibbe，A.H.，Handbook of PharmaceuticalExcipients(药用赋形剂手册)，第3版，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000中。

本发明的药物制品通常，虽然不必须，是经由注射施用的并因此在即将施用前一般为液体溶液或悬浮液。药物制品还可采用其他形式例如糖浆、乳霜、软膏、片剂、粉末以及类似形式。也包括其他方式的施用，例如经肺、经直肠、经皮、经粘膜、口服、鞘内、皮下、动脉内等等施用方式。

如前文所述，可通过静脉注射或较次优选地通过肌肉内或通过皮下注射来胃肠外施用轭合物。适于胃肠外施用的制剂类型包括即用型注射液，使用前与溶剂混合的干粉、即可注射的悬浮液、使用前与载体混合的无水的不溶性组合物，以及乳液和施用前稀释的液体浓缩物及其它。

本发明还提供了向患有对使用轭合物的治疗有响应的疾病的患者施用本文提供的轭合物的方法。所述方法包括施用(一般经由注射)治疗上有效的量的轭合物(优选地作为药物制品的一部分提供)。施用的方法可被用于治疗任何可通过施用具体的轭合物来治疗或预防的疾病。本领域普通技术人员懂得具体的轭合物可有效地治疗哪种疾病。施用的实际剂量将根据受治疗者的年龄、体重和一般状况以及所治疗的疾病的严重度、保健专业人员的判断以及所施用的轭合物而变化。治疗上有效的量是本领域普通技术人员已知的和/或描述于有关的参考教科书和文献中。一般，治疗上有效的量范围为从约0.001mg至100mg，优选为从0.01mg/天至75mg/天的剂量，更优选为0.10mg/天至50mg/天的剂量。

任何给定的轭合物的单位剂量(再次，优选地作为药物制品的一部分提供)可根据临床医生的判断、患者的需要等等按照不同的给药时间表来施用。具体的给药时间表是本领域普通技术人员已知的或可使用常规方法实验性地确定。示例性的给药时间表包括，但不限于，一天施用五次，一天四次、一天三次、每天两次、每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次以及其任何组合。一旦达到临床终点，停止组合物给药。

应当理解的是尽管结合本发明的优选的具体实施方案来描述了本发明，但前述说明以及随后的实验意在示例性说明而不是限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和改进对本发明所属领域中的普通技术人员来说是明显的。

本文引用的所有文章、图书、专利、专利公布和其他出版物通过引用整体并入于此。

实验

除非以其他方式指出，本发明的实践将使用有机合成以及类似过程的常规技术，所述技术可被本领域普通技术人员理解并已在文献中解释。在以下的实施例中，已努力确保关于所使用的数(例如量、温度等等)的准确性，但是应考虑到某些实验性误差和偏差。除非以其他方式指出，温度为摄氏度而压力为或接近海平面的大气压。除非以其他方式指出，所有试剂都是商业获得的。所有产生的NMR获得自由Bruker(Billerica，MA)制造的300或400MHz NMR光谱仪。所有过程在玻璃或搪玻璃容器中进行并避免与含金属的容器或设备接触。

将使用以下缩写。

FVIII；因子VIII；重组FVIII

rFVIII

HPLC 高压液相色谱

hydr 可水解的

PEG-rVWF PEG化的rVWF

PEGrFVIII PEG化的rFVIII

rVWF 重组血管性血友病因子

rFVIII 重组FVIII

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝

胶电泳

用于PEG化的rVWF产物是来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的纯化的rVWF制品并用常规纯化技术纯化。

聚合物试剂依照描述于美国专利申请公布第2006/0293499号中的基本方法制得并具有下列结构：

“聚合物试剂A”

“聚合物试剂B”

实施例1A

vWF轭合物的制备

(总聚合物重均分子量20,000Da)

(“Lys、20K、支链、长”)

(其中VWF是血管性血友病因子的残基)

将适量的VWF蛋白质溶液解冻(使用±30℃的温水)以产生具有60mg蛋白质含量的蛋白质溶液。将蛋白质溶液注入新灭菌的400mL一次性聚丙烯烧杯中。若需要，将蛋白质溶液的温度调至22℃(±1℃)。若需要，将蛋白质溶液用溶液[20mM HEPES(pH 7.4)、150mMNaCl、0.5％w/v蔗糖]稀释或将蛋白质溶液浓缩以确保0.45mg/mL±0.05mg/mL的浓度。保留0.2mL的样品并于4℃贮存以便以后的浓度确认。将蛋白质溶液烧杯放在顶置式搅拌器(overhead stirrer)下，其中将叶轮降低至蛋白质溶液中约3/4深处(即距底部1/4)并将叶轮设置成以60rpm(±2rpm)搅拌。为了尽可能的防止污染，将烧杯加盖。

将具有约20,000Da总聚合物重均分子量(即每个聚合物“臂”的重均分子量的和)的七十五摩尔过量(相对于278kDa的血管性血友病因子单体质量)的聚合物试剂B称重并放置于50mL聚丙烯Falcon管中并以足以产生5％w/v PEG或50mg/mL PEG溶液的量加入2mM HCl来溶解。任选地，可将PEG溶液离心(使用配备有50mL Falcon管固定器的Beckman台式离心机(bench top centrifuge)，以1000rpm)，其将产生集中在管底部的澄清的溶液。一形成PEG溶液，就将其用注射器泵以1.5mL/min(90mL/h)的速率泵入蛋白质溶液中。将运输PEG溶液的管子放置在烧杯中以便PEG溶液于叶轮的高度处供料入蛋白质溶液中。此后，混合了PEG溶液的蛋白质溶液被称为“PEG化反应混合物”。持续搅拌PEG化反应混合物五小时，与此同时根据需要不时监测温度(22℃±1℃)和pH。

搅拌五小时后(PEG化反应溶液的pH应为7.3±0.1)，加入(以1.5mL/min与将PEG溶液加入PEG化反应溶液相同的方式)14.5mL的0.1M甘氨酸溶液以由此形成含甘氨酸的PEG化反应混合物。含甘氨酸的PEG化反应混合物中甘氨酸的最终浓度应为10mM(±1mM)。将含甘氨酸的PEG化反应混合物以60rpm再搅拌两小时。

搅拌两小时之后，取出0.2mL样品并贮存于4℃以便蛋白质测定。

为纯化含甘氨酸的PEG化反应混合物中的轭合物，将含甘氨酸的PEG化反应混合物用3倍含甘氨酸的PEG化反应体积的溶液A[20mM柠檬酸钠(pH 6.1)、0.5％w/v蔗糖]稀释以将NaCl浓度降至100mM以下并稀释未结合的游离聚合物试剂B。稀释后，将含甘氨酸的PEG化反应溶液用轻柔的旋转(涡旋)混合或用顶置式搅拌器混合。通过

Basic系统(

Basic System)上的阳离子交换色谱纯化轭合物。用GE-Healthcare SP-HP介质填装Millipore Vantage 44mm ID柱。填装好的床高为100-105mm，得到150-160mL的柱体积，由此产生≤0.4mg/mL的柱载荷量。将柱中的流速设置为15mL/min(线性流速1cm/min)。用于纯化的流动相含有溶液A[20mM柠檬酸钠(pH6.1)、0.5％w/v蔗糖]和溶液B[20mM柠檬酸钠(pH 6.1)、0.5％w/v蔗糖、1.0M NaCl]，或两者的混合物，其中使用梯度运行流动相。使用了以下梯度：步骤1：起始流动相含有0％的溶液B；步骤2：对于等于0.7倍柱体积的最初的保留体积，流动相含有0至70％的溶液B；步骤3：对于等于2.5倍柱体积的下一个保留体积，流动相含有70％的溶液B。于280nm监测洗脱液的UV吸光度。未结合的游离聚合物试剂B在步骤1期间洗脱。一旦吸光度开始从基线上升就收集步骤2和3中洗脱的轭合物，并在峰减回至最大峰高的7％时停止收集。将依照这一程序制得的典型的色谱图提供为图1。

实施例1B

vWF轭合物的制备

(总聚合物重均分子量40,000Da)

(“Lys、40K、支链、长”)

除了使用具有总聚合物重均分子量约40,000Da而不是约20,000Da的聚合物试剂B以外，重复实施例1A的基本程序。

实施例1C

vWF轭合物的制备

(总聚合物重均分子量60,000Da)

(“Lys、60K、支链、长”)

除了使用具有总聚合物重均分子量约60,000Da而不是约20,000Da的聚合物试剂B以外，重复实施例1A的基本程序。

实施例2A

FVIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量20,000Da)

(“Lys、20K、支链、长”)

(其中FVIII是因子VIII的残基)

将FVIII蛋白质溶液(3.23mg/mL蛋白质浓度)迅速解冻(于室温使用温水浴5分钟)并用1000μL移液器将约3.1mL温的FVIII蛋白质溶液放入50mL锥形管中。

将具有约20,000Da总聚合物重均分子量(即每个聚合物“臂”的重均分子量的和)的42.8摩尔比(相对于因子VIII)的聚合物试剂B(38mg)放入2mL微量离心管中。将已称重的聚合物试剂B悬浮于500μL的2mM HCl中。通过在二十秒时段内振荡和离心微量离心管使聚合物试剂B溶解。

用移液器将如上形成的聚合物试剂B的溶液在10-20秒内逐滴加至温的FVIII蛋白质溶液中。将所得的混合物保持于室温(约22℃)一小时。在一小时结束时，加入36μL的0.1M甘氨酸溶液由此形成含甘氨酸的PEG化反应混合物。将100μL样品放置于500μL微量离心管中，之后放在-80℃冷冻器中。

为了除去含甘氨酸的PEG化反应混合物中的盐，用20mM组氨酸、10mM CaCl₂、0.1％吐温80、pH 6.5]预平衡5mL的HiTrap DeSalt柱。一经平衡，将全部体积的含甘氨酸的PEG化反应混合物装至所述柱中，并收集和集合各级分。收集含蛋白质的级分，放置于容器中并立即放置于标准冰浴中。

为纯化含甘氨酸的PEG化反应混合物中的轭合物，将含甘氨酸的PEG化反应混合物用溶液A[20mM组氨酸、10mM CaCl₂、0.1％吐温80、pH 6.5]稀释为1∶10。通过

Basic系统上的阳离子交换色谱纯化轭合物。所使用的柱为5mL HiTrap Q HP柱(用0.1M NaOH清洗系统和柱并通过在用Milli-Q水或纯化缓冲液清洗后测试为中性或接近中性的pH来证实完全除去NaOH)。用10mL的溶液A以2.0mL/min清洗柱并将通过的流体收集为5mL的级分。用于纯化的流动相包括溶液A、溶液B[20mM组氨酸、10mM CaCl₂、0.1％吐温80、pH 6.5、1MNaCl]或两者的混合物，其中使用梯度运行流动相。进行2倍柱体积(10mL)的溶液A的柱清洗。使用了以下梯度：起始流动相含有0％的溶液B；使用含有50％溶液B的流动相并保留15mL(将峰收集为约2mL的级分并贮存于冰上)的步骤；使用含有100％溶液B的流动相并保留5mL的步骤；并且最后，使用含有降回0％溶液B的流动相并保留15mL的步骤。将典型的分离谱图提供为图2A。

通过将1x0.2mL等份的纯化的轭合物样品和100μL/mL的因子VIII解冻进行蛋白质测定。制备具有0.2、0.5、0.75和1.5mg/mL的因子VIII的点的标准曲线。对于每次运行(样品、标准品或纯化缓冲液)，将30μL适当物质放在透明的5mL管中并向管中加入1.5mL的Pierce蛋白质测定试剂(Pierce Biotechnology，Inc.，RockfordIL)之后将管的内含物混合。于室温(22℃)孵育十分钟后，使用分光光度计于595nm对每个管的内含物读数。

通过置于Agilent 1100色谱系统(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara CA)上的4.6x50的Mini Q柱(GE HealthcareBio-Sciences Corp，Piscataway NJ)进行经由离子交换色谱的分析，其中缓冲液与用于纯化的缓冲液一样并且所使用的最大流速为0.5mL/分钟。将30微升纯化的轭合物样品(或作为对照的因子VIII)用30μL的2mM HCl稀释并放置200μL于HPLC小瓶中。使用以下梯度：对于时间0，流动相含有0％的溶液B；对于时间0至2分钟，流动相含有0％的溶液B；对于时间2分钟至2.5分钟，流动相含有27％的溶液B；对于时间2.5分钟至8分钟，流动相含有27％的溶液B；对于时间8分钟至8.5分钟，流动相含有70％的溶液B；对于时间8.5分钟至14分钟，流动相含有70％的溶液B。对于每次注入，使用30μL样品或对照。在色谱图的280nm处，峰将对应于下列：在约11分钟时的原始因子VIII和较早的轭合的因子VIII。将依照这一程序制得的典型的色谱图提供为图2B。

通过将3-8％的TRIS-酸酯凝胶(Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)加温至室温的SDS-PAGE分析纯化的轭合物样品，其中2mM HCL中聚合物试剂B的标准曲线为0.001％、0.01％和0.1％的聚合物试剂B浓度(w/v)。通过将10μL HiMark分子量标记(InvitrogenCorporation，Carlsbad CA)放入泳道1中制备标准。将纯化的轭合物样品或对照(因子VIII)(10μL体积)用30μL的2mM HCl分别单独地稀释，其中将30微升的每种HCl稀释样品或对照与10μL的4xLDS样品缓冲液(Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)混合，随后将其中25μL的溶液转移至标明的孔中。立即将凝胶放入电泳设备(gel apparatus)中并以150伏特运行60分钟。运行完成后，将凝胶从电泳设备中取出并在去离子水中清洗。之后用碘化钡染色剂将凝胶染色(通过以下来进行：将15mL的0.1M高氯酸加至凝胶，之后孵育5分钟时间段；之后向凝胶加入5mL 5％的氯化钡之后加入2mL碘，然后孵育5分钟时间段)，之后用去离子水清洗。用去离子水清洗凝胶5分钟后，用Kodak Gel Logic扫描系统(Eastman KodakCompany，New Haven CT)分析凝胶，识别出其中未反应的聚合物试剂B。扫描后，从凝胶倒掉任何剩余的水并向凝胶加入50mL的PierceImperial染色剂(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford IL)。于室温孵育30分钟后，将凝胶用去离子水清洗并允许在200mL去离子水中放置1小时。在这一小时期间，完成若干次换水。1小时后，用Kodak Gel Logic扫描系统(Eastman Kodak Company，New Haven，CT)分析凝胶。

实施例2A1

FVIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量20,000Da)

(“Lys、20K、支链、长-再合成的”)

重复实施例2A的合成程序。在再次进行所述程序时，注意到了在再合成的轭合物和实施例2A的那些轭合物之间观察到聚合物比因子VIII的比率上的一些差异，这些差异可通过不同分析方法的使用来解释。然而，如通过碘化钡染色所研究的，没有游离的聚合物试剂B残留于任何样品溶液中。

实施例2B

FVIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量40,000Da)

(“Lys、40K、支链、长”)

实施例2B1

FVIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量40,000Da)

(“Lys、40K、支链、长-再合成的”)

重复实施例2B的合成程序。在再次进行所述程序时，注意到了在再合成的轭合物和实施例2A的那些轭合物之间观察到聚合物比因子VIII的比率上的一些差异，这些差异可通过不同分析方法的使用来解释。然而，如通过碘化钡染色所研究的，没有游离的聚合物试剂B残留于任何样品溶液中。

实施例2C

FVIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量60,000Da)

(“Lys、60K、支链、长”)

除了使用具有总聚合物重均分子量约60,000Da而不是约20,000Da的聚合物试剂B以外，重复实施例2A的基本程序。

实施例3A

vWF轭合物的制备

(总聚合物重均分子量20,000Da)

(“Lys、20K、支链、短”)

(其中VWF是血管性血友病因子的残基)

将(175mL)的血管性血友病因子(″VWF″)溶液(0.344mg/mL，于20mM HEPES、150mM NaCl、0.5％蔗糖，pH 7.4中)解冻至室温。将具有约20,000Da总聚合物重均分子量(即每个聚合物“臂”的重均分子量的和)的175摩尔比(相对于VWF)的聚合物试剂A(766.3mg)，其刚刚溶解于7.7mL的2mM HCl中，用移液管缓慢加至VWF溶液。将混合物在振荡器上于室温轻轻振荡两小时。通过加入1.8mL溶于水的1M甘氨酸终止反应，将其在振荡器上于室温再轻轻振荡三小时。通过缓慢加入含有0.5wt％蔗糖的175mL pH 6.10的20mM MES缓冲液来稀释溶液。通过轻轻涡旋将溶液充分混合，之后贮存于4℃过夜。之后通过离子交换色谱除去溶液中未结合的聚合物试剂A。参见下文的色谱图。用SDS-PAGE表征所产生的轭合物。经阴离子交换色谱之后的色谱图提供于图3A中。图3B和3C分别显示了还原和非还原条件下经SDS-PAGE分析后的凝胶。

实施例3B

vWF轭合物的制备

(总聚合物重均分子量40,000Da)

(“Lys、40K、支链、短”)

将等份(175mL)的血管性血友病因子(″VWF″)溶液(60.2mg蛋白质含量)解冻至室温。将具有约40,000Da总聚合物重均分子量(即每个聚合物“臂”的重均分子量的和)的135摩尔比(相对于VWF)的聚合物试剂A(1.374g)，其刚刚溶解于13.7mL的2mM HCl中，用移液管缓慢加至VWF溶液。将混合物在振荡器上于室温轻轻振荡三小时。通过加入945μL溶于水的2M甘氨酸终止反应，将其在振荡器上于室温再轻轻振荡三小时。通过缓慢加入含有0.5wt％蔗糖的175mL pH 6.10的20mM MES缓冲液来稀释溶液。通过轻轻涡旋将溶液充分混合，之后贮存于4℃过夜。之后通过离子交换色谱除去溶液中未结合的聚合物试剂A。相应的色谱图参见图4A。

实施例3C

vWF轭合物的制备

(总聚合物重均分子量60,000Da)

(“Lys、60K、支链、短”)

将等份(175mL)的血管性血友病因子(″VWF″)溶液(60.2mg蛋白质含量)解冻至室温。将具有约60,000Da总聚合物重均分子量(即每个聚合物“臂”的重均分子量的和)的150摩尔比(相对于VWF)的聚合物试剂A(2.406g)，其刚刚溶解于13.7mL的2mM HCl中，用移液管缓慢加至VWF溶液。将混合物在振荡器上于室温(22℃)轻轻振荡三小时。通过加入875μL溶于水的2M甘氨酸终止反应，将其在振荡器上于室温再轻轻振荡三小时。通过缓慢加入含有0.5wt％蔗糖的175mL pH 6.10的20mM MBS缓冲液来稀释溶液。通过轻轻涡旋将溶液充分混合，之后贮存于4℃过夜。之后通过离子交换色谱去除溶液中游离的PEG。相应的色谱图参见图4B。

实施例4A

因子VIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量20,000Da)

(“Lys、20K、支链、短”)

(其中FVIII是因子VIII的残基)

将因子VIII蛋白质溶液(3.23mg/mL蛋白质浓度)迅速解冻(于室温使用温水浴5分钟)并将165μL温的FVIII蛋白质溶液放置于1mL微量离心管中。将微量离心管放置于标准冰浴中(由于溶液不应冷冻，因此不是干冰)，由此形成冷却的因子VIII蛋白质溶液。

将具有约20,000Da总聚合物重均分子量(即每个聚合物“臂”的重均分子量的和)的70摩尔比(相对于因子VIII)的聚合物试剂A放置于1mL微量离心管中。将称重的聚合物试剂A悬浮于2mM HCl以形成聚合物试剂A溶液。确保聚合物试剂A溶解后(通过涡旋溶液五秒钟之后离心十秒钟实现)，将全部聚合物试剂A溶液加至冷却的因子VIII蛋白质溶液，将所得的混合物于室温放置在摇动盘(rockerplate)上一小时。在一小时结束时，加入18.8μL的50mM甘氨酸溶液以由此形成含甘氨酸的PEG化反应混合物。将含甘氨酸的PEG化反应混合物于室温在摇动盘上摇动二十分钟。

为了除去含甘氨酸的PEG化反应混合物中的盐，用20mM MOPS、10mM CaCl₂、0.1％吐温80，pH 6.5预平衡mL的HiTrap DeSalt柱。一经平衡，将反应物用Milli-Q水(Millipore Corporation，Billerica，MA)稀释至1mL的终体积。之后将全部体积装至所述柱上并收集和集合各级分。将含蛋白质的级分立即放置于标准冰浴中。下文提供了依照这一程序制得的典型的色谱图。

为纯化脱盐的含甘氨酸的PEG化反应混合物中的轭合物(以除去未轭合的PEG物类)，通过

Basic系统上的阳离子交换色谱纯化轭合物。所使用的柱为5mL HiTrap Q HP柱(用20mM MOPS、10mMCaCl₂、0.1％吐温80、pH 6.5+1M NaCl再生并用20mM MOPS、10mMCaCL₂、0.1％吐温80，pH 6.5预平衡。将脱盐的含甘氨酸的PEG化反应混合物装至所述柱上并以从0-50％mM MOPS、10mM CaCl2、0.1％吐温80，pH 6.5+1M NaCl的步骤梯度进行纯化。将级分收集，集合并贮存于容器中并立即放置于标准冰浴中。参见如图5所提供的色谱图。

通过将3-8％的TRIS-乙酸酯凝胶(Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)加温至室温的SDS-PAGE分析纯化的轭合物，其中2mMHCL中聚合物试剂B的标准曲线为0.001％、0.01％和0.1％的聚合物试剂B浓度(w/v)。通过将10μL HiMark分子量标记(InvitrogenCorporation，Carlsbad CA)放入泳道1中制备标准。将纯化的轭合物样品或对照以30μL的2mM HCl分别单独地稀释，其中将30微升的每种HCl稀释样品或对照与10μL的4xLDS样品缓冲液(InvitrogenCorporation，Carlsbad CA)混合，随后将其中25μL的溶液转移至标明的孔中。立即将凝胶放入电泳设备中并以150伏特运行60分钟。运行完成后，将凝胶从电泳设备中取出并在去离子水中清洗。之后用碘化钡染色剂将凝胶染色(通过以下来进行：将15mL的0.1M高氯酸加至凝胶，之后孵育5分钟时间段；之后向凝胶加入5mL 5％的氯化钡然后加2mL碘，然后孵育5分钟时间段)，之后用去离子水清洗。用去离子水清洗凝胶5分钟后，用Kodak Gel扫描器(EastmanKodak Company，New Haven CT)分析凝胶。参见图6A。

扫描后，从凝胶倒掉任何剩余的水并向凝胶加入50mL的Gel Code蓝(Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。于室温孵育三十分钟后，将凝胶用去离子水清洗并在200mL去离子水中放置1小时。在这一小时期间，完成若干次换水。一小时后，用Kodak Gel扫描器(Eastman Kodak Company，New Haven，CT)分析凝胶，识别出其中未轭合的因子VIII。参见图6B。

实施例4B

因子VIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量40,000Da)

(“Lys、40K、支链、短”)

除了使用具有总聚合物重均分子量约40,000Da而不是约20,000Da的聚合物试剂A以外，重复实施例4A的基本程序。

实施例4B1

因子VIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量40,000Da)

(“Lys、40K、支链、短-再合成的”)

重复实施例4A的基本程序，除了：(a)使用具有总聚合物重均分子量约40,000Da而不是约20,000Da的聚合物试剂A，以及(b)在轭合步骤使用了相对于因子VIII 150摩尔过量的聚合物试剂A，其中5mg聚合物试剂A被放置于透明的1mL微量离心管中，并溶解于50μL的2mM HCl中。涡旋所述溶液5秒钟，之后离心10秒钟以彻底溶解PEG。将全部50μL的PEG溶液加至冷却的FVIII中并于室温放置于摇动盘上1小时。用21.5μL的50mM甘氨酸终止反应。于室温继续摇动20分钟。

实施例4C

因子VIII轭合物的制备

(总聚合物重均分子量60,000Da)

(“Lys、60K、支链、短”)

除了使用具有总聚合物重均分子量约60,000Da而不是约20,000Da的聚合物试剂A以外，重复实施例4A的基本程序。

实施例5

PEG化的rVWF的体外和体内实验

如本实施例5中所描述的在还原条件下进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，之后银染色(图7、图片A)和考马斯染色(图7、图片B)。在还原条件下，成熟的rVWF显示为具有～260kDa的MW的主要的单一条带(单体)和低至150kDa的一些次要条带。当将凝胶与多克隆抗人VWF抗体进行免疫印迹时，如图7、图片C中所表明的，由于使用了不同的MW标准品，rVWF单体显示出明显高于280kD的MW。原始rVWF 133P1在抗VWF免疫印迹中显示为单一的VWF单体和一些次要的无关的降解条带。通过使用高分辨率凝胶的非还原琼脂糖凝胶电泳研究多聚体组合物以表明多聚体结构的完整性并证实不存在随体带或其他降解条带(图7、图片D)。原始rVWF 133P1的分析数据提供于表1。

表1：原始rVWF 133P1的分析数据

可释放的rVWF轭合物：依照实施例1A、1B、1C、3A、3B和3C制备了具有经由rVWF的赖氨酸残基的氨基基团的可释放的键的PEG-rVWF轭合物。PEG-rVWF轭合物具有约20K、40K或60K的总PEG分子量。表2概述了轭合物的PEG化程度。

表2：可释放的PEG-rVWF制品的PEG化程度

使用Bradford测定用未修饰的rVWF 133P1作为标准品确定PEG化的rVWF的蛋白质含量。剩余的游离PEG通过非还原SDS-PAGE的碘化钡染色确定。

*通过分析考马斯染色的还原SDS-PAGE及随后凝胶扫描分析计数每分子PEG的数目。

**用链霉蛋白酶/硫氰酸铁铵法确定每分子PEG的数目。

随着所应用的不同方法显示出确定的PEG比VWF单体的比率上的某些不同。不需要PEG提取步骤的HPLC方法得到了比SDS-PAGE方法所得到的平均更高的PEG/单体的数目。因此，在除(Lys、40K、支链、长、低)轭合物外的所有的制品中均超过了1-2个PEG/VWF单体的低PEG化程度的初始目标(“单PEG化”)。如通过碘化钡染色所研究的，在样品溶液中没有剩余的游离PEG。

使用来自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA，USA)的蛋白质测定染料试剂浓缩物(Protein Assay Dye Reagent Concentrate)依照Bradford描述的原理测量样品中的蛋白质含量。Bradford(1976)Anal.Biochem.72：248-254。依照制造商的说明书进行微量测定程序并使用经认证的人血清制品(Qualitrol HS-N，DiaSys Diagnostics，Holzheim，Germany；由VWR，Darmstadt，Germany经销)校准，获得20至1.8μg蛋白质/ml的校准范围。用0.9％NaCl溶液制备浓缩样品的预稀释液以及样品稀释液。

VWF:Ag的确定：实验过程中使用了两种不同的VWF:Ag测定：SIMIT和夹心ELISA。

用于轭合物体外表征的单孵多层免疫技术(SIMIT)是所使用的一种分析技术。使用单孵多层免疫技术SIMIT，用商业上可获得的多克隆兔抗人VWF：抗体(A-082)和过氧化物酶标记的多克隆兔抗人VWF抗体(P-0226；均获自Dakopatts，Glostrup，Denmark)的抗体混合物建立双夹心VWF:Ag ELISA。用稀释于涂层缓冲液(coat buffer)(100mM碳酸钠、100mM碳酸氢钠，用HCl调至pH 9.5)的1μg抗人VWF:抗体涂抹微量滴定板(NUNC Maxisorb F96；从VWR获得)的孔。用作清洗缓冲液的含有吐温-20的磷酸盐缓冲的盐水(PBST)主要由137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM磷酸二氢钾、7mM二水合磷酸氢二钠和0.5ml吐温-20(Bio-Rad，EIA级)组成。为稀释样品和抗体轭合物，向清洗缓冲液中加入0.1％无脂奶粉和2mM苄脒。所有孵育于室温进行。通过将N-四甲联苯胺(TMB)用作底物来检测过氧化物酶活性。用ELISA读数器于450nm测量已显影的颜色强度。以现行WHO标准品为标准校准的正常的参照血浆用于校准曲线的构建。在每个单独的板上一式两份地制备和分析由六个几何1+1稀释液1/100-1/3200组成的稀释系列，获得浓度范围为0.01-0.0006IU/ml的VWF:Ag。以至少1+1稀释样品并一式两份地分析五个进一步的1+1的稀释液。也一式两份地运行测定空白。对于数据评估，计算测量的两个空白校正的光密度(OD)的对数和已知的六个校准品的VWF:Ag浓度之间的线性的回归曲线。只有在样品OD在校准曲线界定的范围内时才在这一曲线上推断样品OD并以IU/ml报告结果。

还使用了用于体外释放实验并用于分析来自药代动力学研究的离体血浆样品的夹心ELISA。用夹心ELISA确定VWF:Ag。用在50mM碳酸氢钠缓冲液pH 9.6中的多克隆抗VWF抗体(A-082，Dako，Glostrup，Denmark)以1μg/孔涂抹微量培养板(Nunc免疫96微孔板，Maxisorp，Nunc，Roskilde，Denmark)的孔过夜。之后用清洗缓冲液(20mM Tris、140mM NaCl、0.1％吐温-20，pH 7.4)清洗板，并将从0.02至0.001IU/ml VWF:Ag范围内的稀释的样品[于清洗缓冲液+0.3％牛血清白蛋白(BSA)中]于25-32℃在孔中孵育2小时，之后清洗并与轭合了辣根过氧化物酶(P-0226，Dako，Glostrup，Denmark)的多克隆抗人VWF一起在清洗缓冲液+0.3％BSA中孵育。清洗步骤后，加入溶于磷酸盐-柠檬酸缓冲液的0.4mg/ml的邻苯二胺(P1063，Sigma，St.Louis，MO，USA)。用3M的硫酸终止颜色显影。在微量培养板读数器中于492nm读取孔的吸光度。吸光度是与样品中的VWF含量成正比的。相对于人血浆参照制品(SSC/ISTH第二凝血标准品，#2)计算样品中VWF:Ag浓度。

确定VWF:RCo活性：依照制造商的使用说明书通过使用含有稳定的血小板和利托菌素A的冻干的血管性血友病试剂(Dade Behring)用BCS(Behring Coagulation System)分析仪(Dade Behring，Marburg，Germany)测量VWF:RCo活性。在利托菌素存在的情况下来自样品的VWF(利托菌素辅因子)导致稳定的血小板的凝集。所产生的凝集降低了反应悬浮液的浊度。通过BCS分析仪于570nm测量的吸光度变化与样品的利托菌素辅因子活性是成比例的。通过用标准人血浆(DadeBehring)产生的参照曲线定量样品的利托菌素辅因子活性并报告为IU VWF:RCo/ml。

确定胶原结合活性：依照制造商的使用说明书用商业上可得的ELISA(Technozym VWF:CBA，Technoclone，Vienna，Austria)确定VWF:CB活性。将用固定的人III型胶原预涂的ELISA试验条和样品溶液一起孵育。通过加入过氧化物酶轭合的多克隆抗VWF抗体检测胶原结合的VWF。通过用与试验试剂盒一起提供的正常人血浆产生的参照曲线定量样品的VWF:CB活性并以U/ml VWF:CB表示。

通过ELISA生色测定(ECA)确定VWF-FVIII-结合能力：通过以Bendetowicz等人描述的测定为基础的ECA确定VWF-FVIII的相互作用。参见Bendetowicz等人.(1998)Blood 92(2)：529-538。将商业上可得的多克隆兔抗人VWF抗体A082(Dako，Glostrup，Denmark)固定于微量滴定孔。含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲的盐水(PBS；6.5mM二水合磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、140mM NaCl，pH 7.2)被用作清洗缓冲液。为了样品稀释并作为封闭液，将0.1％无脂奶粉(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)加至PBS-吐温缓冲液。在不同的管中将恒量的rFVIII[0.2IU/ml FVIII生色活性(FVIII:C)]与稀释的含VWF的样品(VWF:Ag浓度范围从0.156至10mIU/ml)混合并于37℃孵育25分钟。rFVIII源是来自ADVATE牌的因子VIII(BaxterHealthcare)的冷冻原料药(frozen bulk)。rFVIII原料药具有4046IU/ml的生色FVIII活性，并含有少于(then)5μg(-0.5单位)VWF:Ag/1000IU的rFVIII。rFVIII产物在低于-60℃下以等份冷冻贮存并在测定前即时解冻。

将这一VWF-FVIII复合物转移至封闭的微量滴定板并于室温孵育60分钟。通过随后的使用清洗缓冲液的清洗步骤除去未结合的FVIII。通过商业上可获得的FVIII生色测定(Technochrom FVIII:C试剂盒，Technoclone，Vienna，Austria)定量结合的FVIII，其中试剂含有微量的凝血酶、FIXa、磷脂和FX。这一测定的原理为FVIII被凝血酶活化并因此从VWF释放并随后与磷脂、FIXa和钙离子形成复合物。这一复合物将FX活化为FXa，其反过来裂解生色底物，产生37℃下用动力学模式于405nm在ELISA读数器(Benchmark，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中测量的显色反应。将所有样品一式两份连续稀释并分析。将得到的空白校正的光密度(以mOD/min)对对数标度的VWF:Ag浓度绘图。假定1IU的VWF:Ag具有1U的VWF:FVIIIB活性，从自正常参照血浆构建的拟合的参照曲线计算样品的FVIII结合活性。

对于所应用的从0.156至10mIU/ml的VWF:Ag的浓度范围，结合至正常血浆的VWF的内源性FVIII对测量没有影响。当从参照曲线读数时样品的VWF:FVIIIB活性表示为U/ml并且将FVIII结合能力计算为样品中测量的VWF:Ag的百分比。

通过表面等离子体共振技术测量VWF-FVIII亲和性：依照制造商的使用说明书将未修饰的和PEG化的VWF固定在Biacore 3000(Biacore AG，Uppsala，Sweden)设备的CM5传感器芯片的流通池上至恒定水平。然后使用“kinject”模式将FVIII样品的一系列稀释液施加于芯片，并使FVIII结合3分钟以及FVIII解离10分钟。这些循环的每一次之后，从芯片除去FVIII(“再生”)并用新的FVIII样品重复实验。

在原始rVWF存在的情况下流动条件下确定PEG-rVWF的FVIII结合能力：将恒量的rVWF固定在Biacore 3000(Biacore AG，Uppsala，Sweden)的CM5传感器芯片的流通池上。将不同量的rVWF与5IU/mlrFVIII于37℃孵育5分钟以形成复合物并且之后将其注入具有固定的rVWF的流通池中。从参照曲线(通过在不存在rVWF的情况下注入0.1至5IU/ml范围的rFVIII而确立)计算结合于固定的rVWF的游离FVIII的量。计算复合物中残留的rFVIII并表示为在不存在rVWF的情况下结合的加入的rFVIII的百分比。

测量对VWF裂解蛋白酶(ADAMTS13)的敏感性：通过将轭合物和逐渐增加浓度的预活化ADAMTS13在展开VWF的变性条件下孵育来研究rVWF对ADAMTS13的敏感性。在孵育前以及孵育后4小时通过取决于VWF的多聚体大小的胶原结合(VWF:CB)活性测量VWF的降解。通过多聚体分析可见多聚体成员(number)的降解和特定随体带的形成。

将常规的人血浆(George King Bio-Medical，Overland Parks，KS，USA)作为ADAMTS13源用于rVWF的降解。在5mM Tris、1.5M尿素，pH 8.0存在的情况下于37℃将血浆稀释液中的ADAMTS13用BaCl₂活化30分钟并与恒量的rVWF(用5mM Tris、1.5M尿素，pH 8.0预稀释)混合并进一步于37℃再孵育4小时。孵育混合物含有6μg/ml的原始或PEG化的rVWF轭合物和1至33mU/ml的ADAMTS13。通过加入Na₂SO₄终止反应并随后将孵育混合物于2500g离心5分钟并将上清液用于进一步的分析。

确定胶原结合活性(VWF:CB)。用100μl(溶于6.5mM二水合磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、140mM NaCl、pH7.2(PBS))的1.5μg/ml的人III型胶原(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，USA)预涂高结合的96孔ELISA板(Costar 3590，CorningIncorporated，NY，USA)于4℃过夜并随后用200μl的″溶于PBS的Super Block Blocking Buffer″(Pierce，Rockford，Illinois，USA)于室温封闭30分钟。用含有0.05％吐温-20和10％封闭液的PBS将离心的消化混合物稀释为1/5并将100μl的这种稀释液加至封闭的孔。于室温孵育2小时后，用100μl pH 7.2的含有0.05％吐温-20和10％封闭液的PBS缓冲液中稀释为1/10000的多克隆的辣根过氧化物酶轭合的抗人VWF抗体(P-0226，Dako，Glostrup，Denmark)溶液再孵育板一小时。每一步骤之间，用含有0.05％吐温-20的250μ1PBS清洗微量滴定孔三次。通过加入100μl“免疫纯TMB底物”(Pierce，Rockford，Illinois，USA)实现显色反应，孵育5分钟后，通过加入100μl的1N的H₂SO₄终止反应。用ELISA读数器680(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)于450nm读取吸光度。作为阴性对照，在同样的程序中使用生理盐水代替正常血浆。如下文在“VWF多聚体分析”下所描述的，样品和0.017U/ml的ADAMTS13一起经受低-和高-分辨率多聚体分析。

SDS-PAGE和银染色：如制造商(Bio-Rad)描述的，将VWF样品(20mIU，相当于0.2μg蛋白质每泳道)应用于梯度(3-8％)Tris-乙酸酯凝胶并进行还原条件下的电泳，随后银染色。用精确分子量蛋白质全蓝(Precision Plus Protein All Blue)标准品(250-10kDa，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)作为分子量标准。

SDS-PAGE和考马斯染色：如制造商(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)描述的，将VWF样品(100mIU，相当于1μg蛋白质每泳道)应用于梯度(3-8％)Tris-乙酸酯凝胶并进行还原条件下的电泳，随后考马斯染色。用精确分子量蛋白质全蓝标准品(250-10kDa/Bio-Rad，Hercules，CA，USA)作为分子量标准。

VWF的SDS-PAGE和免疫印迹：将VWF样品(0.55mIU，相当于5.5ng蛋白质每泳道)应用于梯度(3-8％)Tris-乙酸酯凝胶并进行还原条件下的电泳，随后在聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)(PVDF)膜上进行标准印迹程序。为使VWF条带可见，将多克隆兔抗人VWF抗体(A-082，Dako，Glostrup，Denmark)用作第一抗体。将碱性磷酸酯酶(ALP)标记的山羊抗兔IgG用作第二抗体(BethylLaboratories Inc.，Montgomery，TX，USA)。用ALP轭合物底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)将印迹显色。使用全范围彩色标记(full range rainbow marker)(250-10kDa，GE-Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)作为分子量标准。

PEG的SDS-PAGE和免疫印迹：将VWF样品(5.5mIU，相当于55ng蛋白质每泳道)应用于梯度(3-8％)Tris-乙酸酯凝胶并进行还原条件下的电泳，随后在PVDF膜上进行标准印迹程序。为使PEG可见，将多克隆兔抗人PEG抗体用作第一抗体。通过用PEG化的蛋白质免疫在兔中培育抗PEG抗体。通过蛋白质G琼脂糖凝胶4B(GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)上的亲和色谱纯化兔血清的IgG级分，随后进行特定的阴性免疫吸附(immunabsorption)。将ALP标记的山羊抗兔IgG(Bethyl Laboratories Inc.，Montgomery，TX，USA)用作第二抗体。用ALP轭合物底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)将印迹显色。使用全范围彩色标记(250-10kDa，GE-Healthcare，LittleChalfont，Buckinghamshire，UK)作为分子量标准。

VWF多聚体分析：通过使用高分辨率(2.5-2.7％的琼脂糖)条件的高密度水平SDS琼脂糖凝胶电泳分析rVWF制品的大小分布。将样品稀释至0.3-1.0IU/ml VWF:Ag范围内的相同浓度并用Tris-EDTA-SDS缓冲液孵育。在非还原条件下在琼脂糖凝胶上分离多聚体。

在电印迹至PVDF膜后，通过用多克隆兔抗人VWF抗体(A-082，Dako，Glostrup，Denmark)或用多克隆兔抗PEG抗体免疫染色，在凝胶中使VWF多聚体和VWF多聚体上的PEG分布可见，随后使用ALP轭合物底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)的ALP轭合的山羊抗兔IgG H+L(Jackson Immuno Research，Soham，Cambridgeshire，UK)。

使用FVIII敲除小鼠[Lawler等人(1995)Nat.Genet.10(1)：119-121]作为血友病模型。模仿人血友病A，所述小鼠患有严重的血友病A(FVIII＜0.01IU/ml)但具有正常的VWF水平(相对于人VWF参照，约0.15IU/ml)。

VWF和FVIII的应用：在本实施例的所有试验中使用来自Baxter的重组FVIII(214IU FVIII/ml)并和rVWF共注射。将冷冻干燥的最终容器于2-8℃贮存并在使用前复原。将溶解的rFVIII和非PEG化的或PEG化的rVWF与20mM Hepes、150mM NaCl、3.2％甘露醇、0.8％海藻糖、2.5mM CaCl₂、1％人白蛋白，pH7.4缓冲液混合以获得适合于输注的浓度。将混合物等分，于-20℃冷冻并在使用前即时解冻。目标剂量为200IU/ml的FVIII:C和1.6至2.1mg/kg VWF。从解冻的样品再次测量浓度并计算所应用的剂量。在图例说明中给定剂量。经由尾部静脉注射10ml/kg体重，并在5分钟、3小时、6、9、16和24小时后，如果需要，32和42小时后通过心脏穿刺对5-6只一组的小鼠放血。将9体积血与1体积3.8％柠檬酸钠混合，并立即于3000g离心10分钟。再次于3000g离心上清液5分钟，分离血浆，以等份冷冻并贮存于-60℃以下用于分析。

确定小鼠血浆中FVIII活性：用依照关于通过ELISA生色测定来确定VWF-FVIII结合能力的上文所展示的测定原理的生色法确定FVIII活性。使用动力学模式用微量培养板读数器于405nm测量从底物释放的对硝基苯胺(pNA)的时间过程。反应的斜率与样品中FVIII浓度成比例。相对于人血浆参照制品计算样品中FVIII的浓度，以WHO血浆参照(人血浆中FVIII和VWF的5^thIS，NIBSC#02/150)为标准校准，并以IU/ml表示。

确定小鼠血浆中VWF抗原：用关于用于体外释放实验和用于分析来自药代动力学研究的离体血浆样品的夹心ELISA的上文所描述的夹心ELISA确定VWF:Ag。相对于人血浆参照制品(SSC/ISTH第二凝血标准品，#2)计算样品的VWF:Ag浓度。减去小鼠VWF的基线水平。小鼠血浆中分析的定量限为0.03IU/ml的VWF:Ag。

计算人VWF和FVIII的循环半衰期参数：当研究FVIII缺陷型小鼠时，为分析FVIII水平，t₀＝0小时的浓度设置为零。为分析VWF:Ag水平，t₀＝0的浓度设置为零并且从随后的时间点的平均浓度减去未处理小鼠的算术平均浓度。用药代动力学参数零至24小时的AUC、末端消除速率和平均滞留时间概述FVIII随时间的水平。用药代动力学参数零至24小时的AUC概述VWF:Ag随时间的水平。

从0至24小时的浓度vs.时间的曲线下面积(AUC)：通过线性梯形法则使用在不同的时间点观察到的浓度的算术平均值计算从0至24小时的浓度vs.时间的曲线下面积(AUC)。假定在剂量和AUC之间存在线性关系。在这一假设下，在施用不同剂量的实例中，不同项目的AUC根据剂量而被调整。通过用计算出的AUC除以每kg体重所施用的剂量进行剂量调整。

末端消除速率：使用由偏差校正修改过的最后三个时间点的单独浓度的自然对数的算术平均数估计末端消除速率(λ)。参见Wolfsegger等人.(2005)J.Pharmacokinetic.Pharmacodyn.32(5-6)：757-766。

平均滞留时间：用AUMC_0-无穷除以AUC_0-无穷计算平均滞留时间(MRT)。通过使用所观察到的不同时间点的浓度的算术平均数加上三点尾翼面积校正由线性梯形法则来计算AUMC_0-无穷和AUC_0-无穷。通过与在每项目最后三个时间点所观察到的算术平均数的对数-线性拟合计算尾翼面积校正。

结果

PEG-rVWF的功能参数：通过不同参数表征VWF的不同生物学功能。测量VWF:CB、VWF:RCo和VWF:FVIIIB以表征胶原和血小板结合位点的完整性，它们是VWF介导的血小板粘附所需的，而血小板粘附是止血的首要步骤之一。VWF:FVIIIB能力和亲和性描述了VWF的伴侣功能所需的FVIII结合位点的可用性。表3概述了测量值，而计算的比率和比活性概述于表4。

为研究与可释放的PEG试剂的轭合的可能的作用，还制造了模拟制品(对照)，其运行通过整个过程但不PEG化。这一制品具有与对照相似的活性，其确认过程不会对rVWF产生负面影响。

由于所有的参数受到相似的影响，表示为VWF:Ag水平的百分比的VWF:FVIIIB能力仅少量下降。

使用60K试剂的PRG化对比活性具有实质减小的影响，甚至在低程度的PEG化时。增加PEG化程度(Lys、20K、支链、中轭合物和Lys、20K、支链、高轭合物)导致所有活性，尤其是VWF:CB和VWF:FVIIIB上的实质下降，其中对于Lys、20K、支链、高轭合物来说，仅能检测到很少百分比的初始活性。

以可释放的PEG试剂的PEG化导致比活性的实质减小，甚至是在低程度的PEG化时。试剂的MW越高，所观察到的活性的下降越大。在同样MW的“短”和“长”衍生物之间没有发现实质的差别。

假定固定的rVWF和FVIII之间均一的1∶1相互作用，确定FVIII亲和性，使用Biacore 3000设备的“Bioevaluation(生物评估)”程序的Langmuir模型确定结合和解离常数。不依赖于所使用的PEG试剂的类型或MW，PEG化的rVWF-FVIII相互作用的亲和常数(KD)保持在与用非PEG化的VWF所测量的相同的数量级。

表3：rVWF轭合物的定量参数

所有结果获得自新鲜解冻的样品并且是至少两次测量的平均值。

表4：rVWF轭合物的比活性

如表4中所示，值从所测量的数据算得。

可释放的rVWF轭合物：与稳定的轭合物的SDS-PAGE结果相似，成熟的rVWF显示出具有-260kDa的MW的主要的单一条带(单体)，伴随着低至150kDa的一些次要条带。剩余量的非PEG化的rVWF单体依旧存在于PEG-rVWF制品尤其是40K衍生物中。

PEG化导致条带移动至较高MW，所述MW与所用的PEG试剂的MW相关。没有显示对照制品的结构变化。

如图9、图片A中所说明的，为证实蛋白质染色的SDS-PAGE的结果，用多克隆抗人VWF抗体对凝胶进行免疫印迹。在具有某些次要的无关联的降解条带的抗VWF免疫印迹中未修饰的原始rVWF 133P1显示为单一的VWF单体。在模拟制品(对照)中未检测到结构变化。

所有可释放的轭合物显示出非PEG化的条带和在更高MW范围内的一些清楚的条带。所增加的条带的数目可代表单-、二-、三-和更高PEG化的单体。这些条带的MW与所用的PEG试剂的MW相关。

图9的图片B显示当用多克隆抗PEG抗体染色印迹时PEG的免疫印迹并证实了较高MW的条带含有PEG。未观察到非PEG化的材料rVWF133P1和rVWF对照的反应。较低MW的条带出现于所有样品中，很可能代表样品中在样品制备期间释放的某些游离的PEG。

通过VWF多聚体分析显示PEG化的rVWF的结构完整性：通过使用低分辨率(1％)凝胶的非还原琼脂糖凝胶电泳研究多聚体组成和PEG化对这一参数的影响以确定多聚体的数目并通过使用高分辨率(2.5％)凝胶的非还原琼脂糖凝胶电泳以研究多聚体的精细结构。

与稳定的轭合物相似，PEG大小的增加导致了在低分辨率琼脂糖凝胶电泳中高MW多聚体范围内的分辨率的损失(图10的图片A中的模糊区域)，其使得多聚体的准确数目难以确定。PEG的免疫印迹(图10、图片B)表明了显然所有的多聚体都是PEG化的，其意味着每一个多聚体含有至少一个PEG化的VWF单体。

高分辨率的琼脂糖凝胶(图11)显示了伴随着Lys、20K、支链、短、低轭合物的较小的MW增加和Lys、20K、支链、长、低轭合物的中等增加，VWF多聚体向较高分子量的增宽并且清楚的移动(图片A)。这些数据与表3中所描述的PEG化程度相关。40K以及尤其是60K轭合物的多聚体分析产生了模糊区域而不是清楚的条带。

图11的图片B证实了显然所有多聚体都是PEG化的，其意味着每一个多聚体含有至少一个PEG化的VWF单体。对60K轭合物，抗PEG抗体染色某些较低MW的条带，其可能代表很可能在电泳条件下释放的某些游离的PEG。

在流动条件下在未修饰的rVWF存在时确定PEG化的rVWF的FVIII 结合能力：有待于用与PEG化的rVWF非共价复合的rFVIII治疗的血友病A患者具有正常的内源性VWF水平，因此产生了这一VWF是否可与PEG化的rVWF竞争所注射的rFVIII的问题。为解决这一问题，如上文中关于在流动条件下在原始的rVWF存在时确定PEG-rVWF的FVIII结合能力所描述的，在Biacore系统中测量PEG化的rVWF与原始rVWF复合FVIII的竞争。将恒量的未修饰的rVWF固定于Biacore设备的传感器芯片上并注射含有5IU/ml rFVIII的原始或PEG化的rVWF-FVIII复合物以及逐渐增加量的VWF:Ag。将与所注射的VWF复合的rFVIII表示为所加的FVIII的百分比。

图12显示了留在与可释放的PEG化的rVWF轭合物的复合物中的rFVIII作为μg rVWF/IU FVIII的函数的百分比。星形符号(*)线显示原始rVWF，需要最低的VWF比FVIII的比率(约1μg/IU)以将所有的FVIII保持在复合物中。十字(+)线代表含有约50％前VWF和成熟VWF的自身rVWF制品(r原VWF 198)。这一制品可结合较少的FVIII因为前肽遮蔽了VWF的FVIII结合位点。Bendetowicz等人.(1998)Blood 92(2)：529-538。

以ELISA为基础的VWF:FVIII结合测定(ECA)显示在可释放的轭合物的结合能力之间没有实质的差别(表5)。所有的都显示与原始rVWF相比减小了的能力。所有轭合物显示高于1μg VWF/U FVIII比率的100％的FVIII结合。这样的结果与动物模型相关良好。

对ADAMTS 13的敏感性：在生理条件下，VWF裂解蛋白酶(ADAMTS13)降解VWF的过大多聚体，其因此在防止能由这些VWF的过大多聚体引起的血小板凝集中起作用。由于所表达的rVWF从未接触ADAMTS13，其对ADAMTS 13的敏感性是rVWF产物的结构完整性的重要量值。ADAMTS 13诱导的生理降解可在体外通过变性条件下孵育rVWF和ADAMTS 13来模拟。

图13显示了作为ADAMTS 13浓度的函数的轭合物的VWF:CB活性的相对变化(在ADAMTS 13不存在时所测量的VWF:CB活性的％)。Lys、60K、支链的轭合物具有非常低的VWF:CB活性(表4)。因此，其不能被测试。与逐渐增加量的ADAMTS 13孵育后，所有轭合物显示出相似的逐渐的丧失VWF:CB活性。PEG化的轭合物显示出比它们母本的原始rVWF稍微高的对ADAMTS 13的敏感性。多聚体分析表明较高分子量多聚体的消失(图14)。所有制品对ADAMTS 13显示出相似的敏感性。

可释放的PEG-rVWF的体外释放：为研究PEG部分从rVWF体外释放的动力学，将PEG化的rVWF样品用Hepes缓冲液(20mM Hepes、150mM NaCl、0.5％蔗糖，用100mM Tris调至pH-7.5)稀释至约100μg/ml。作为对照，以同样的方式处理原始rVWF。将所有样品于室温保持8天。每天在同一时间采集子样品，等分，冷冻并于-80℃贮存直到分析。

表5显示了计算出的VWF:Ag/蛋白质比率(IU/mg)。在整个时间段内原始的rVWF 133P1是稳定的。由于在不同PEG-rVWF轭合物之间VWF:Ag比蛋白质的比率的变化，VWF:Ag值在起点(0小时)处不同。然而，尽管程度不同，在孵育期间所有六种衍生物都显示出VWF:Ag水平上的增加。除Lys、60K、支链、短、低轭合物以外，VWF:Ag比蛋白质的比率达到了原始rVWF的范围。

表5：体外孵育期间可释放的PEG-rVWF的 VWF:Ag比蛋白质的比率变化

表6：体外孵育期间可释放的PEG-rVWF的 VWF:FVIIIB比活性的变化

*由于非平行的稀释曲线，未能测量缓冲液中释放反应后60K的长的轭合物的VWF:FVIIIB。

表6显示了计算为U/mg蛋白质的比VWF:FVIIIB能力的变化。在孵育期间在所评估的所有批次都观察到VWF:FVIIIB的完全复原。

为评估rVWF的可能的降解和PEG化级别的变化，样品在还原条件下经受SDS-PAGE，之后用多克隆抗VWF抗体和多克隆抗PEG抗体进行免疫印迹(图15)。如图15中所示，所有PEG-rVWF衍生物在具有适度增加的pH(7.5-7.7)的缓冲液中体外释放后显示出PEG的逐渐释放。相应于“短”和“长”的轭合物的释放行为，在较长的孵育时间段后可观察到PEG化程度上的某些差异。相比之下，可能由于在用孵育缓冲液稀释后最初的样品中已经显示了游离PEG的存在，在孵育期间游离PEG没有实质增加。由于免疫印迹只显示高于75kDa的MW范围，因此对于20K轭合物没有见到游离的PEG。

在血友病的小鼠模型中PEG化的rVWF和共注射的rFVIII的药代动力学：用rVWF/rFVIII或PEG化的rVWF/rFVIII的混合物以1.6-2.1mg rVWF比200IU rFVIII/kg的目标比例(基于Bradford蛋白质测定)输注FVIII缺陷型敲除小鼠。在实验中，对每个轭合物使用每时间组6只小鼠。

图16-21显示了物质注射后VWF:Ag的血浆水平(图片A)和FVIII活性(图片B)的变化。在适当的图例说明中显示所注射的材料的确切的量。

一般来说，所有的PEG化的rVWF都显示出相比原始对照改善的药代动力学(图片A)。注射后60K的PEG轭合物产生了可检测的VWF:Ag的增加，其可能是PEG链的释放的作用，因此使遮蔽的表位对检测抗体来说容易达到。与PEG-rVWF一起注射的rFVIII被消除至比与原始rVWF共注射的rFVIII更低的程度(图片B)。用统计学方法计算药代动力学参数的改进的程度(参见表7和8)。

对于体内实验，将对照混合物(原始rVWF和rFVIII)在一个实验设置中与一种或两种候选物混合物(PEG-rVWF和rFVIII)比较并构建消除曲线(图16-21)。为得到可释放的PEG-rVWF候选物的比较性分析，将消除曲线标准化。施用后5分钟所获得的血浆水平被设为100％而相对其计算所有随后的水平。显示在研究(每时间组n＝48只小鼠)期间进行的所有对照组的平均值以便在图22中与所有候选物一起比较。

比较性分析证实在FVIII缺陷型小鼠中所有PEG化的rVWF与原始rVWF相比循环的更久。与PEG-rVWF一起注射的rFVIII具有比对照混合物(rFVIII和原始rVWF)更优良的消除特性。

相对于所施用的VWF:Ag单位以及相对于所用的蛋白质的量计算VWF:Ag的曲线下面积。于表7中给出PEG-rVWF候选物相比对照的相对增加倍数。

表7：VWF:Ag的剂量调整的AUC的增加

rVWF样品	蛋白质剂量调整的VWF:Ag AUC相对于对照的增加	VWF抗原剂量调整的VWF:Ag AUC相对于对照的增加
rVWF样品	蛋白质剂量调整的VWF:Ag AUC相对于对照的增加	VWF抗原剂量调整的VWF:Ag AUC相对于对照的增加	Lys 20K支链短低	3.2	4.3
Lys 20K支链长低	2.2	3.8	Lys 20K支链短低	3.2	4.3
Lys 20K支链长低	2.2	3.8	Lys 40K支链短低	1.9	3.9
Lys 40K支链长低	2.5	2.9	Lys 40K支链短低	1.9	3.9
Lys 40K支链长低	2.5	2.9	Lys 60K支链短低	1.6	5.1
Lys 60K支链长低	1.5	3.4	Lys 60K支链短低	1.6	5.1

当剂量调整至所注射的VWF抗原单位时，对于所有的候选物，PEG-rVWF抗原的曲线下面积增加到从2.9至5.1的范围。对于所有的候选物来说所述增加都是统计学上显著的。当相对于蛋白质剂量计算时，AUC增加1.5至3.2倍，未计算统计显著性。

图23显示了剂量调整的AUC值连同95％的置信区间。

表8概述了对与PEG-rVWF候选物共注射的rFVIII计算的半衰期参数。

表8：共注射的rFVIII的药代动力学参数的增加

s：显著；ns：不显著

如表8中所示，所有PEG化的rVWF候选物都引起了共注射的rFVIII的剂量调整的AUC上的统计学上显著的增加。所有候选物都没有显著地改变FVIII半衰期。平均滞留时间升高至1.2至2.0倍，但未用所使用的统计模型计算显著性。

图24显示了FVIII的剂量调整的AUC值以及末端半衰期连同95％的置信区间。

与原始rVWF对照相比，与所有PEG化的rVWF候选物共注射的FVIII的剂量调整的AUC都较高。相反，在PEG化的rVWF存在时FVIII的末端半衰期与用rFVIII和原始rVWF对照所获得的半衰期非常相似，其反映了图22中晚期时间点的FVIII活性曲线的平行。

当与PEG化的rVWF候选物共注射时，FVIII的平均滞留时间(图31)总是增加。

总的来说，所有PEG化的rVWF轭合物维持了多聚体结构而无任何降解。相比之下所有功能活性降低了。低的VWF:RCo和VWF:CB活性对VWF的伴侣功能没有影响。它可能甚至对避免血小板粘附有利。静态测定中测量的减小的VWF:FVIIIB能力在剪切条件(shear condition)下被改进，表明在循环中PEG-rVWF能够携带适量的FVIII。综上所述，综合所有体内数据，在FVIII缺陷型小鼠中所有PEG化的rVWF候选物显示出改进的VWF:Ag药代动力学特征，其与共注射的rFVIII的药代动力学特征的改进并行。

实施例6

PEG化的FVIII的体外和体内实验

原始的重组FVIII是Advate rAHF-PFM[抗血友病因子(重组)无血浆/白蛋白法原料药物质]，是Baxter AG的一种已得到许可的冻干药物产品。在调至pH 6.9的50mM HEPES、5mM CaCl₂、350mM NaCl和0.1％聚山梨醇酯80的缓冲液中配制这种rFVIII原料物质。在表9中给出这种rFVIII的分析数据。用BCA测定(Pierce，Rockford，IL，USA)来确定蛋白质含量，并将比活性表示为FVIII生色活性(IU)/蛋白质(mg)的比率。所述rFVIII原料药含有少于2.3μgVWF:Ag/1000IU的rFVIII。在还原条件下进行SDS-PAGE，随后用多克隆抗人FVIII抗体进行免疫印迹以显示FVIII的完整结构域结构(图26)。

表9：原始rFVIII MOQ HEPES 01-E的分析数据

依照实施例2A、2A1、2B、2B1、2C、4A、4B、4B1和4C制备具有经由rFVIII的赖氨酸残基的氨基基团的可释放键的PEG-rFVIII轭合物。支链的PEG衍生物具有20K、40K和60K的分子量，它们中的每一个具有两种不同的释放特性(短和长的释放时间)。为研究与可释放的PEG试剂轭合的条件的可能影响，还制造了模拟制品(对照)，其经过整个制备过程但没有PEG化。

表10：PEG-rFVIII制品的PEG化程度

材料名称	蛋白质(mg/ml)	PEG/FVIII*比色的(mol/mol)	PEG/FVIII**HPLC(mol/mol)	游离PEG
材料名称	蛋白质(mg/ml)	PEG/FVIII*比色的(mol/mol)	PEG/FVIII**HPLC(mol/mol)	游离PEG	Lys20K支链短	0.290	12.7	12.8	＜0.01％
Lys20K支链长再合成的	0.2650.320	5.9-	11.18	不可测＜0.01％	Lys20K支链短	0.290	12.7	12.8	＜0.01％
Lys20K支链长再合成的	0.2650.320	5.9-	11.18	不可测＜0.01％	Lys40K支链短再合成的	0.4000.100	107-	-11	＜0.01％＜0.01％
Lys40K支链长再合成的	0.1200.220	14.6-	-10.1	＜0.01％＜0.01％	Lys40K支链短再合成的	0.4000.100	107-	-11	＜0.01％＜0.01％
Lys40K支链长再合成的	0.1200.220	14.6-	-10.1	＜0.01％＜0.01％	Lys60K支链短	0.500	9.8	-	＜0.01％
Lys60K支链长	0.120	12.3	11.3	＜0.01％	Lys60K支链短	0.500	9.8	-	＜0.01％

用Bio-Rad(Hercules，CA，USA)的“DC蛋白质测定”以未修饰的rFVIII为标准品确定PEG-rFVIII的蛋白质含量。

*使用比色测定法来确定每分子的PEG的数目

**用HPLC法确定每分子的PEG的数目

-：数据不可得(avilbale)

通过非还原的SDS-PAGE的碘化钡染色确定剩余的游离PEG。

由于持久的体外和体内分析试验，不得不再合成三种轭合物以完成研究。在再合成的轭合物和首批的20K支链长以及Lys40K支链长的PEG-rFVIII衍生物之间观察到PEG比FVIII的比率的一些差异，其可能由所使用的不同的分析方法来解释。当通过碘化钡染色研究时，在任何样品溶液中无游离的PEG残留。

确定FVIII活性：用生色法确定FVIII活性。在该测定中，将含有FVIII的样品在含有钙的缓冲液中与凝血酶、活化的因子IX(FIXa)、磷脂和因子X(FX)混合。FVIII被凝血酶活化并随后与磷脂、FIXa和钙离子形成复合物。这一复合物将FX活化为FXa，其反过来裂解特异的生色底物释放出对硝基苯胺(pNA)，产生显色反应。

对于PEG-rFVIII轭合物的分析，将样品和参照都用人FVIII缺乏的血浆预稀释为约1IU/ml FVIII：生色活性并用稀释缓冲液进一步稀释至0.5至0.008IU/ml FVIII：生色的范围。用微量培养板读数器于405nm使用动力学模式测量从底物释放pNA的时间过程。反应的斜率与样品中FVIII的浓度成比例。相对于重组FVIII浓缩标准品(以世界卫生组织(WHO)浓缩物参照(WHO6)为标准校准的)计算样品中FVIII的浓度，并以IU/ml表示。测定的定量限为0.03IU/ml的FVIII。

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定FVIII抗原：依照制造商的使用说明书，进行某些极小的修改，使用从Cedarlane(CedarlaneLaboratories，Hornby，Ontario，Canada)获得的测定试剂盒确定FVIII抗原水平。用100μl/孔的多克隆抗人FVIII抗体涂抹高结合96孔ELISA板(Costar 3590，Corning Incorporated，NY，USA)并于室温孵育两小时。用试剂盒的稀释缓冲液将样品稀释为0.0078至0.5IU/ml FVIII:Ag。之后用含有0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲的盐水(PBS；6.5mM二水合磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、140mM NaCl、pH7.2)(PBST)清洗板。向板加入100μl稀释的样品并于室温孵育2小时。用PBST清洗的步骤后，向板加入100μl/孔的过氧化物酶轭合的多克隆抗人FVIII抗体(#EIA8-0015R1，CedarlaneLaboratories，Hornby，Ontario，Canada)。通过将N-四甲联苯胺(TMB)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)用作底物来检测过氧化物酶活性。用ELISA读数器于450nm测量显影的颜色强度。使用人正常血浆混合液(凝固参照品，批次1R92003I，Baxter)作为标准品并使用重组rFVIII原料药(Advate#B0206000-05/01)作为对照。相对于标准制品计算FVIII:Ag浓度并表示为FVIII:Ag IU/ml。

通过表面等离子体共振技术测量VWF-FVIII亲和性：依照制造商的使用说明书将原始rVWF固定在Biacore 3000(Biacore AG，Uppsala，Sweden)设备的CM5传感器芯片的流通池上至恒定水平。然后使用“kinject”模式将原始rFVIII和PEG-rFVIII样品的一系列稀释液施加于芯片，并使FVIII结合3分钟以及FVIII解离10分钟。这些循环的每一次之后，从芯片除去FVIII(“再生”)并用新的FVIII样品重复实验。

FVIII的SDS-PAGE和免疫印迹：将FVIII样品(100mIU，相当于10ng蛋白质每泳道)应用于梯度(4-12％)Bis-Tris凝胶并进行温和还原条件下的电泳，随后在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行标准印迹程序。为使FVIII条带可见，将多克隆抗人FVIII抗体(CL20035A；Cedarlane Laboratories，Hornby，Ontario，Canada)、单克隆抗人重链A2结构域抗体(OBT0037，Oxford Biotechnology，Oxford，U.K.)或单克隆抗人轻链A3结构域抗体(10104；QED Bioscience Inc，San Diego，CA，USA)用作第一抗体。作为第二抗体，将碱性磷酸酯酶(ALP)标记的兔抗绵羊IgG(H+L)(A130-101AP，Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX，USA)用于多克隆抗体而碱性磷酸酯酶(ALP)标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)(A90-216AP，Bethyl Laboratories，Inc.，Montgomery，TX，USA)用于单克隆抗体。用Bio-Rad的ALP彩色显色试剂盒(Hercules，CA，USA)将印迹显色。使用全范围彩色标记(250-10kDa，GE-Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)作为分子量标准。

PEG的SDS-PAGE和免疫印迹：将FVIII样品(300mIU，相当于30ng蛋白质每泳道)应用于梯度(4-12％)Bis-Tris凝胶并进行还原条件下的电泳，随后在PVDF膜上进行标准印迹程序。为使PEG可见，将多克隆兔抗人PEG抗体用作第一抗体。通过用PEG化的蛋白质免疫在兔中培育抗PEG抗体。通过蛋白质G琼脂糖凝胶4B(GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)上的亲和色谱纯化兔血清的IgG级分，随后进行的特异性的阴性免疫吸附。将碱性磷酸酯酶(ALP)标记的山羊抗兔IgG(A120-201AP，Bethyl Laboratories Inc.，Montgomery，TX，USA)用作第二抗体。用Bio-Rad的ALP彩色显色试剂盒(Hercules，CA，USA)将印迹显色。使用全范围彩色标记(250-10kDa，GE-Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)作为分子量标准。

FIXa辅因子活性测定：在凝血酶特异性抑制剂(Pefabloc TH，Penthapharm，Basel，Switzerland)存在的情况下将稀释至1IU/ml(根据它们的生色活性)的未处理的或凝血酶活化的原始rFVIIIa和PEG-rFVIII样品加至已准备的FIXa、FX、磷脂(PL)-囊泡[由60％磷脂酰胆碱(PC)和40％磷脂酰丝氨酸(PS)构成，两者都来自Avanti PolarLipids Inc(Alabasta，A1，USA)]和CaCl₂的混合物。将这一反应混合物于37℃孵育以使复合物形成以及随后的FXa生成。以确定的间隔采集子样品直到30分钟并加至被FXa选择性裂解的生色底物中。底物缓冲液含有乙二胺四乙酸(EDTA)以终止任何进一步的FXa生成。孵育15分钟后，通过加入乙酸终止反应。用ELISA读数器于405nm测量与FXa浓度成比例的吸光度(A405)。通过使用纯化的FXa(HFXa1011，Enzyme Research Laboratories，Swansea，UK)构建参照曲线并将吸光度值转化为FXa浓度。

通过将1IU/ml原始的rFVIII或PEG-rFVIII与1nM凝血酶一起于37℃孵育一分钟来为每次试验新鲜准备凝血酶活化的rFVIII(rFVIIIa)并通过加入10μM的凝血酶特异性抑制剂(Pefabloc TH，Penthapharm，Basel，Switzerland)终止反应。

如下文绘制并分析FX活化的时间过程(图27)：通过确定曲线线性部分的斜率来计算FX活化的最大速率并表示为nM FXa/min。通过计算曲线线性部分的X轴截距确定迟滞期。将最大活性确定为20和30分钟之间所测量的FXa浓度的平均值并用下列公式计算半最大值时间(t_1/2)：t_1/2＝(AFXa最大值/2+迟带期时间×斜率)/斜率。通过使用Microsoft Excel的内部函数计算所有参数。

通过FIXa辅因了子活性测定测量凝血酶介导的FVIII的活化和失活的动力学：将原始的rFVIII和PEG-rFVIII用25nM HEPES；175mMNaCl、5mg/ml牛血清白蛋白质(BSA)pH 7.35的缓冲液稀释至1IU/mlFVIII活性(根据它们的生色活性)并与0.5nM凝血酶于37℃孵育。向在不同时间点(直到40分钟)采集的子样品加入等份的已准备的FIXa、FX、磷脂(PL)-囊泡(由60％PC和40％PS构成)、CaCl₂和凝血酶抑制剂的混合物中以终止FVIII的进一步活化。将这些反应混合物于37℃孵育三分钟以使FXa生成。向这一混合物的子样品加入被FXa选择性裂解的生色底物。如上文所描述的关于FIXa辅因子的活性测定来确定FXa浓度并对FVIII与凝血酶的孵育时间绘图。通过使用Microsoft Excel内部函数将曲线的上升部分与单指数拟合而已从曲线的上升部分定量地估计出失活的速率。

凝血酶生成测定(TGA)：用0.0025至1μg/ml的原始rFVIII或PEG-rFVIII增强从George King Bio-Medical(Overland Parks，KS，USA)获得的重度血友病A血浆(FVIII活性＜1％)并用

TGA试剂盒(Technoclone，Vienna，Austria)如制造商所描述的测量凝血酶的生成。通过含有低TF和低PL浓度的再脂化(relipidated)的组织因子(TF)制品(TFPL RB试剂)引发反应。将10μl量的这一TFPL溶液用移液器加入40μl FVIII缺乏的血浆(无FVIII或用FVIII和50μl的TGA荧光底物补充)，并加入ELISA板的孔中。将所述板放入微量培养板荧光读数器FL800(Bio-TEKInstruments，Winooski，Vermont，USA)中。于37℃使用360nm的激发波长和460nm的发射波长通过每分钟的自动读数(直到120分钟)持续监测与生成的凝血酶的浓度成比例的荧光强度的增加。

由于测定混合物中存在凝血酶底物，所看到的曲线表示反应期间生成的并裂解荧光底物的所有凝血酶的累积作用。因此，针对每次读数(FU/min)计算反映了实际上有效的凝血酶浓度的荧光强度增加的速率(曲线的一阶导数)，并使用通过测量经由纯化的人凝血酶的底物转化速率而制备的参照曲线转化为凝血酶等价浓度(nM)。以凝血酶浓度对时间的形式绘制凝血酶生成曲线并通过读数器的内置KC4软件(Bio-TEK Instruments，Winooski，Vermont，USA)计算定量参数(峰值凝血酶、起始时间和峰值时间)。

APC介导的FVIII和FVIIIa失活：将未处理的或凝血酶活化的原始rFVIII或PEG-rFVIII样品稀释至1IU/ml(根据它们的生色活性)并在10μM PL囊泡(由60％PC和40％PS组成，两者都来自Avanti PolarLipids Inc，Alabasta，A1，USA)和5mM CaCl₂存在的情况下与0.05U/ml活化蛋白质C(APC)孵育。在对照试验中，在不存在APC的情况下孵育rFVIII样品。在确定的时间点采集子样品以通过如上文所描述的关于FIX辅因子活性的测定测量其FIXa辅因子活性来确定残留的活性FVIII或FVIIIa。

通过将2IU/ml原始的rFVIII或PEG-rFVIIII样品与1nM凝血酶(#2311PL，Enzyme Research Laboratories，Swansea，UK)于37℃孵育1分钟为每次试验新鲜制备凝血酶活化的FVIII(FVIIIa)。通过加入10μM的凝血酶特异性抑制剂(Pefabloc TH，Penthapharm，Basel，Switzerland)终止反应。

小鼠模型：使用敲除FVIII的小鼠作为血友病模型。模拟人血友病A，所述小鼠患有严重的血友病A(FVIII＜0.01IU/ml)但具有正常的VWF水平(相对于人VWF参照约0.15IU/ml)。

FVIII的应用：使用与用于轭合相同的重组FVIII原料药作为对照物(rFVIII MOQ_HEPES_01E)。将所述原料药以等份冷冻贮存于低于-60℃并在使用前解冻。将PEG-rFVIII候选物或原始rFVIII对照解冻并与20mM HEPES、150mM NaCl、3.2％甘露醇、0.8％海藻糖、2.5mMCaCl₂、1％人白蛋白、pH 7.4的缓冲液混合以达到适用于输注的浓度。将FVIII溶液等分，于-20℃冷冻并恰在使用前解冻。目标剂量为200IU/kg的FVIII：生色。从解冻的样品再次测量浓度并计算所用的剂量。在结果部分的图例说明中给出剂量。经由尾部静脉注射7至10ml/kg体重，并在六分钟、3、6、9、16和24小时后，如果需要在32小时后通过心脏穿刺对一组的6只小鼠采血。将9体积血与1体积3.8％柠檬酸钠混合，并立即于3000g离心10分钟。再次于3000g离心上清液五分钟，分离血浆，以等份冷冻并贮存于低于-60℃以便分析。

确定小鼠血浆中FVIII活性：依照上文所描述的测定原理确定FVIII活性。用微量培养板读数器使用动力学模式于405nm测量从底物释放pNA的时间过程。反应的斜率与样品中FVIII浓度成比例。相对于人血浆参照制品计算样品中FVIII的浓度，以WHO血浆参照为标准校准(人血浆中FVIII和VWF的5^thIS，NIBSC#02/150)，并以IU/ml表示。测定的定量限为0.03IU/ml的FVIII。

计算人VWF和FVIII的循环半衰期参数：当研究FVIII缺陷型小鼠时，为分析FVIII水平，t₀＝0小时的浓度设置为零。用药代动力学参数零至24小时的AUC、末端消除速率和平均滞留时间概述FVIII随时间的水平。

从0至24小时的浓度vs.时间的曲线下的面积(AUC)：通过线性梯形法则使用在不同的时间点观察到的浓度的算术平均值计算从0至24小时的浓度vs.时间的曲线下的面积(AUC)。假定在剂量和AUC之间存在线性关系。在这一假设下，根据施用的不同剂量调整不同项目的AUC。通过用计算出的AUC除以每kg体重所施用的剂量进行剂量调整。

末端消除速率：使用由如Wolfsegger建议的偏差校正修改过的最后三个时间点的单独浓度的自然对数的算术平均值估计末端消除速率(λ)。参见Wolfsegger等人(2005)J.Pharmacokinet.Pharmacodyn.32(5-6)：757-766。

平均滞留时间：用AUMC_0-无穷除以AUC_0-无穷计算平均滞留时间(MRT)。通过使用不同时间点所观察到的浓度的算术平均值加上三点尾翼面积校正的线性梯形法则来计算AUMC_0-无穷和AUC_0-无穷。通过在每项目最后三个时间点所观察到的算术平均值上的对数-线性拟合来计算尾翼面积校正。

PEG化的rFVIII的功能参数：通过修饰的FVIII的生色活性测量它的效力。在测定条件下，FVIII被凝血酶活化，因此测定反映了其增强FIXa介导的FX活化的最大效力。为区分生物活性和失活的FVIII，如实验部分中所描述的，通过ELISA确定FVIII:Ag。为比较不同轭合物的比活性，将这两个参数都与产物的蛋白质含量相关联。

表11概述了所测量的值。

表11：PEG化的rFVIII轭合物的定量参数

(所有的结果都获得自新鲜解冻的等份并且为至少两次测量的平均值)

如上文所描述的关于通过表面等离子体共振技术测量VWF-FVIII亲和性，使用Biacore 3000系统用固定的原始rVWF(rVWF133P1)和流动相中的样品(原始rFVIII或PEG-rFVIII轭合物)确定FVIII对VWF的亲和性。假定VWF和FVIII之间为均一地1∶1相互作用，使用Biacore的“生物评估”程序的Langmuir模型确定结合和解离常数。未发现原始rFVIII和PEG-rFVIII之间与VWF的亲和常数(KD)的相关差异。由于PEG-rFVIII轭合物与这一或任何其他的相互作用模型未产生最佳的拟合(可能因为rFVIII由于PEG化而产生了某些构象变化)，所以只能进行近似的估计。测量值的比率和比活性概述于表12。

表12：PEG-rFVIII轭合物的比活性

从示于表3的测量数据计算各值。

所有的PEG-rFVIII轭合物与原始rFVIII相比都具有显著下降的FVIII活性。然而，没有PEG化但经过整个制备过程的FVIII对照的FVIII比活性也稍稍减小。

活性的下降与PEG化试剂的MW或特性无关。例如，Lys 60K支链长的轭合物具有约减少65％的FVIII比活性，而Lys 20K支链长的轭合物的比活性与原始rFVIII相比减少至约14％。由于在分析性表征期间使用了两种不同的确定PEG化程度的方法，除了Lys 20K支链长的轭合物(其中用HPLC方法获得了最初的轭合物和再合成的材料的数据)，未能评估PEG化程度和比活性之间的关联。尽管再合成的Lys 20K支链长的轭合物比最初的轭合物具有较低的PEG化程度，但这两者具有相似的比活性。

在所有轭合物中，FVIII抗原比蛋白质的比率低于10％。由于在上文所描述的，关于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定FVIII抗原的测定中使用了两种多克隆抗体，这一下降表明整个分子中PEG部分的强遮蔽作用。FVIII生色活性(FVIII：生色)比FVIII:Ag的比率升高，其可能暗示尽管一些表位被强地覆盖，但在活性确定条件下，可能由于试剂中凝血酶的作用，PEG-rFVIII可被活化或PEG部分的部分释放可立即发生。

用每一种PEGrFVIII轭合物的首批进行详细的生物化学表征。由于初始材料不足，将再合成的轭合物用于APC介导的rFVIII的失活的研究(在下文中以标题“APC介导的FVIII和FVIIIa的失活”进行描述)和在人FVIII缺乏的血浆中的体外水解研究(在下文中以标题“人FVIII缺乏的血浆中可释放的PEG-rFVIII的体外释放”进行描述)。

通过非还原的SDS-PAGE及随后使用多克隆抗人FVIII抗体的免疫印迹可见PEG-rFVIII轭合物的结构域结构(图28、图片A)。为评估成功的PEG化，如图28、图片B中所展示的，用多克隆抗PEG抗体对凝胶进行免疫印迹。依照测量的蛋白质值将所有样品用于凝胶。

任何PEGrFVIII轭合物中FVIII特有的结构域结构没有被PEG化所影响。作为PEG化的结果，伴随某些重链(HC)-B结构域条带强度的降低出现了新的高MW的条带。使用抗PEG抗体的染色证实了成功的PEG化。在凝胶上未见到降解的产物。

由于多克隆抗体对不同的结构域不具有相同的亲和性，因此还用抗HC-A2片段和轻链(LC)-A3结构域的特异性抗体对凝胶进行免疫印迹(图29)。

图29图片A显示含HC的条带的PEG MW依赖性增加。抗体还显示没有任何进一步降解条带的一些90kDa的完整HC条带。用作起始材料的rFVIII含有“延长的”轻链，其也通过抗LC抗体检测(图29、图片B)。免疫印迹中观察到80kDa和160kDa条带的MW增加，暗示轻链也已被PEG化，尽管可能在较低的程度上。在40K PEG-rFVIII轭合物中出现一些较低MW的降解产物。

rFVIII的PEG化对FIXa辅因子活性的影响：FXa生成测定，也被称为FIXa辅因子测定，是以在Ca⁺⁺离子存在的情况下在适合的磷脂(PL)表面上FVIII和凝血酶活化的FVIII(FVIIIa)都与FIXa形成可迅速活化FX的复合物这一事实为基础的。参见

等人(1981)Thrombosis Research 21：695。复合物的组装动力学和活性由FVIII调节并且是FVIII分子的功能完整性的敏感性量值。依照所测量的FVIII生色活性将PEG-rFVIII轭合物以及FVIII对照和原始的rFVIII稀释至1IU/ml并加至已准备的FIXa、FX、PL囊泡和氯化钙的混合物中。在确定的间隔采集子样品直到30分钟并如上文所描述的关于FIXa辅因子活性测定来确定生成的FXa。然而，即使所有的rFVIII轭合物都被稀释至1IU/ml，在所得到的最大FXa上还是会有轻微的差异(表13)。因此，为了更形象化的比较FX活化的时间过程，将FXa活性表示为最大FXa活性的百分比(图30)。

没有凝血酶活化时，所有PEG-rFVIII轭合物与原始rFVIII和FVIII对照相比，显示出延迟的复合物形成以及FX活化速率较慢。除了Lys 40K支链长的轭合物显示出稍稍较多的FX活化速率减少以外，在轭合物之间未观察到FX活化速率的相关差异。对照似乎比原始rFVIII稍稍更有活性。

表13：无凝血酶活化时FIXa辅因子活性的定量参数

通过将1IU/ml原始的rFVIII或PEG-rFVIII与1nM凝血酶于37℃孵育一分钟从所有产物制备凝血酶活化的rFVIII(rFVIIIa)。通过加入10μM的凝血酶特异性抑制剂(Pefabloc TH，Penthapharm，Basel，Switzerland)终止反应并且如同测量未活化的rFVIII，测量rFVIIIa的辅因子活性。

为了显示用不同的PEG-rFVIII轭合物获得的FX活化的时间过程，将FXa活性表示为最大FXa活性的百分比(图31)。定量动力学参数概述于表14。

表14：凝血酶活化后FIXa-辅因子活性的定量参数

与凝血酶孵育后，所有的PEG-rFVIII轭合物显示出与原始rFVIII或对照相似的FX活化速率，还具有增强的活性。还观察到最大FXa生成能力的稍稍增加。

通过FIXa辅因子活性测定测量凝血酶介导的FVIII的活化和失活的动力学：用FIXa辅因子活性测定测量凝血酶活化和失活的时间过程。将含有1IU/ml原始rFVIII或PEG-rFVIII的样品与0.5nM凝血酶孵育。在加入凝血酶前以及之后按时间间隔(直到40分钟)采集子样品并加至已准备的FIXa、FX、PL-囊泡、氯化钙和凝血酶抑制剂的混合物中以终止FVIII上的进一步反应。将反应混合物孵育3分钟因为在这一时间点没有凝血酶时只有最少的FXa形成，而在经由凝血酶的充分活化后已达到最大活性的约40％。

图32显示原始rFVIII或PEG-rFVIII轭合物的凝血酶活化和失活的时间过程。表15显示与原始rFVIII相比的相对一级失活速率。

表15：凝血酶活化的速率常数

样品	相对k′
样品	相对k′	FVIII对照	0.72
Lys20K支链短	0.35	FVIII对照	0.72
Lys20K支链短	0.35	Lys20K支链长	0.39
Lys40K支链短	0.48	Lys20K支链长	0.39
Lys40K支链短	0.48	Lys40K支链长	0.44
Lys60K支链短	0.46	Lys40K支链长	0.44
Lys60K支链短	0.46	Lys60K支链长	0.51

在存在0.5nM凝血酶的情况下，原始rFVIII和对照都显示出在两分钟内达到最大活性的迅速活化，随后是几乎分别在20和30分钟内完成快速的失活。依照FXa生成特性，对照可能更快地被凝血酶活化并显示稍稍较慢的失活速率。PEG-rFVIII候选物显示在3至5分钟之间达到最大值的稍稍较慢的活化速率以及具有残留的FIXa辅因子活性的实质下降的失活速率。

APC介导的FVIII和FVIIIa失活：将原始的或PEG化的FVIII(根据FVIII：生色活性稀释至1IU/m l)在PL囊泡和CaCl₂存在的情况下在具有或不具有凝血酶的预活化时与0.05U/ml活化蛋白C(APC)孵育(如上所述)。通过与研究凝血酶介导的活化和失活动力学的相似描述，测量FIXa辅因子活性来确定APC失活后残留的FVIII活性。按时间间隔采集APC-rFVIII混合物的子样品直到10分钟并加已准备的FIXa、FX、PL-囊泡和氯化钙的混合物中。当未活化时，将混合物孵育十分钟，而当研究凝血酶活化的PEG-rFVIII时孵育五分钟。这些孵育时间是以在未活化和活化的PEG-rFVIII轭合物存在的情况下测量的FXa生成的时间过程(图30和31)为基础的；在所选择的时间点已用PEG轭合物达到全部活性的约70％。在适当的对照试验中，在不存在APC的情况下孵育原始rFVIII和PEG-rFVIII。图33和34显示了失活的时间过程，其中将FXa活性表示为在没有APC时孵育的适当的对照混合物中在第一分钟期间测得的FXa的百分比。表16和17显示与对原始rFVIII所测量的相比计算出的相对一级速率常数。

表16：APC介导的失活的速率常数

样品	相对k′
样品	相对k′	Lys20K支链短	0.46
Lys20K支链长	0.56	Lys20K支链短	0.46
Lys20K支链长	0.56	Lys40K支链短	0.44
Lys40K支链长	0.35	Lys40K支链短	0.44
Lys40K支链长	0.35	Lys60K支链短	0.52
Lys60K支链长	0.38	Lys60K支链短	0.52

在将未活化的原始的rFVIII与0.05U/ml的APC孵育时，观察到具有0.220*min^-1的k′的一级速率失活。相比之下，PEG-rFVIII轭合物首先显示出其FIXa辅因子活性的瞬时增加随后是一级失活，尽管以慢约50％的速率。在APC不存在的情况下孵育的样品中没有这样的变化。原始rFVIII和PEG-rFVIII轭合物都保持稳定(图33中的插图)。由于在试验时间点缺少试验材料而未获得对照的数据。

表17：失活速率常数

样品	相对k′
样品	相对k′	Lys20K支链短	0.50
Lys20K支链长	0.50	Lys20K支链短	0.50
Lys20K支链长	0.50	Lys40K支链短	0.55
Lys40K支链长	0.54	Lys40K支链短	0.55
Lys40K支链长	0.54	Lys60K支链短	0.54
Lys60K支链长	0.64	Lys60K支链短	0.54

凝血酶活化的原始rFVIII或PEG-rFVIII的孵育显示出一级失活(图34)以及对PEG-rFVIII轭合物来说慢约50％的失活速率(表9)。在不存在APC的情况下凝血酶活化的原始rFVIIIa和PEG-rFVIIIa轭合物保持稳定或仅在FIXa辅因子活性上显示出可忽略的降低。

FVIII缺乏的血浆中PEG化对FVIII的凝血酶生成能力的影响：相应于完整FVIII的0.025至1IU/ml的活性范围，体外用0.0025和0.1μg/ml范围内的逐渐增加量的原始rFVIII和PEG-rFVIII增强具有低于0.01U/ml(＜1％)FVIII活性的严重血友病A患者的血浆样品。如实验程序中所描述测量由低浓度的TF和PL复合物引发的凝血酶的生成。如图35(图片A)所示，原始rFVIII的剂量依赖性地加入改善了FVIII缺乏的血浆的受损的凝血酶生成。所述改善导致了起始时间和峰值时间的缩短以及峰值凝血酶的增加，如图35的图片B中所绘的，其显示了对FVIII浓度的对数的线性剂量响应。这一相关性意味着最大的影响发生在低浓度范围内。

图36显示在FVIII缺乏的血浆中用PEG-rFVIII样品获得的凝血酶生成曲线(图片A-F)以及峰值凝血酶值的剂量响应曲线(图片G)。

所有PEG-rFVIII轭合物以剂量依赖性方式改正FVIII缺乏的血浆中受损的凝血酶生成，然而是以低于0.01μg/ml血浆的极小的作用。测量了使剂量响应曲线与原始rFVIII平行的高于这一浓度的浓度，其表明需要更多FVIII以达到与原始rFVIII一样的峰值水平。在这一测定中，Lys60K支链长的轭合物似乎具有更高的活性，尤其是在较高的浓度范围内。

升高的pH下可释放的PEG-rFVIII的体外释放：为研究PEG部分从rFVIII的体外释放的动力学，将PEG化的rFVIII样品在用1/10体积的0.1M NaOH调至pH 8.1的最初的rFVIII缓冲液(50mM HEPES、5mM CaCl₂、0.1％聚山梨醇酯80、350mM NaCl、pH～6.9)中孵育。作为对照，用同样的方法处理原始rFVIII和非PEG-rFVIII对照。将所有样品保持在环境温度。在不同的时间点采集子样品并测量FVIII:Ag、FVIII生色活性的变化。通过SDS-PAGE及随后用FVIII和PEG的特异性抗体进行的免疫印迹研究结构变化。

PEG部分的体外释放期间FVIII:Ag和生色活性的变化：图37显示了FVIII比活性的变化而图38显示FVIII:Ag的变化，都表示为IU/mg蛋白质。

原始rFVIII和上样(shipping)对照显示出活性和抗原水平的持续降低。相比之下，PEG化的rFVIII轭合物的活性和抗原水平都在最初的48小时内逐渐升高并在平稳时期后再下降。对于Lys 40K支链短的轭合物来说，达到了最高相对活性增加(2.4倍)。对两种60K轭合物观察到最快的增加和最短的平稳时期。

PEG部分的体外释放期间PEG-rFVIII的结构变化：为使在pH 8.1的较高pH下孵育时的结构变化可见，使样品经受还原条件下的SDS-PAGE及随后用多克隆抗人FVIII抗体(图39)、单克隆抗人重链A2结构域抗体(图40)和多克隆抗PEG抗体(图41)进行免疫印迹。原始rFVIII和FVIII对照显示出FVIII活性和FVIII:Ag水平的持续下降，其与孵育期间FVIII的降解相应。

由于在pH 8.1的缓冲液中孵育时FVIII:Ag水平和FVIII：生色活性都增加，暗示了PEG释放的解掩蔽作用，用于凝胶的FVIII的量与所测量的没有进行释放反应的材料的FVIII：生色活性一致(对抗FVIII抗体来说为100mIUFVIII：生色而对抗PEG抗体来说为300mIUFVIII：生色)。

如图39中所示，在pH 8.1的缓冲液中孵育3天后，没能发现PEG-rFVIII轭合物的实质变化但观察到用抗FVIII免疫印迹时原始rFVIII和FVIII对照两者的轻微模糊效应。更长的多达7天的孵育产生了具有不可测表位的降解。比较不同候选物，Lys 40K支链长的轭合物和Lys 20K支链长的轭合物显示出最久的结构完整。如图40所显示的，PEG-rFVIII轭合物的重链上的某些MW减小发生在孵育3天后。孵育7天后，HC-A2片段出现在所有的轭合物中。还用抗PEG免疫印迹观察到所有结构域的分子量的时间依赖性减小(图41)，其反映了结合的PEG的某些释放。未检测到大量的游离PEG。孵育7天后，所有轭合物被降解至由FVIII特异性免疫印迹不能使它们可见的程度(数据未显示)。

人FVIII缺乏的血浆中可释放PEG-rFVIII的体外释放：为模拟生理条件，在第二种释放实验中，于37℃在人FVIII缺乏的血浆中孵育具有20K和40K PEG的PEG-rFVIII轭合物。在这样的条件下通过测量FVIII生色活性和FVIII抗原水平的变化研究PEG的解离。将PEG-rFVIII轭合物与原始rFVIII和FVIII对照一起稀释至0.1μg/ml蛋白质浓度并加至具有低于1％的FVIII活性的FVIII缺乏的血浆(George King Bio-Medical Overland Parks，KS，USA)中，在孵育期间用0.005％的叠氮化钠防止微生物污染。在确定的时间点采集样品并就FVIII生色活性测定来说立即检验或等分并冷冻于-80℃以便FVIII:Ag的测定。

由于缺乏材料，为这一实验再合成了PEG-rFVIII轭合物，只有Lys20K支链短的轭合物来自初次产物。再合成的Lys 20K支链长的轭合物具有较低的PEG化程度。再合成的Lys 40K支链长的轭合物也具有较低的PEG化程度，但由于不同的分析方法，直接比较是不可行的(表9)。在比活性上也有一些差异，但它们似乎与PEG化程度不相关(表11)。

当在血浆系统中孵育时，原始rFVIII的比活性下降(图42)。与之相比，轭合物的比活性在孵育时瞬时升高，在约10小时后达到最大水平。没有轭合物达到原始rFVIII最初的比活性。从曲线的上升部分确定，在不同的轭合物和原始rFVIII之间，失活速率间没有实质差异(数据未显示)。FVIII抗原水平也在孵育期间上升(图43)，其暗示了解掩蔽作用。与FVIII活性结果相似，没有轭合物达到原始rFVIII最初的水平。

以200IU FVIII/kg体重的目标剂量向FVIII缺陷型敲除小鼠输注rFVIII或PEG-rFVIII。在每个时间点每种轭合物使用6只小鼠一组。为了不依赖所使用的FVIII剂量直接比较消除曲线，将FVIII血浆水平相对于在血浆中施用物质5分钟后发现的FVIII浓度标准化(标准化％)。

图44-49显示注射物质后以IU FVIII/ml为单位(图片A)或被标准化为百分比(图片B)的FVIII血浆水平。在适当的图例说明中显示所注射的材料的准确量。

通常，所有的PEG-rFVIII都显示出比原始对照改良的药代动力学。用统计学方法计算药代动力学参数的改良程度并概述于表10中。

血浆FVIII活性在输注PEG-rFVIII后立即增加，在3小时和6小时之间达到平稳时期，随后下降。输注24小时后在小鼠血浆中测量到比注射原始rFVIII后多约10倍的PEG-rFVIII活性。

与Lys 20K支链短的候选轭合物相似，20K支链长的PEG-rFVIII比原始rFVIII循环久得多。

用40K支链短的PEG进行PEG化的重组FVIII比原始rFVIII循环的久。

注射后24小时，原始rFVIII接近定量限，而Lys 40K支链长的PEG-rFVIII在输注后32小时依旧可检测到。

具有短的可释放特性的60K的轭合物比原始rFVIII从小鼠血浆的清除慢得多。

在血友病小鼠中Lys 60K支链长的PEG-rFVIII轭合物比原始对照rFVIII循环久得多。为了直接比较，将所有PEG-rFVIII候选物的标准化的消除曲线概述于图25。对照组是贯穿所述研究行的所有实验的平均值(每时间点24只动物)。

在表18中给出从统计学评价得到的结果。将数据给出为药代动力学参数比与每种rFVIII轭合物一起运行的专门对照的增加。所有候选物的FVIII曲线下面积(AUC)大量增加，但没有候选物表现得比其他候选物优越。各候选物之间FVIII半衰期的增加不同。Lys 20K支链长的PEG-rFVIII产生了FVIII半衰期的显著增加。对于40K的候选物来说，观察到显著增加FVIII半衰期的统计趋势，但直到60小时的血浆采样点的研究时间延长对证实显著性来说是必须的。60K变体没有产生半衰期的显著增加。PEG-rFVIII轭合物的平均滞留时间总是比原始对照高。对Lys 40K支链短的候选物观察到MRT的最高增加，而Lys 60K的轭合物产生最低的增加。

表18：PEG-rFVIII的药代动力学参数(相对于对照的增加)

s：显著，s§：统计趋势，ns：不显著

数据显示与每种PEG-rFVIII轭合物一起运行的原始rFVIII的各对照组相比药代动力学参数的增加。

尽管表18中将结果给出为相对于各自对照实验的相对增加，但图51显示来自具有95％置信区间的统计学评价的AUC和半衰期的绝对数据以允许不同候选物间的直接比较。

所有PEG-rFVIII轭合物的AUC都明显高于平均的原始rFVIII对照。PEG-rFVIII的95％的置信区间与来自对照的置信区间不重叠。在PEG-rFVIII候选物中，Lys 60K的轭合物和Lys 20K支链长的候选物似乎具有最显著的作用。所有PEG-rFVIII候选物的FVIII半衰期也都增加。

所有候选PEG-rFVIII候选物相对于原始rFVIII对照，平均滞留时间升高(原始对照的范围是从5.6至8.9小时)。对于Lys 20K支链长以及Lys 40K支链长和短的候选物发现最高的MRT。

总的来说，所有PEG-rFVIII轭合物都保持了结构域结构而没有任何降解。相比之下，所有的功能活性下降了，在体外孵育时所述功能活性仅能部分地恢复。然而，应当考虑到测量值受到三种同时发生的反应的速率的影响，即PEG部分的释放、PEG-rFVIII的失活和被释放的原始rFVIII的失活。Lys 60K支链长的轭合物具有较高的比活性并且因而具有升高的凝血酶生成能力。然而在所进行的试验中它没有比20K或40K的PEG-rFVIII轭合物显示出任何其他功能或结构上的有利的性能。

用rFVIII或PEG-rFVIII注射FVIII缺陷型小鼠，并观察血浆中FVIII活性直到32小时。所有PEG-rFVIII轭合物都显示出比原始rFVIII对照更慢的消除。尽管在小鼠模型中原始rFVIII以具有较快初始阶段和较慢的末期阶段的两阶段的方式消除，但PEG-rFVIII候选物遵循更加线性的消除特征。Lys 20K支链短的候选物注射进血友病小鼠中后导致FVIII血浆水平的增加直到6小时，随后是FVIII活性的下降。可通过可释放的PEG从PEG-rFVIII的释放，由此恢复FVIII活性来解释FVIII活性的最初的增加。

PEG-rFVIII轭合物的FVIII活性的较慢的消除也可能是两种重叠的作用的结果：持续释放原始rFVIII的循环的更久的PEG-rFVIII，该原始rFVIII之后被以正常消除速率清除。用于动物模型的FVIII剂量是以可测的FVIII活性为基础的。由于PEG-rFVIII候选物的FVIII比活性较低，这导致了PEG-rFVIII轭合物比原始rFVIII对照高1.9至6.7倍的蛋白质剂量。PEG-rFVIII的较慢的消除似乎不依赖于所使用的较高的蛋白质剂量，但还需进一步的实验以评价较高蛋白质剂量的原始rFVIII与相似蛋白质剂量的PEG-rFVIII相比对FVIII血浆水平的影响。

Claims

1.一种化合物，其具有下列结构：

其中：

POLY¹是第一水溶性聚合物；

POLY²是第二水溶性聚合物；

X¹是第一间隔基部分；

X²是第二间隔基部分；

H_α是可电离的氢原子；

R¹是H或有机基；

R²是H或有机基；

(a)是0或1；

(b)是0或1；

R^e1，当存在时，是第一电子改变基团；

R^e2，当存在时，是第二电子改变基团；

Y¹是O或S；

Y²是O或S；并且

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述含胺的生物活性剂是血管性血友病因子部分。

3.根据权利要求2所述的化合物，其中所述血管性血友病因子部分是人重组血管性血友病因子。

4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述含胺的生物活性剂是因子VIII部分。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述因子VIII部分是人重组B-结构域缺失的因子VIII。

6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述因子VIII部分是人重组全长因子VIII。

7.根据权利要求1所述的化合物，其中所述第一水溶性聚合物是聚(环氧烷烃)并且所述第二水溶性聚合物是聚(环氧烷烃)。

8.根据权利要求1所述的化合物，其中所述第一水溶性聚合物具有10,000道尔顿至85,000道尔顿之间的重均分子量并且所述第二水溶性聚合物具有10,000道尔顿至85,000道尔顿之间的重均分子量。

9.根据权利要求1所述的化合物，其具有选自由下列结构组成的组的结构：

其中，对于每个结构以及在每个实例中，(n)独立地为从4至1500的整数，并且(vWF/F8)是选自由血管性血友病因子部分和因子VIII部分所组成的组的含胺的生物活性剂的残基。

10.根据权利要求1所述的化合物，其具有下列结构：

其中，vWF是含胺的重组人血管性血友病因子的残基，并且(n)在每个实例中独立地为从4至1500。

11.根据权利要求1所述的化合物，其具有下列结构：

12.根据权利要求1所述的化合物，其具有下列结构：

其中，F8是因子VIII部分的含胺的残基，并且(n)在每个实例中独立地为从4至1500。

13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述因子VIII部分是重组B-结构域缺失的因子VIII。

14.根据权利要求12所述的化合物，其中所述因子VIII部分是人重组全长因子VIII。

15.根据权利要求1所述的化合物，其具有下列结构：

其中，F8是含胺的因子VIII部分的残基，并且(n)在每个实例中独立地为从4至1500。

16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述因子VIII部分是重组B-结构域缺失的因子VIII。

17.根据权利要求15所述的化合物，其中所述因子VIII部分是人重组全长因子VIII。

18.一种方法，其包括将聚合物试剂与选自由血管性血友病因子部分和因子VIII部分所组成的组的含胺的生物活性剂在适于在所述聚合物试剂和所述生物活性剂之间形成共价连接的条件下接触，其中所述聚合物试剂具有下列结构：

其中：

POLY¹是第一水溶性聚合物；

POLY²是第二水溶性聚合物；

X¹是第一间隔基部分；

X²是第二间隔基部分；

H_α是可电离的氢原子；

R¹是H或有机基；

R²是H或有机基；

(a)是0或1；

(b)是0或1；

R^e1，当存在时，是第一电子改变基团；

R^e2，当存在时，是第二电子改变基团；并且

(FG)是能够与活性剂的氨基基团反应以形成可释放的键合的官能团。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可释放的键合是氨基甲酸酯键合。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述聚合物试剂具有选自由下列结构所组成的组的结构：

其中，对于每个结构以及在每个实例中，(n)独立地为从4至1500的整数。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述含胺的生物活性剂是血管性血友病因子部分。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述血管性血友病因子部分是人重组血管性血友病因子。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述含胺的生物活性剂是因子VIII部分。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述因子VIII部分是人重组B-结构域缺失的因子VIII。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述因子VIII部分是人重组全长因子VIII。

26.一种组合物，其包含根据权利要求1至17任一项所述的化合物以及药学上可接受的赋形剂。

27.一种方法，其包括对患者施用根据权利要求26所述的组合物。

28.一种构造物，其包括结合于至少一个因子VIII部分的根据权利要求2所述的化合物。

29.根据权利要求28所述的构造物，其具有与VWF分子的体内半衰期相比增加的体内半衰期。

30.根据权利要求28所述的构造物，其具有与未与所述构造物结合的因子VIII部分的体内半衰期相比增加的体内半衰期。

31.根据权利要求2所述的化合物，其具有与VWF分子的体内半衰期相比增加的体内半衰期。

32.根据权利要求31所述的化合物，其中所述体内半衰期和VWF分子的体内半衰期相比增加到至少1.5倍。

33.根据权利要求31所述的化合物，其中所述体内半衰期和VWF分子的体内半衰期相比增加到至少2倍。

34.根据权利要求4所述的化合物，其具有与FVIII分子的体内半衰期相比增加的体内半衰期。

35.根据权利要求34所述的化合物，其中所述体内半衰期和FVIII分子的体内半衰期相比增加到至少1.5倍。

36.根据权利要求34所述的化合物，其中所述体内半衰期和FVIII分子的体内半衰期相比增加到至少2倍。