JP2010514773A - 解離可能な連結を有するフォンウィルブランド因子および第ｖｉｉｉ因子のポリマー共役体 - Google Patents

解離可能な連結を有するフォンウィルブランド因子および第ｖｉｉｉ因子のポリマー共役体 Download PDF

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Abstract

本発明は、それぞれ解離可能な連結を有する、フォンウィルブランド因子のポリマー共役体および第ＶＩＩＩ因子のポリマー共役体を提供する。また、共役体を作製する方法、共役体を投与するための方法も提供する。本発明の１つ以上の実施形態において、フォンウィルブランド因子と水溶性ポリマーとの共役体を提供し、該共役体は、水溶性ポリマーに共役されていないフォンウィルブランド因子部分の体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増加した体内半減期を有する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年１２月２７日に出願された米国暫定特許出願第６０／８７７，５３１号の優先権の利益を主張するものであり、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
本発明は、概して、解離可能な連結を有し、それによって体内で活性物質を解離するポリマー活性薬剤の共役体に関する。加えて、本発明は、特に、共役体を合成するための方法、共役体を精製するための方法等に関する。
科学者および臨床医は、活性薬剤を、患者に送達するのに適切な形態に開発する試みにおいて多くの課題に直面する。ポリペプチドである活性薬剤は、例えば、経口よりも注射によって送達されることが多い。このようにして、ポリペプチドは、胃のタンパク質分解環境へ曝露されることなく、体循環に導入される。しかしながら、ポリペプチドの注射には幾つかの欠点がある。例えば、多くのポリペプチドは、比較的短い半減期を有するために、反復注射を必要とし、不都合で、痛みを伴うことが多い。さらに、いくらかのポリペプチドは、患者の免疫系が、１つ以上の免疫応答を誘発し得、その結果、免疫原性ポリペプチドを破壊あるいは中和しようとする。当然ながら、一旦ポリペプチドが破壊あるいは中和されると、ポリペプチドは、その意図する薬力学的活性を発揮することができない。したがって、ポリペプチド等の活性薬剤の送達は、これらの物質が注射によって投与される時でさえも、問題になることが多い。
注射による活性薬剤の送達の問題への取り組みは、ある程度成功している。例えば、活性薬剤を水溶性ポリマーと共役させることにより、免疫原性および抗原性が低下した、ポリマーと活性薬剤の共役体をもたらした。加えて、これらのポリマーと活性薬剤の共役体は、腎臓を介したクリアランスの低下および／または体循環における酵素分解の低下の結果として、非共役型の対応物と比べて大いに増加した半減期を有することが多い。より長い半減期を有する結果として、ポリマー活性薬剤の共役体は、より少ない頻度の投与で充分となり、痛みを伴う注射および面倒な医療専門家への訪問の全体的な数を減少させる。さらに、ごく僅かに可溶性の活性薬剤は、水溶性ポリマーに共役されると、水溶性の大幅増加を示す。
局所使用および内服に対するその立証された安全性ならびにＦＤＡによるその承認のために、ポリエチレングリコールが、活性薬剤に共役されている。活性薬剤が、ポリエチレングリコールつまり「ＰＥＧ」のポリマーに共役される時に、共役された活性薬剤を、従来「ペグ化されている」と称す。ペガシス（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、ペグイントロン（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標））ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｋｅｎｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）、およびＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）ＰＥＧ−フィルグラスチム（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）等のペグ化活性物質の商業的な成功は、活性薬剤の共役形態の投与が、非共役型の対応物に比べて著しい利点を有することができることを示す。また、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（Ｚａｌｉｐｓｋｙ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４４）：２９６−２９９）およびフルオロウラシル（Ｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＤｒｕｇＤｅｓ．Ｄｉｓｃｏｖ．９（ｌ）：９３−Ｉ０５）等の小分子もペグ化されている。Ｈａｒｒｉｓらは、医薬調製物へのペグ化の作用に関する再考を提供している。Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２２１。
これらの成功にもかかわらず、商業的に関連性のある薬物が得られるような活性薬剤へのポリマーの共役は、困難であることが多い。例えば、共役は、薬理学的活性（例えば結合部位またはその付近）に必要とされる活性薬剤上の部位またはその付近に付着されるポリマーをもたらし得る。したがって、そのような共役体は、例えば、ポリマーによって導入される立体効果に起因して、受け入れ難いほど低い活性を有し得る。受け入れ難いほど低い活性を有する共役体を修復する試みは、活性薬剤が、ポリマーへの付着に適切な部位をほとんど有しないか、または全く有しない場合、失敗し得る。したがって、付加的なペグ化の代替手段が所望される。
この問題または他の問題を解決するために提案された１つの手法は、天然活性薬剤（または、ペグ化活性薬剤と比較して増加した活性を有する部分）が解離される、「可逆的ペグ化」である。例えば、可逆的ペグ化は、癌化学療法の分野において開示されている。非特許文献１を参照されたい。特許文献１は、可逆的連結を使用する共役体を説明する。この公報に説明されるように、可逆的連結は、酵素基質部分を使用することで達成することができる。しかしながら、酵素活性に依存するその手法は、酵素の有効性に依存することが指摘されている。非特許文献２を参照されたい。これらの酵素の量および活性に関する患者に起因する変動性は、異なる集団間での一貫性のない共役体の効能を導入し得る。したがって、ポリマー解離のための酵素過程に依存しないさらなる手法が、望ましいとして記述されている。
可逆的ペグ化への別の手法は、特許文献２に説明されており、（特に）生物活性薬剤が、加水分解性カルバミン酸結合によって水溶性非免疫原性ポリマーに連結される、水溶性プロドラッグを説明する。本明細書に説明されるように、生物活性薬剤は、酵素または触媒材料を追加する必要なく、体内でのカルバミン酸結合の加水分解によって容易に解離することができる。
可逆的ペグ化への別の手法は、非特許文献２、特許文献３および特許文献４に説明される。この手法は、限られた数の活性薬剤に適用されているが、これらの参考文献は、可逆的ペグ化が特に適切であろう他の活性薬剤を無視している。さらに別の解離可能な手法は、特許文献５に説明される。
出血性疾患の分野において、タンパク質（例えば、フォンウィルブランド因子および第ＶＩＩＩ因子等）は、出血性疾患に対処するまたは寛解させるために、患者に投与することができる場合もある。そのようなタンパク質の比較的短い半減期により、例えば、可逆的ペグ化によって、これらのタンパク質の体内半減期を増加させることが有利となろう。したがって、本発明は、当技術分野におけるこの必要性および他の必要性の解決に努める。
米国特許出願公開第２００５／００７９１５５号明細書 米国特許第７，０６０，２５９号明細書 国際公開第２００４／０８９２８０号パンフレット 米国特許出願公開第２００６／０１７１９２０号明細書 米国特許出願公開第２００６／０２９３４９９号明細書
Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ（１９９７）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ７（６）：６０１−６０９ Ｐｅｌｅｇ−Ｓｃｈｕｌｍａｎ（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：４８９７−４９０４
本発明の１つ以上の実施形態において、以下の式の共役体を提供する。
Figure 2010514773
 式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり、
Ｘ１は、第１のスペーサ部分であり、
Ｘ２は、第２のスペーサ部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
（ａ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
（ｂ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
Ｒｅｌは、存在する場合、第１の電子変化基であり、
Ｒｅ２は、存在する場合、第２の電子変化基であり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
（ｖＷＦ／Ｆ８）は、フォンウィルブランド因子部分および第ＶＩＩＩ因子部分から成る群から選択されるアミン含有の生物活性薬剤の残基である。
本発明の１つ以上の実施形態において、共役体を調製するための方法を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、該共役体を含む医薬調製物を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、該共役体を投与するための方法を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態において、構築物を提供し、該構築物は、少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子部分に結合する、本明細書に提供される共役体を含む。
本発明の１つ以上の実施形態において、フォンウィルブランド因子と水溶性ポリマーとの共役体を提供し、該共役体は、水溶性ポリマーに共役されていないフォンウィルブランド因子部分の体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増加した体内半減期を有する。
本発明の１つ以上の実施形態において、フォンウィルブランド因子と水溶性ポリマーとの共役体を提供し、該共役体は、水溶性ポリマーに共役されていないフォンウィルブランド因子部分の体内半減期と比較して、少なくとも２倍増加した体内半減期を有する。
本発明の１つ以上の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子部分と水溶性ポリマーとの共役体を提供し、該共役体は、水溶性ポリマーに共役されていない第ＶＩＩＩ因子部分の体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍増加した体内半減期を有する。
実施例１Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物の典型的なクロマトグラムを示す図である。 実施例２Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物の典型的な分離特性を示す図である。 実施例２Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物の典型的なクロマトグラムを示す図である。 実施例３Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物のアニオン交換クロマトグラフィ後のクロマトグラムを示す図である。 実施例３Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物の還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後のゲルを示す図である。Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いたＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｇｅｌ（３〜８％）である。ゲルは、Ｐｉｅｒｃｅ ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ染色によって染色した。レーン１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＨｉＭａｒｋ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ。レーン２：ｒＶＷＦ標準。レーン３：共役体。 実施例３Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物の非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後のゲルを示す図である。Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いたＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｇｅｌ（３〜８％）である。ＰＥＧは、塩化バリウム／ヨウ化バリウム染色によって検出された。レーン１：共役体。レーン２：０．００２ｗｔ／ｖ％のＰＥＧ２０Ｋ対照。レーン３：０．００５ｗｔ／ｖ％のＰＥＧ２０Ｋ対照。レーン４：０．０１ｗｔ／ｖ％のＰＥＧ２０Ｋ対照。 それぞれ実施例３Ｂおよび３Ｃに記載の手順に従って調製された共役体組成物のイオン交換クロマトグラフィ後のクロマトグラムを示す図である。 それぞれ実施例３Ｂおよび３Ｃに記載の手順に従って調製された共役体組成物のイオン交換クロマトグラフィ後のクロマトグラムを示す図である。 実施例４Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物のクロマトグラムを示す図である。 ヨウ化バリウム染色法およびクーマシー染色法をそれぞれ使用した、実施例４Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後のゲルを示す図である。 ヨウ化バリウム染色法およびクーマシー染色法をそれぞれ使用した、実施例４Ａに記載の手順に従って調製された共役体組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後のゲルを示す図である。 電気泳動による未変性ｒＶＷＦ１３３Ｐの構造的性質を示す図である。パネルＡ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀染色法。パネルＢ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクーマシー染色法。パネルＣ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体を用いた免疫ブロット。パネルＤ：抗ＶＷＦ抗体で検出した２．５％アガロースゲル電気泳動によって可視化されたＶＷＦ多量体分布。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 タンパク質染色法での還元ＳＤＳＰＡＧＥによって可視化された解離可能なペグ化ｒＶＷＦ共役体のドメイン構造を示す図である。パネルＡ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀染色法。パネルＢ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続くクーマシー染色法。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＶＷＦおよびＰＥＧに対して特異的な還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの免疫ブロットによって可視化された解離可能なペグ化ｒＶＷＦのドメイン構造を示す図である。パネルＡ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体を用いた免疫ブロット。パネルＢ：還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのポリクローナル抗ＰＥＧ抗体を用いた免疫ブロット。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 低分解能アガロースゲル電気泳動によって可視化された解離可能なｒＶＷＦ共役体のＶＷＦ多量体分布を示す図である。パネルＡ：ゲル中の抗ＶＷＦ抗体で検出された多量体分布。パネルＢ：免疫ブロット後に、抗ＰＥＧ抗体で検出されたペグ化ＶＷＦ多量体。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 高分解能アガロースゲル電気泳動によって可視化された解離可能なｒＶＷＦ共役体の微細構造を示す図である。パネルＡ：ゲル中の抗ＶＷＦ抗体で検出されたＶＷＦ多量体構造。パネルＢ：免疫ブロット後に、抗ＰＥＧ抗体で検出されたペグ化ＶＷＦ多量体。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 フロー条件下での非修飾ｒＶＷＦの存在下における解離可能なＰＥＧ−ｒＶＷＦ共役体のＦＶＩＩＩ−結合能力を示す図である。白四角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ短およびｒＦＶＩＩＩ、四角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ長およびｒＦＶＩＩＩ、白三角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ短およびｒＦＶＩＩＩ、三角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ長およびｒＦＶＩＩＩ、白丸：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ短およびｒＦＶＩＩＩ、丸：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ長およびｒＦＶＩＩＩ、星：未変性ｒＶＷＦ（１３３プール１）およびｒＦＶＩＩＩ、十字：ｒｐｒｏＶＷＦ１９８およびｒＦＶＩＩＩ。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＡＤＡＭＴＳ１３消化試料におけるＶＷＦのＶＷＦ、ＣＢ活性の変化を示す図である。白四角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ短、四角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ長、白三角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ短、三角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ ｒｅｌ長、 星：未変性ｒＶＷＦ（１３３Ｐ１）。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＳＤＳ−アガロースゲルによって可視化されたｒＶＷＦにおけるＡＤＡＭＴＳ１３媒介のサテライトバンド形成を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 抗ＰＥＧ免疫ブロットによって実証されるペグ化度の変化の時間経過を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短低（どちらも同時注入ｒＦＶＩＩＩを用いた）の比較を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。データは、ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌまたはＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌマウス血漿で表示される。丸：ペグ化ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）、三角：未変性ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値±標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長低（どちらも同時注入ｒＦＶＩＩＩを用いた）の比較を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。データは、ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌまたはＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌマウス血漿で表示される。丸：ペグ化ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）、三角：未変性ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値±標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短低（どちらも同時注入ｒＦＶＩＩＩを用いた）の比較を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。データは、ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌまたはＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌマウス血漿で表示される。丸：ペグ化ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（１８０ＩＵ／ｋｇ）、三角：未変性ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（１９０ＩＵ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値±標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長低（どちらも同時注入ｒＦＶＩＩＩを用いた）の比較を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。データは、ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌまたはＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌマウス血漿で表示される。丸：ペグ化ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（１９０ＩＵ／ｋｇ）、三角：未変性ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（１９０ＩＵ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値±標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短低（どちらも同時注入ｒＦＶＩＩＩを用いた）の比較を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。データは、ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌまたはＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌマウス血漿で表示される。丸：ペグ化ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）、三角：未変性ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値±標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長低（どちらも同時注入ｒＦＶＩＩＩを用いた）の比較を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。データは、ＩＵ ＶＷＦ：Ａｇ／ｍｌまたはＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌマウス血漿で表示される。丸：ペグ化ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）、三角：未変性ｒＶＷＦ（１．６ｍｇ／ｋｇ）およびｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値±標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ペグ化ｒＶＷＦ候補概略を示す図である。Ａ：ＶＷＦ：Ａｇの経時変化。Ｂ：ＦＶＩＩＩ：活性の経時変化。白四角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短低およびｒＦＶＩＩＩ、四角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長低およびｒＦＶＩＩＩ、白三角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短低およびｒＦＶＩＩＩ、三角：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長低およびｒＦＶＩＩＩ、丸：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短低およびｒＦＶＩＩＩ、丸：ペグ化ｒＶＷＦ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長低およびｒＦＶＩＩＩ、ならびに星：未変性ｒＶＷＦ（１３３プール１）およびｒＦＶＩＩＩこの図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ＶＷＦ：Ａｇに対する用量調節ＡＵＣを示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ペグ化ｒＶＷＦ候補とともに同時注入したＦＶＩＩＩに対するＡＵＣおよび半減期を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 ペグ化ｒＶＷＦ候補とともに同時注入したＦＶＩＩＩに対する平均滞留時間（ＭＲＴ）を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例５に提供する。 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いて、ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体での免疫ブロットによって可視化された未変性ｒＦＶＩＩＩ（ＭＯＱヘペス０１−Ｅ）のドメイン構造を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＸａ生成曲線の定量パラメータを示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 還元ＳＤＳＰＡＧＥと、続いて免疫ブロットによって可視化された解離可能なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体のドメイン構造を示す図である。パネルＡ：ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体での免疫ブロット。パネルＢ：ＰＥＧに対して作られたポリクローナル抗体での免疫ブロット。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いて免疫ブロットによって可視化された解離可能なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体のＨＣおよびＬＣの構造を示す図である。パネルＡ：モノクロナール抗ヒトＦＶＩＩＩ ＨＣ−Ａ２ドメイン抗体での免疫ブロット。パネルＢ：モノクロナール抗ヒトＦＶＩＩＩ ＬＣ−Ａ３ドメイン抗体での免疫ブロット。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 非活性化ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの存在下における第Ｘａ因子（「ＦＸａ」）生成曲線を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 トロンビン活性化ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの存在下におけるＦＸａ生成曲線を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 トロンビンによるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの活性化および不活性化を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ペグ化ＦＶＩＩＩ共役体のＡＰＣ媒介による不活性化を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 トロンビン活性化ペグ化ＦＶＩＩＩ共役体のＡＰＣ媒介による不活性化を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 未変性ｒＦＶＩＩＩの体外添加によるＦＶＩＩＩ欠損血漿のトロンビン生成の向上を示す図である。パネルＡ：ＦＶＩＩＩ欠損血漿にスパイクしたｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅを用いて取得したトロンビン生成曲線、ラインａ：ｒＦＶＩＩＩなし、ラインｂ：０．００２５μｇ ｒＦＶＩＩＩ／ｍｌ、ラインｃ：０．０１μｇ ｒＦＶＩＩＩ／ｍｌ、ラインｄ：０．０２５μｇ ｒＦＶＩＩＩ／ｍｌ、ラインｅ：０．１μｇ ｒＦＶＩＩＩ／ｍｌ。パネルＢ：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅの線形用量反応曲線。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料を用いて取得したトロンビン生成曲線（パネルＡ〜Ｆ）およびピークトロンビン値の用量反応曲線（パネＧ）を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料を用いて取得したトロンビン生成曲線（パネルＡ〜Ｆ）およびピークトロンビン値の用量反応曲線（パネＧ）を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料を用いて取得したトロンビン生成曲線（パネルＡ〜Ｆ）およびピークトロンビン値の用量反応曲線（パネＧ）を示す図である。星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、十字：ＦＶＩＩＩ対照、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、白四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ｐＨ８．１での緩衝液におけるインキュベーション後のＦＶＩＩＩ特異的活性の回復を示す図である。パネルＡ：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ（星）およびＦＶＩＩＩ対照（十字）。パネルＢ：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短（黒丸）および長（白丸）。パネルＣ：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短（黒三角）および長（白三角）。パネルＤ：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短（黒四角）および長（白四角）。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ｐＨ８．１での緩衝液におけるインキュベーション後のＦＶＩＩＩ：Ａｇの回復を示す図である。パネルＡ：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ（星）およびＦＶＩＩＩ対照（十字）。パネルＢ：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短（黒丸）および長（白丸）。パネルＣ：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短（黒三角）および長（白三角）。パネルＤ：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短（黒四角）および長（白四角）。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 抗ＦＶＩＩＩ免疫ブロットによって示される増加したｐＨでのインキュベーション後のＦＶＩＩＩの構造変化を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 抗ＦＶＩＩＩ ＨＣ−Ａ２ドメイン免疫ブロットによって示される増加したｐＨでのインキュベーション後のＦＶＩＩＩの構造変化を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 抗ＰＥＧ免疫ブロットによって示される増加したｐＨでのインキュベーション後のＦＶＩＩＩの構造変化を示す図である。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＋３７℃でのＦＶＩＩＩ欠損血漿におけるインキュベーション後の、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのＦＶＩＩ特異的活性における変化を示す図である。パネルＡ：ＩＵ ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ活性／ｍｇタンパク質として表されるインキュベーション後のＦＶＩＩＩ活性の変化。パネルＢ：血漿の添加直後に測定した初期値に対する％として表される初期値に対する相対ＦＶＩＩＩ特異的活性の変化。記号：黒星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、白丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、黒三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＋３７℃でのＦＶＩＩＩ欠損血漿におけるインキュベーション後の、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ抗原対タンパク質の比率の変化を示す図である。パネルＡ：ＩＵ ＦＶＩＩＩ：Ａｇ／ｍｇタンパク質として表されるインキュベーション後のＦＶＩＩＩ抗原／タンパク質の比率の変化。パネルＢ：血漿の添加直後に測定した初期値に対する％として表される初期値に対する相対的ＦＶＩＩＩ抗原／タンパク質の比率の変化。記号：黒星：未変性ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱヘペス０１−Ｅ、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、白丸、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、黒三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、白三角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短の比較を示す図である。パネルＡ：血漿中の絶対ＦＶＩＩＩ活性レベル、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（３２０ＩＵ／ｋｇ、１６８μｇ／ｋｇ）、黒三角：未変性ｒＦＶＩＩＩ（１７０ＩＵ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値＋／−標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長の比較を示す図である。Ａ：血漿中の絶対ＦＶＩＩＩ活性レベル、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（２１０ＩＵ／ｋｇ、１６４μｇ／ｋｇ）、黒三角：未変性ｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値＋／−標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短の比較を示す図である。パネルＡ：血漿中の絶対ＦＶＩＩＩ活性レベル、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（２３０ＩＵ／ｋｇ、９４μｇ／ｋｇ）、黒三角：未変性ｒＦＶＩＩＩ（２３０ＩＵ／ｋｇ、３２μｇ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値＋／−標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長の比較を示す図である。パネルＡ：血漿中の絶対ＦＶＩＩＩ活性レベル、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（２３０ＩＵ／ｋｇ、９４μｇ／ｋｇ）、黒三角：未変性ｒＦＶＩＩＩ（２３０ＩＵ／ｋｇ、３２μｇ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値＋／−標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短の比較を示す図である。パネルＡ：血漿中の絶対ＦＶＩＩＩ活性レベル、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ、１３３μｇ／ｋｇ）、黒三角：未変性ｒＦＶＩＩＩ（１９０ＩＵ／ｋｇ、３２μｇ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値＋／−標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長の比較を示す図である。パネルＡ：血漿中の絶対ＦＶＩＩＩ活性レベル、黒丸：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（１７０ＩＵ／ｋｇ、６２μｇ／ｋｇ）、黒三角：未変性ｒＦＶＩＩＩ（１９０ＩＵ／ｋｇ、３２μｇ／ｋｇ）。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の平均値＋／−標準偏差を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 ＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける未変性ｒＦＶＩＩＩおよびペグ化ｒＦＶＩＩＩ共役体の比較を示す図である。黒丸：ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短、白丸：ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長、黒三角：ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短、白三角：ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長、黒四角：ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短、白四角：ＰＥＧ ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長、白菱形：未変性ｒＦＶＩＩＩ。記号は、各時点で取得した６つの血漿試料の「正規化％」平均値±標準偏差（ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩに対して）または各時点で取得した２４の血漿試料の平均値±標準偏差（未変性ｒＦＶＩＩＩ）を示す。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対する用量調節ＡＵＣおよび半減期を示す図である。パネルＡ：曲線下面積（用量調節）。記号は、それぞれのＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対する平均値＋／−９５％信頼区間を示す。ｒＦＶＩＩＩ未変性データは、時点当たり２４匹の動物に相当する、施行した全ての対象群の平均＋／−９５％信頼区間である。白四角：未変性ｒＦＶＩＩＩ、黒四角：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。 未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対する平均滞留時間（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ：「ＭＲＴ」）を示す図である。ｒＦＶＩＩＩ対照（白四角、全ての対象群の平均、サンプリング点当たり２４匹の動物）およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補（黒四角）に対する平均滞留時間および範囲。この図に関するさらなる情報は、実施例６に提供する。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定のポリマー、合成法、活性薬剤等に限定されるものではなく、これらは変化し得ることを理解されたい。
本明細書および特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかに別途指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、単数形「ポリマー」(a “polymer”)に言及する場合、単一のポリマー、ならびに同一または異なるポリマーの２つ以上を含み、単数の「共役体」(a “conjugate”)に言及する場合、単一の共役体、ならびに同一または異なる共役体の２つ以上を指し、単数形の「賦形剤」(an “exipient”)に言及する場合、単一の賦形剤、ならびに同一または異なる賦形剤の２つ以上を含む等である。
本発明の説明や請求項においては、以下の用語は、後述の定義に従って用いられる。
本明細書において使用される、「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」、および「ポリ（エチレングリコール）」は、任意の水溶性のポリ（エチレンオキシド）を包含することを企図する。典型的には、本発明に従って使用されるＰＥＧは、次の構造「−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−」を含み、式中、（ｍ）は２から４０００である。本明細書において使用されるＰＥＧは、末端酸素が置き換えられたかどうかにより、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−」および「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−」もまた含む。ＰＥＧがスペーサ部分（以下でより詳細に説明する）をさらに含む場合、スペーサ部分を含む原子は、水溶性ポリマー部分に共有結合的に付着される際、酸素−酸素結合（つまり、「−Ｏ−Ｏ−」または過酸化物連結）の形成をもたらさない。本明細書および特許請求の範囲全体を通じて、「ＰＥＧ」という用語は、様々な末端基または「エンドキャッピング」基等を有する構造を含むことが、念頭に置かれるべきである。「ＰＥＧ」という用語は、過半数、つまり５０％を超える−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−モノマーサブユニットを含むポリマーもまた意味する。具体的な形態について、ＰＥＧは、以下でより詳細に説明する、任意の数の様々な分子量、ならびに「分岐」、「線状」、「Ｖ型」、「多機能」等の構造および幾何学形状をとることができる。
「エンドキャップされた」または「末端キャップされた」という用語は、本明細書において同義で使用され、エンドキャッピング部分を有する、ポリマーの末端またはエンドポイントを指す。典型的には、必ずしもそうではないが、エンドキャッピング部分は、ヒドロキシまたはＣ１−２０アルコキシ基を含む。したがって、エンドキャッピング部分の例には、アルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ、およびベンジルオキシ）、ならびにアリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロ等を含む。加えて、前述のもののそれぞれの、飽和、不飽和、置換、および非置換形態が想定される。さらに、エンドキャッピング基は、シランでもあり得る。エンドキャッピング基は、有利に、検出可能な標識も含み得る。ポリマーが、検出可能な標識を含むエンドキャッピング基を有する場合、ポリマーおよび／またはポリマーがカップリングされる対象部分（例えば活性薬剤）の量および場所を、適切な検出器を使用して決定することができる。そのような標識には、限定しないが、蛍光物質、化学発光物質、酵素標識で使用される部分、比色物質（例えば染料）、金属イオン、放射性部分等が含まれる。適切な検出器には、光度計、フィルム、分光計等を含む。
ポリマーまたは水溶性ポリマーに関して「天然に存在しない」とは、その全体として、天然には見られないポリマーを意味する。しかしながら、天然に存在しないポリマーまたは水溶性ポリマーは、ポリマー構造全体が天然に見られない限り、天然に存在する１つ以上のサブユニットまたはサブユニットの一部分を含み得る。
「水溶性ポリマー」という用語は、室温で水に可溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、ろ過後の同一溶液にて伝送される光の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を伝送する。重量ベースでは、水溶性ポリマーは、好ましくは水に少なくとも約３５（重量）％可溶性であり、より好ましくは水に少なくとも約５０（重量）％可溶性であり、さらに好ましくは水に約７０（重量）％可溶性であり、さらに好ましくは水に約８５（重量）％可溶性である。しかしながら、水溶性ポリマーが、水に約９５（重量）％可溶性であることがさらに好ましく、水溶性ポリマーが水に完全に可溶性であることが最も好ましい。
ＰＥＧ等の本発明の水溶性ポリマーの関連の分子量は、数平均分子量または重量平均分子量のいずれかで表現され得る。別途指示されていない限り、本明細書の分子量に対する全ての言及は、重量平均分子量を指す。数平均および重量平均の両方の分子量の決定は、ゲル透過クロマトグラフィまたは他の液体クロマトグラフィ法を使用して測定することができる。数平均分子量を決定するための、末端基分析または束一性（例えば凝固点降下、沸点上昇、または浸透圧）の測定の使用、または重量平均分子量を決定するための光散乱法、超遠心分離法、もしくは粘度測定法の使用等、分子量値を測定するための他の方法もまた、使用することができる。本発明のポリマーは、典型的には、多分散性（つまり、ポリマーの数平均分子量および重量平均分子量が等しくない）であるが、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらに好ましくは約１．１０未満、またさらに好ましくは約１．０５未満、そして最も好ましくは約１．０３未満の、低い多分散性値を有する。
本明細書において使用される、「カルボン酸」という用語は、
Figure 2010514773
 官能基［「−ＣＯＯＨ」または−Ｃ（Ｏ）ＯＨとしても表される］を有する部分、ならびにカルボン酸の誘導体である部分であり、そのような誘導体には、例えば、保護カルボン酸を含む。したがって、文脈により明らかに別途指示されない限り、カルボン酸という用語は、酸形態だけでなく、対応するエステルおよび保護された形態もまた含む。本明細書で説明するカルボン酸に適した保護基および他の任意の官能基に関して、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ，”ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ” ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９を参照することができる。
「反応性」および「活性」という用語は、特定の官能基と関連して使用される場合、別の分子上の求電子試薬または求核試薬と容易に反応する、反応性官能基を指す。これは、反応するために、強力な触媒または非常に非実用的な反応条件を必要とする基（つまり、「非反応性」または「不活性」基）とは対照的である。
「保護された」、「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」、および「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ）」という用語は、特定の反応条件下の分子における、特定の化学反応性官能基の反応を防止または阻止する部分（つまり、保護基）の存在を指す。保護基は、保護される化学反応性官能基の種類、ならびに用いられる反応条件および、存在する場合、該分子中のさらなる反応基または保護基の存在により異なる。当技術分野において既知の保護基は、上記Ｇｒｅｅｎｅらに見出される。
本明細書において使用される、「官能基」という用語またはそのいずれもの同義語は、その保護された形態を包含することが企図される。
「スペーサ」または「スペーサ部分」という用語は、１つの部分と別の部分の間で任意に現れる原子または原子の集合を指すために、本明細書において使用される。スペーサ部分は、加水分解に安定であり得、または１つ以上の生理学的に加水分解可能、または酵素的に解離可能な連結を含み得る。
本明細書において使用される「有機ラジカル」には、例えば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、および置換アリールを含む。
「アルキル」は、典型的には、約１から２０個の範囲の原子の長さの、炭化水素鎖を指す。そのような炭化水素鎖は、必ずしもそうではないが、好ましくは飽和されていて、典型的には直鎖が好ましいが、分枝または直鎖状であり得る。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、３−メチルペンチル等を含む。本明細書において使用される「アルキル」は、３個以上の炭素原子が言及される場合シクロアルキル、および低級アルキルを含む。
「低級アルキル」は、１から６個の炭素原子を含むアルキル基を指し、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルに例をみるように、直鎖状または分枝状であり得る。
「シクロアルキル」は、好ましくは３から約１２個の炭素原子、より好ましくは３から約８個の炭素原子から成る、架橋された、縮合された、またはスピロ型の環状化合物を含む、飽和または不飽和の環状炭化水素鎖を指す。
「非干渉置換基」は、分子中に存在する場合、典型的には、該分子内に含有される他の官能基と非反応性である基である。
例えば「置換アルキル」の中の「置換」という用語は、限定するわけではないが、１個以上の水素原子について、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、（例えばシクロプロピル、シクロブチル等）、ハロ（例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード等）、シアノ、アルコキシ、低級フェニル、置換フェニル等の、１つ以上の非干渉置換基で置換される部分（例えば、アルキル基）を指す。「置換アリール」は、置換基として１つ以上の非干渉基を有するアリールである。フェニル環上での置換については、置換基は、任意の配向（つまり、オルト、メタ、またはパラ）であり得る。「置換アンモニウム」は、置換基として１つ以上の非干渉基（例えば、有機ラジカル）を有するアンモニウムである。
「アルコキシ」は、−Ｏ−Ｒ基を指し、式中、Ｒは、アルキルまたは置換アルキル、好ましくはＣ１−Ｃ２０アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ベンジル等）、より好ましくはＣ１−Ｃ７アルキルである。
本明細書において使用される「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含む、２から１５個の原子の長さの、分岐または非分枝状の炭化水素基を指す。例示的なアルケニルには、（限定しないが）、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、ｉｓｏ−イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル等を含む。
本明細書において使用される、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの三重結合を含む、２から１５個の原子の長さの、分岐または非分枝状の炭化水素基を指す。例示的なアルキニルには、（限定しないが）、エチニル、ｎ−ブチニル、ｉｓｏ−ペンチニル、オクチニル、デシニル等を含む。
「アリール」は、それぞれ５個または６個の核炭素原子を持つ、１つ以上の芳香族環を意味する。アリールは、ナフチルのように縮合されるか、またはビフェニルのように縮合されない、複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール、または複素環で縮合されるか、または縮合されない場合もある。本明細書において使用される「アリール」は、ヘテロアリールを含む。芳香族含有部分（例えば、Ａｒ１、Ａｒ２等）は、アリールを含有する構造を意味する。
「ヘテロアリール」は、１から４個のヘテロ原子、好ましくはＮ、Ｏ、もしくはＳ、またはそれらの組み合わせを含有する、アリール基である。ヘテロアリール環は、１つ以上の、環状炭化水素、ヘテロ環、アリールまたはヘテロアリール環と縮合され得る。
「ヘテロ環」または「ヘテロ環式」は、不飽和または芳香族性である、またはそうではない、かつ炭素ではない少なくとも１個の環原子を有する、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子の１つ以上の環を意味する。好ましいヘテロ原子には、硫黄、酸素、および窒素を含む。
「置換ヘテロアリール」は、置換基として１つ以上の非干渉基を有する、ヘテロアリールである。
「置換ヘテロ環」は、非干渉置換基から形成される１つ以上の側鎖を有する、ヘテロ環である。
「求電子試薬」は、イオン性で、求電子中心、つまり、求電子性の、求核試薬と反応することのできる中心を有する、イオンもしくは原子、または原子の集合を指す。
「求核試薬」は、イオン性で、求核中心、つまり求電子中心を求める、または求電子試薬を持つ、中心を有する、イオンもしくは原子、または原子の集合を指す。
「生理学的に切断可能な」ならびに「加水分解可能な」結合は、生理学的条件下で水と反応する（つまり、加水分解される）比較的弱い結合である。水の中で結合が加水分解する傾向は、２つの中心原子を接続する一般的な種類の連結のみではなく、これらの中心原子に付着される置換基にも依存する。例示的な加水分解可能な結合には、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、およびオルトエステルを含むが、それらに限定されない。
「解離可能な連結」は、生理学的に切断可能な結合、加水分解可能な結合、および酵素的に分解可能な連結を含むが、それらに限定されない。したがって、「解離可能な連結」は、生理学的条件下で、何らかの他の機構（例えば、酵素触媒、酸触媒、塩基触媒等）により、加水分解または切断のいずれかを受け得る連結である。例えば、「解離可能な連結」は、原動力として、プロトン（例えば、イオン化水素原子、Ｈα）の塩基引き抜きを有する脱離反応を伴い得る。本明細書の目的上、「解離可能な連結」は、「分解可能な連結」と同義である。
「酵素的に解離可能な連結」は、１つ以上の酵素による分解を受ける、連結を意味する。
「加水分解的に安定した」連結または結合は、化学結合、典型的には、水中で実質的に安定している、つまり、長期間にわたり、生理学的条件下で、いずれの感知できる程度の加水分解も受けない、共有結合を指す。加水分解的に安定した連結の例には、次の、炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖内の）、エーテル、アミド等を含むが、それらに限定されない。概して、加水分解的に安定した連結とは、生理学的条件下で、１日当たり約１〜２％未満の加水分解速度を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、ほとんどの標準的な化学の教科書に記載されている。一部の連結は、（例えば）隣接および周辺の原子ならびに周囲条件に依存して、加水分解的に安定、または加水分解可能であり得ることが、指摘されねばならない。当業者であれば、例えば、対象の連結を含有する分子を対象の条件下に置き、加水分解の証拠（例えば、単一分子の切断から生じる２つの分子の存在および量）を試験することにより、所与の文脈において、所与の連結または結合が加水分解的に安定、または加水分解可能であるかを決定することができる。所与の連結または結合が加水分解的に安定、または加水分解可能であるかどうかを決定するために、当業者に既知である他の手法もまた使用することができる。
「活性薬剤」、「生物活性薬剤」、および「薬理学的活性薬剤」という用語は、本明細書において同義で使用され、体内または体外で実証され得る、なんらかの薬理学的な、しばしば有益である効果を提供する、物質または混合物の任意の薬剤、薬物、化合物、組成物を含むと定義される。これには、食物補足剤、栄養素、栄養補給食品、薬物、タンパク質、ワクチン、抗体、ビタミン、および他の有益な薬剤が含まれる。本明細書において使用されるこれらの用語は、さらに、患者に全身的または局所的な効果を産生する全ての生理学的あるいは薬理学的活性物質を含む。
「医薬的に許容される賦形剤」または「医薬的に許容される担体」は、本発明の組成物に含むことができ、患者に有意な毒性の副作用を及ぼさない賦形剤を意味する。
「薬理学的有効量」、「生理学的有効量」、および「治療的有効量」は、本明細書において同義で使用され、血流または標的組織内において、所望のレベルの活性薬剤および／または共役体を提供するために必要とされる、（典型的には、医薬調製物中に存在する）ポリマーと活性薬剤の共役体の量を意味する。正確な量は、多数の因子、例えば、特定の活性薬剤、医薬調製物の成分および物理的特性、対象とする患者集団、患者に対する考慮等に依存し、本明細書で提供される、および該当する文献で入手可能な情報に基づき、当業者により容易に決定され得る。
ポリマーの文脈における「多官能性」は、そこに含有される３つ以上の官能基を有するポリマーを意味し、官能基は、同一または異なる場合もある。多官能性ポリマーは、典型的には、約３〜１００の官能基、または３〜５０の官能基、または３〜２５の官能基、または３〜１５の官能基、または３から１０の官能基を含有するか、またはポリマー内に３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の官能基を含有する。「二官能性」ポリマーは、同一（つまり、ホモ二官能性）または異なる（つまり、ヘテロ二官能性）のいずれかの、そこに含有される２つの官能基を有するポリマーを意味する。
ポリマーの幾何学的形状または全体の構造に関する「分岐」は、２つ以上のポリマー「アーム」を有するポリマーを指す。分岐したポリマーは、２つのポリマーアーム、３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、８つのポリマーアーム、またはそれ以上を有する。高度に分岐したポリマーの１つの具体的な種類は、樹状ポリマーまたはデンドリマーであり、これは本発明の目的において、分岐ポリマーとは明らかに異なる構造を有すると見なされる。
「デンドリマー」または樹状ポリマーは、球形の単分散ポリマーであり、そこですべての結合は、中心の焦点またはコアから放射状に出て、規則的な分岐パターンとそれぞれが分岐点に寄与する繰り返し単位を有する。デンドリマーは、コアのカプセル化等のいくつかの樹状性を示し、それにより、これらは他の種類のポリマーとは異なる。
本明細書で述べる塩基性または酸性の反応物質は、それらの、中性の、荷電された、あるいはすべての相当する塩類を含む。
「患者」という用語は、本明細書で提供される共役体の投与により予防あるいは治療され得る状態に罹患しているか、またはそのような状態に罹りやすい生体を指し、ヒトおよび動物の両方を含む。
本明細書において使用される「薬物放出速度」は、ある系におけるポリマーと活性薬剤の共役体の総量の半分が、活性薬剤およびポリマー残基に開裂する速度（半減期として表される）を意味する。
「任意の」および「任意に」は、その語の後に説明される状況が起こるかもしれないか、あるいは起こらないかもしれないことを意味し、そのため、その説明にはその状況が起こる場合の例および起こらない場合の例を含む。
本明細書において使用される、「ハロ」識別子（例えばフルオロ、クロロ、ヨード、ブロモ等）は、概して、ハロゲンが分子に付着される場合に使用され、接尾辞「化物」（例えばフッ化物、塩化物、ヨウ化物、臭化物等）は、ハロゲンが独立したイオン形態で存在する場合に使用される（例えば、離脱基が分子を離脱する場合等）。
本考察の文脈において、一構造または式に関して提供される変数の定義は、文脈により別途指示されない限り、異なる構造において繰り返される同一の変数に適用可能であることを認識されたい。
既に述べたように、本発明は、（とりわけ）解離可能な連結を有する共役体を含む。
本発明の例示的な共役体を説明する前に、カルバミン酸連結等の、活性薬剤のアミノ基と反応して解離可能な連結を形成することができる、水溶性ポリマーおよび官能基の実施形態を考察する。
所与の水溶性ポリマーに関して、それぞれの水溶性ポリマー（例えばＰＯＬＹ、ＰＯＬＹ１、およびＰＯＬＹ２）は、ポリマーが水溶性かつ非ペプチド性である限り、任意のポリマーを含み得る。本明細書における使用のための水溶性ポリマーは、好ましくはポリ（エチレングリコール）であるが、例えば、他のポリ（アルキレングリコール）［「ポリ（アルキレンオキシド）」とも称される］等、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）等、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のコポリマー、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、米国特許第５，６２９，３８４号で説明されるもの等の、他の水溶性ポリマーであり得る。水溶性ポリマーは、前述のもののうちのいずれの、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマー、非ランダムブロックポリマー、およびランダムブロックポリマーでもあり得る。さらに、水溶性ポリマーは線状であり得るが、以下にさらに詳細に説明するように、他の形態（例えば、分岐、Ｖ型等）であり得る。全体の構造内に存在するという関連で、水溶性ポリマーは１から約３００の末端を有する。
ポリマー試薬が２つ以上の水溶性ポリマーを含有する例において、構造全体中のそれぞれの水溶性ポリマーは、同一または異なり得る。しかしながら、構造全体中の全ての水溶性ポリマーは、同一種類のものであることが好ましい。例えば、所与の構造中の全ての水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）ポリマーであることが好ましい。
任意の個別の水溶性ポリマーの重量平均分子量は異なり得るが、任意の所与の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、典型的には、１００ダルトンから約１５０，０００ダルトンの範囲である。しかしながら、例示的な範囲は、約８８０ダルトンから約５，０００ダルトンの範囲、５，０００ダルトン超過から約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトンから約９０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトンから約８５，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトン超過から約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトンから約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトンから約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトンから約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトンから約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトンから約１２０，０００ダルトンの範囲、約８８０ダルトンから約６０，０００ダルトンの範囲、約４４０ダルトンから約４０，０００ダルトンの範囲、約４４０ダルトンから約３０，０００ダルトンの範囲、ならびに約４０，０００ダルトンから約１２０，０００ダルトンの範囲の、重量平均分子量を含む。任意の所与の水溶性ポリマーについて、これらの１つ以上の範囲のうちの分子量を有するＰＥＧが好ましい。
水溶性ポリマーについての例示的な重量平均分子量には、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約４４０ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約１６，０００ダルトン、約１７，０００ダルトン、約１８，０００ダルトン、約１９，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、および約７５，０００ダルトンを含む。前述のもののうちのいずれかの総重量平均分子量を有する、水溶性ポリマーの分岐型（例えば、２つの２０，０００ダルトンポリマーを含む分岐４０，０００ダルトン水溶性ポリマー）も使用することができる。
該共役体を調製するために使用されるポリマー試薬は、それから形成される共役体の所望の放出速度に適した範囲の全体サイズを有する少なくとも１つの水溶性ポリマーを含む。例えば、比較的遅い放出速度を有する共役体は、（ａ）共役体からの活性薬剤の放出前の持続的循環、および（ｂ）共役体からの放出時に共役体から遊離される種の、適度に迅速な体内クリアランスに適したサイズを有するポリマー試薬から調製することができる。同様に、共役体が比較的早い放出速度を有する場合、ポリマー試薬は、典型的には低分子量を有するであろう。
ポリマー試薬に水溶性ポリマーとしてＰＥＧが使用される場合、ＰＥＧは、典型的には、多数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）モノマーを含む［またはＰＥＧがどう定義されるかにより（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）モノマー］。本説明全体において使用される、繰り返し単位の数は、「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」の中の下付き文字「ｎ」により特定される。したがって、（ｎ）の値は、典型的には、以下の範囲、すなわち、２から約３４００、約４から約１５００、約１００から約２３００、約１００から約２２７０、約１３６から約２０５０、約２２５から約１９３０、約４５０から約１９３０、約１２００から約１９３０、約５６８から約２７２７、約６６０から約２７３０、約７９５から約２７３０、約７９５から約２７３０、約９０９から約２７３０、および約１，２００から約１，９００のうちの１つ以上に含まれる。分子量が既知である任意の所与のポリマーについて、ポリマーの総重量平均分子量を、繰り返しモノマーの分子量で割ることにより、繰り返し単位の数（つまり、「ｎ」）を決定することが可能である。
各水溶性ポリマーは、典型的には生体適合性かつ非免疫原性である。生体適合性に関して、物質は、生体組織に関して、該物質の単独使用または別の物質（例えば活性薬剤）との併用（例えば患者への投与）に関連する、臨床医、例えば内科医により評価される有益な効果が、任意の悪影響を上回る場合、生体適合性があるとみなされる。非免疫原性に関して、物質は、生体組織に関して、該物質の単独使用または別の物質との併用により、免疫応答（例えば抗体の形成）が産生されない場合、または免疫応答が産生される場合で、そのような応答が臨床医による評価として臨床的に有意または重要であるとみなされない場合、非免疫原性であるとみなされる。本明細書で説明される水溶性ポリマー、ならびに活性薬剤およびポリマーの共役体は、生体適合性かつ非免疫原性であることが特に好ましい。
有用な一形態において、遊離または非結合ＰＥＧは、各端部がヒドロキシル基で終結する線状ポリマーである。
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ´−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
式中、（ｍ´）は、典型的にはゼロから約４，０００、好ましくは約２０から約１，０００の範囲である。
上記ポリマー、アルファ−、オメガ−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、−ＰＥＧ−記号が以下の構造単位を表すことができると理解される、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして簡単に表すことができ、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−
式中、（ｍ´）は上記で定義される通りである。
本発明において有用である、別の種類の遊離または非結合ＰＥＧは、一末端が比較的不活性であるメトキシ基であり、もう一方の末端がヒドロキシル基である、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ、または簡単にｍＰＥＧである。ｍＰＥＧの構造を以下に記す。
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ’−ＣＨ２ＣＨ２−
式中、（ｍ´）は上述の通りである。
米国特許第５，９３２，４６２号で説明されるもの等の、マルチアームまたは分岐ＰＥＧ分子もまた、ＰＥＧポリマーとして使用することができる。
例えば、ＰＥＧは、構造
Figure 2010514773
 を有することができ、式中、
ｐｏｌｙａおよびｐｏｌｙｂは、（同一または異なる）メトキシポリ（エチレングリコール）等のＰＥＧ骨格であり、
Ｒ”は、Ｈ、メチル、またはＰＥＧ骨格等の非反応部分であり、
ＰおよびＱは、非反応連結である。好ましい実施形態において、分岐ＰＥＧポリマーは、メトキシポリ（エチレングリコール）２置換リジンである。
さらに、ＰＥＧは、Ｖ型ＰＥＧを含み得る。遊離または非結合Ｖ型ＰＥＧの一例は、以下の式により表され、
Figure 2010514773
 式中、Ｘは、スペーサ部分であり、それぞれのＺは、定義された長さの原子鎖によりＣＨに連結される、活性末端基である。Ｚ官能基を分岐する炭素原子に連結する原子鎖は、テザー基としての役目を果たし、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖、およびそれらの組み合わせを含み得る。米国特許第６，３６２，２５４号は、本発明で使用することのできる、様々なＶ型ＰＥＧ構造を開示している。
ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ鎖の端部にではなく、むしろＰＥＧの長さに沿って共有結合的に付着されるカルボキシル等の反応基を有する、ペンダントＰＥＧ分子を含み得る。ペンダント反応基は、直接、またはアルキレン基等のスペーサ部分を介して、ＰＥＧに付着することができる。
上述の形態のＰＥＧに加えて、ポリマー試薬中のそれぞれの水溶性ポリマーは、上述のポリマーのうちのいずれかを含む、ポリマー中の１つ以上の弱いまたは解離可能な連結でも調製することができる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受ける、ポリマー中のエステル連結で調製することができる。以下に示すように、この加水分解により、より低い分子量の断片へのポリマーの切断が生じる：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→−ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−。
ポリマー骨格内での解離可能な連結として有用である、他の加水分解で解離可能な連結には、炭酸塩連結、例えば、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン連結（例えばＯｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８（１）：５８２−３を参照、例えばアルコールをリン酸基と反応させることにより形成される、リン酸エステル連結、典型的にはヒドラジドとアルデヒドとの反応により形成される、ヒドラゾン連結、典型的にはアルデヒドとアルコールとの間の反応により形成される、アセタール連結、例えばギ酸塩とアルコールとの間の反応により形成される、オルトエステル連結、例えばＰＥＧ等のポリマーの端部のアミン基および別のＰＥＧ鎖のカルボキシル基により形成される、アミド連結、例えば末端イソシアネート基を有するＰＥＧとＰＥＧアルコールとの反応により形成される、ウレタン結合、例えばＰＥＧ等のポリマーの端部のアミン基およびペプチドのカルボキシル基により形成される、ペプチド連結、ならびに例として、例えばポリマーの端部のホスホルアミダイト基およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基により形成される、オリゴヌクレオチド連結を含む。
ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語は、ＰＥＧの上記全ての形態を表す、または含むことが、当業者には理解される。
当業者は、実質的に水溶性のポリマーに関する前述の考察が決して包括的なものではなく、例証的なものであるに過ぎず、上述の品質を有するいかなるポリマー材料も企図されることを認識する。本明細書において使用される、「水溶性ポリマー」という用語は、別の部分に付着された水溶性ポリマーの分子および残基の両方を指す。水溶性ポリマーの以下の説明は、ポリマー試薬のみではなく、説明されるポリマー試薬を使用して形成される、対応する共役体にも適用可能である。
本明細書で説明される共役体を形成するために使用される、ポリマー試薬の官能基は、活性薬剤のアミノ基と反応して、カルバミン酸連結等の解離可能な連結を形成することのできる官能基である。本発明は、官能基が、活性薬剤のアミノ基と反応して、カルバミン酸連結等の解離可能な連結を形成することが可能である限り、特定の官能基に対して限定されない。活性薬剤のアミノ基と反応することのできる例示的な官能基には、Ｎ−スクシンイミジル、１−ベンゾトリアゾリル、イミダゾール、炭酸ハロゲン化物（炭酸塩化物および炭酸臭化物等）、フェノラート類（ｐ−ニトロフェノラート等）等の活性炭酸塩から成る群から選択される官能基を含む。また、特別な例として、活性薬剤が、イソシアネートまたはイソチオシアネート基に変換された活性アミン基と共に利用可能である場合、ポリマー試薬の官能基は、これらの成分の反応は、解離可能なカルバミン酸連結をもたらすため、ヒドロキシルであることが可能である。
ここで、例示的なポリマー試薬をさらに詳細に考察する。立体化学はいずれの式または構造（ポリマー試薬、共役体、またはいずれの他の式または構造であろうとも）においても、具体的には示されていないが、提供される式または構造は、両方の光学異性体、ならびに等量（つまり、ラセミ混合物）および不等量のそれぞれの光学異性体の混合物を含有する組成物を企図することが、念頭に置かれねばならない。
例示的なポリマー試薬は、次の式を有し、
Figure 2010514773
 式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり、
Ｘ１は、第１のスペーサ部分であり、
Ｘ２は、第２のスペーサ部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
（ａ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
（ｂ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
Ｒｅｌは、存在する場合、第１の電子変化基であり、
Ｒｅ２は、存在する場合、第２の電子変化基であり、
（ＦＧ）は、活性薬剤のアミノ基と反応して、カルバミン酸連結等の解離可能な連結を形成することのできる官能基である。
例示的なポリマー試薬は、以下の式に含まれ、
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 式中、各場合において、（ＦＧ）は、活性薬剤のアミノ基と反応して、カルバミン酸連結等の解離可能な連結を形成することのできる官能基であり、Ｒ１は、Ｈまたは有機ラジカルであり、Ｒ２は、Ｈまたは有機ラジカルである。
さらに他の例示的なポリマー試薬は、構造
Figure 2010514773
 を有し、式中、ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈα、および（ＦＧ）のそれぞれは、既に定義した通りであり、Ｒｅｌは、第１の電子変化基であり、Ｒｅ２は、第２の電子変化基である。
さらに他の例示的なポリマー試薬は、以下の構造に含まれ、
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 式中、各構造に対して、および各場合において、（ｎ）は、独立して４から１５００の整数である。
ポリマー試薬は、任意の数の様式で、調製することができる。そのため、ポリマー試薬の合成は、それらの調製で使用される特定の技術または手法に限定されない。
本明細書で説明される共役体の調製に有用である、ポリマー試薬を調製するための一方法において、該方法は、（ａ）第１の付着部位、第２の付着部位、および任意の第３の付着部位を持つ芳香族含有部分を提供するステップと、（ｂ）官能基試薬を第１の付着部位と反応させて、活性薬剤のアミノ基と反応することのできる官能基を持つ第１の付着部位を生じさせ、カルバミン酸等の解離可能な連結を生じさせるステップと、（ｃ）反応性基を持つ水溶性ポリマーを、第２の付着部位、および存在する場合、任意の第３の付着部位と反応させ、（ｉ）スペーサ部分を介して水溶性ポリマーを持つ第２の付着部位と、（ｉｉ）存在する場合、スペーサ部分を介して第２の水溶性ポリマーを持つ任意の第３の付着部位を生じさせるステップと、を含む。一部の例において、（ｂ）はステップ（ｃ）の前に行われるが、他の場合においては（ｃ）がステップ（ｂ）の前に行われる。
したがって、ポリマー試薬を調製するための本方法において、必要とされるステップは、（ａ）第１の付着部位、第２の付着部位、および任意の第３の付着部位を持つ芳香族含有部分を提供するステップである。合成的調整に関連して、材料を「提供するステップ」は、（例えば、合成または商業的に取得することにより）、材料を取得することを意味すると理解される。例示的な芳香族含有部分は、例示目的として、以下に示す９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンである。
Figure 2010514773
 この芳香族含有部分である９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンは、３つの付着部位、９位にヒドロキシル基ならびに２および７位のそれぞれにアミノ基、を有する芳香族含有部分の一例である。芳香族含有部分は、塩基または塩形態で提供することができる。９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンについて、二塩酸塩形態を使用することが可能である。他の芳香族含有部分は、合成的調整を介して、および／または商業的に供給業者から購入することにより、提供することができる。
芳香族含有部分を提供した後、本方法における別のステップは、反応性基を持つ水溶性ポリマーを、芳香族含有部分上の付着部位と反応させるステップを広範に含む。ここで、水溶性ポリマーを芳香族含有部分上の１つ以上の付着部位に付着するための、当技術分野において既知である任意の手法を使用することができ、該方法は、特定の手法には限定されない。例えば、アミン反応性ＰＥＧ（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ２ＣＯＯＨと、凝縮剤として、および任意で塩基の存在下、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）との反応から形成される、Ｎ−スクシンイミジルエステル終端ｍＰＥＧ等）を、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレン等の、アミンを持つ芳香族含有部分と反応させることができる。
一部の例において、反応性基を持つ水溶性ポリマーと、芳香族含有部分との反応により、そこに付着される水溶性ポリマーを有する、全ての可能性のある付着部位が生じる。そのような状況では、付着部位が官能基試薬との反応に利用されるように、少なくとも１つの水溶性ポリマーを除去する必要がある。したがって、例えば、前段落で考察されたＮ−スクシンイミジルエステル終端ｍＰＥＧの、９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンとの反応により、（ａ）２つのアミン部位のそれぞれに１つずつの、２つの水溶性ポリマーを持つ種、および（ｂ）２つのアミン部位のそれぞれに１つずつ、およびヒドロキシル部位に１つの、３つの水溶性ポリマーを持つ種を含有する混合物が生じる。ここで、サイズ排除クロマトグラフィにより、より高分子量の種を除去および収集することが可能である。さらに、混合物を高ｐＨに処理［例えば、混合物を水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）に処理する］し、その後、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を行うことが可能である。いずれの場合も、結果、２つのアミン部位のそれぞれに１つずつの、２つの水溶性ポリマーを持つ９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンを主に含有する組成物が得られる。これにより、第３のヒドロキシル部位が、官能基試薬との反応に使用可能となる。
最終ステップは、芳香族含有部分の反応部位を、官能基試薬と反応させるステップである。好ましい手法は、２つのアミン部位のそれぞれに１つずつの、２つの水溶性ポリマーを持つヒドロキシル含有の９−ヒドロキシメチル−２，７−ジアミノフルオレンを、トリホスゲンと反応させ、その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで処置することである。このようにして、活性薬剤のアミノ基と反応して、カルバミン酸連結等の解離可能な連結を形成することのできる官能基（この場合、「活性炭酸塩」）が、ヒドロキシル含有の反応部位上に形成される。
どのような手法が使用されても、合成方法のステップは、適切な溶媒中で行われる。当業者であれば、いずれかの特定の溶媒が、いずれかの所与の反応に適切であるかどうかを判定することができる。しかしながら、典型的には、溶媒は、非極性溶媒または極性非プロトン性溶媒であることが好ましい。非極性溶媒の非限定例には、ベンゼン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ｔ−ブチルアルコール、およびトルエンを含む。特に好ましい非極性溶媒には、トルエン、キシレン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、およびｔ−ブチルアルコールを含む。例示的な極性非プロトン性溶媒には、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＨＭＰＡ（ヘキサメチルホスホルアミド）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリジノン）を含むが、それらに限定されない。
調製されると、ポリマー試薬は単離することができる。既知の方法を使用してポリマー試薬を単離することができるが、クロマトグラフィ、例えばサイズ排除クロマトグラフィを使用することが特に好ましい。交互に、または加えて、本方法は、ポリマー試薬が形成されると、それを精製するステップを含む。ここでも、当技術分野において既知である、標準的な精製方法を使用して、ポリマー試薬を精製することができる。
ポリマー試薬は水分および酸素に敏感であり、アルゴン下または窒素下等の不活性雰囲気下、かつ低温で保存されることが理想的である。このようにして、例えば大気中の酸素に関連する、潜在的に分解性の過程が削減、または完全に回避される。一部の例において、酸化分解反応を回避するために、ブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）等の酸化防止剤を、保存前にポリマー試薬に添加することが可能である。さらに、保存条件に関連する水分量を最小限に抑え、水と関連する潜在的に有害な反応、例えば活性エステルの加水分解を軽減することが好ましい。さらに、光に関与する特定の分解過程を防止するめに、保存条件を暗状態に維持することが好ましい。したがって、好ましい保存条件には、以下のうちの１つ以上が含まれる。乾燥アルゴンまたは別の乾燥不活性ガス下での保存、約−１５℃より低い温度での保存、明かりのない状態での保存、および適切な量（例えば約５０から約５００（百万分の一））の、ＢＨＴ等の酸化防止剤を用いた保存。
上述のポリマー試薬は、生物活性薬剤への共役に有用である。例えば、活性薬剤上のアミノ基（例えば１級アミン）は、活性薬剤のアミノ基と反応して、カルバミン酸連結等の解離可能な連結を形成することのできる官能基と反応する。
例示的な共役体には、以下の式のものを含み、
Figure 2010514773
 式中、
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり、
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり、
Ｘ１は、第１のスペーサ部分であり、
Ｘ２は、第２のスペーサ部分であり、
Ｈαは、イオン化水素原子であり、
Ｒ１は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
Ｒ２は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
（ａ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
（ｂ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
Ｒｅｌは、存在する場合、第１の電子変化基であり、
Ｒｅ２は、存在する場合、第２の電子変化基であり、
Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
（ｖＷＦ／Ｆ８）は、フォンウィルブランド因子部分および因子ＶＩＩＩ部分から成る群から選択されるアミン含有の生物活性薬剤の残基である。
例示的な共役体は、以下の構造を有し、
Figure 2010514773
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 式中、各構造に対して、および各場合において、（ｎ）は、独立して４から１５００の整数であり、（ｖＷＦ／Ｆ８）は、フォンウィルブランド因子部分および因子ＶＩＩＩ部分から成る群から選択される生物活性薬剤の残基である。
本明細書で説明されるポリマー試薬が共役することができる生物活性薬剤は、アミン含有の生物活性薬剤である。典型的には、生物活性薬剤は、約３，５００ダルトンを超える分子量を有するポリペプチド等の巨大分子になる。薬理学的に活性なポリペプチドが、生物活性薬剤の好ましい種類に相当する。本考察の目的上、「ポリペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびタンパク質の総称であることを理解されたい。ポリペプチドに関して、ポリマー試薬が連結するアミンは、ポリペプチド内のアミノ酸（リジン等）の、Ｎ−末端またはアミン含有の側鎖上にあり得る。
本発明は、共役体の調製方法であって、ポリマーと生物活性薬剤との間の共有結合的付着を形成するのに適した条件下で、ポリマー試薬を生物活性薬剤に接触させるステップを含む、方法も提供する。典型的には、該ポリマーは、等モル量（反応性基との反応に適した所望の数の基に対して）、またはモル過剰で、活性薬剤または表面に添加される。例えば、ポリマー試薬は、標的活性薬剤に、約１：１（ポリマー試薬：活性薬剤）、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１、または１０：１のモル比で添加することができる。共役反応は、実質的にさらなる共役が起きなくなるまで進行させ、これは、概して反応の進行を経時的に監視することにより決定することができる。反応の進行は、様々な時点で反応混合物からアリコートを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル法または他の適した分析法で反応混合物を分析することにより監視することができる。形成される共役体の量または残存する非共役ポリマーの量に関してプラトーに達すると、反応が完了したと見なされる。典型的には、共役反応は、数分から数時間（例えば、５分から２４時間以上）の間のどの時点かで起きる。結果として生じる産物混合物は、精製されて、余分な試薬、非共役反応物（例えば活性薬剤）、所望でない多重共役種、および遊離または未反応ポリマーを分離することが好ましいが、必ずしも必要ではない。次に、結果として生じる結合体は、ＭＡＬＤＩ、毛細管電気泳動、ゲル電気泳動、および／またはクロマトグラフィ等の分析法を使用して、さらに特徴付けることができる。
共役体の付着の程度（つまり、共役体の組成物に関連して、しばしば平均数で表現される、タンパク質に付着されるポリマー試薬の数）を特徴付けることが可能である。タンパク質共役体上の水溶性ポリマー分子の平均数を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ、ＩＥＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ等の分析法を使用することができる。水溶性ポリマーの付着後の、ＴＮＢＳＡを使用したタンパク質上の残りの１級アミンの分光光度検出により、付着の程度の定性的および定量的評価がもたらされた。フォンウィルブランド因子−水溶性ポリマー共役体に関して、付着の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて低、中、高度と定性的に説明された。還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解離可能なフォンウィルブランド因子−水溶性ポリマー共役体の付着程度を分析する場合、試料の処置および電気泳動中の水溶性ポリマーの解離が、全体的なペグ化の正確な程度の過小評価につながる場合がある。
ＰＥＧベースのポリマー付着の程度を決定するための１つの手法は、ＮａｇおよびＢａｒｋｅｒの研究の修正である。Ｎａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：２２４−２３１、およびＢａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９０：３８２−３８５を参照されたい。該方法は、ＰＥＧの存在下、水相からクロロホルム相への、発色団の分割、アンモニウムフェロチオシアネートの原理に基づく（発色団自体はＰＥＧの存在なしにクロロホルム相に抽出することができないため）。プロナーゼによるフォンウィルブランド因子の消化が、ＰＥＧを共役体から遊離させ、その後、ＰＥＧの量がアンモニウムフェロチオシアネート法により決定される。この原理を使用して、クロロホルム抽出の必要性を回避する逆相ＨＰＬＣ法を、本明細書で説明される共役体の付着程度を決定するために発展させた。
ポリマー−活性薬剤共役体に関して、共役体を精製して、異なる共役種を取得／または単離することができる。代替として、および低分子量（例えば約２０キロダルトン未満、より好ましくは約１０キロダルトン未満）のポリマーに対してより好ましくは、産物混合物を精製して、活性薬剤当たりの水溶性ポリマーセグメントの分布を取得することができる。例えば、生成物の混合物を精製して、活性薬剤につき１つから５つの間の任意の平均のＰＥＧ（例えばポリペプチド）を取得することができる。最終共役反応混合物の精製のための戦略は、例えば、用いられるポリマーの分子量、特定の活性薬剤、所望の投与計画、ならびに個々の共役体の残効性および体内特性を含む、多くの因子に依存する。
所望であれば、異なる分子量を有する共役体は、ゲルろ過クロマトグラフィを使用して単離することができる。つまり、ゲルろ過クロマトグラフィを使用して、それらの異なる分子量（差異は、本質的に、水溶性ポリマーセグメントの平均分子量に相当する）に基づき、異なる数のポリマー対活性薬剤比（例えば１量体、２量体、３量体等であって、「１量体」は、活性薬剤に対して１つのポリマーを示し、「２量体」は、活性薬剤に対して２つのポリマーを示す等）を分別する。例えば、１００ｋＤａのタンパク質が約２０ｋＤａの分子量を有するポリマー試薬に不規則に共役される、例示的な一反応において、結果として生じる反応混合物は、未修飾タンパク質（ＭＷ １００ｋＤａ）、モノ−ＰＥＧ化タンパク質（ＭＷ １２０ｋＤａ）、ジ−ＰＥＧ化タンパク質（ＭＷ １４０ｋＤａ）等を含有する可能性が高い。この手法を使用して、異なる分子量を有するＰＥＧと他のポリマーとの共役体を分離することは可能であるが、この手法は、タンパク質内で異なるポリマー付着部位を有する位置異性体を分離するには、概して効果がない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィを使用して、ＰＥＧ１量体、２量体、３量体等の混合物を互いに分離することができるが、回収されたＰＥＧ量体組成物のそれぞれは、活性薬剤内で異なる反応性アミノ基（例えばリジン残基）に付着するＰＥＧを含有し得る。
この種類の分離を行うのに適したゲルろ過カラムには、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）より入手可能な、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムがある。特定のカラムの選択は、所望の分画範囲に依存する。溶出は、概して、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の適した緩衝液を使用して行われる。回収された画分は、例えば、（ｉ）タンパク質含有量についての２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含有量についてのヨード試験［Ｓｉｍｓ ｅｔ αｌ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０７：６０−６３］、ならびに（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）、その後のヨウ化バリウムでの染色の、多くの異なる方法で分析することができる。
位置異性体の分離は、逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）Ｃ１８カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＶｙｄａｃ）を使用した逆相クロマトグラフィにより、またはイオン交換カラム、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）イオン交換カラムを使用した、イオン交換クロマトグラフィにより、実行することができる。どちらの手法を使用しても、同一分子量を有するポリマー−活性薬剤異性体（位置異性体）を分離することができる。
本明細書で提示されるポリマーへのカップリングに使用するための、アミン含有の生物活性薬剤は、フォンウィルブランド因子部分または因子ＶＩＩＩ部分であり得る。
フォンウィルブランド因子部分（「ｖＷＦ」）に関して、本発明に有用なフォンウィルブランド因子部分には、未変性のヒトフォンウィルブランド因子として、同一活性（必ずしも同程度の活性である必要はないが）を有する任意のタンパク質を含み、モノマーおよび多量体形態を含む、全ての形態の未変性のヒトフォンウィルブランド因子を含む。有用な形態には、少なくとも２つのフォンウィルブランド因子のホモ多量体を含む。フォンウィルブランド因子部分は、生物活性誘導体であるか、または、単に因子ＶＩＩＩの安定剤として使用される場合、フォンウィルブランド因子部分は、生物学的に活性でない形態であり得る。本発明は、組み合わせて使用される、異なる形態のフォンウィルブランド因子部分を包含することも、理解されたい。例えば、本発明に有用な組成物は、異なる多量体、異なる誘導体、ならびに生物活性誘導体および生物学的に活性でない誘導体の両方を含み得る。
フォンウィルブランド因子部分の生物活性は、２つの異なる体外アッセイで測定することができる（Ｔｕｒｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２８：１４９−１６０）。リストセチン補因子アッセイは、フォンウィルブランド因子活性を有するタンパク質の存在下、抗生物質のリストセチンにより誘発される、新鮮なホルマリン固定血小板の凝集に基づく。血小板凝集の程度は、タンパク質濃度に依存し、例えば血小板凝集計の使用による、比濁法で測定することができる（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７０８−２７１６、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．３４：３０６−３０８）。第２の方法は、ＥＬＩＳＡ技術に基づく、コラーゲン結合アッセイである（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．４３：３０３−３１１；Ｆａｖａｌｏｒｏ（２０００）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８３：１２７−１３５）。マイクロタイタープレートは、Ｉ型またはＩＩＩ型のコラーゲンで被覆されている。提案されたフォンウィルブランド因子部分がコラーゲン表面に結合され、その後酵素標識ポリクローナル抗体を用いて検出される。最終ステップは、ＥＬＩＳＡリーダーで光度的に監視することができる、基質反応である。そのような方法は、部分自体（そのため、「フォンウィルブランド因子部分」として使用することができる）、ならびに対応するポリマー−部分共役体の両方のフォンウィルブランド因子活性を決定するのに有用である。
フォンウィルブランド因子と水溶性ポリマー、および因子ＶＩＩＩおよび水溶性ポリマーとの共役体は、それらの対応する非共役型と比較して、生物活性があり、増加した体内半減期を呈する。体内半減期の増加は、以下の実施例５および６で説明されるように、因子ＶＩＩＩ欠損マウスの共役体、フォンウィルブランド因子、および因子ＶＩＩＩの薬物動態を測定することにより、評価することができる。簡潔に、因子ＶＩＩＩ欠損マウスを、尾静脈を介して因子ＶＩＩＩを予混合した、フォンウィルブランド因子、またはフォンウィルブランド因子と水溶性ポリマー、もしくは因子ＶＩＩＩと水溶性ポリマーとの共役体の急速静注で処置し、フォンウィルブランド因子の抗原量を、様々な時点において、血漿試料中で測定する。さらに、因子ＶＩＩＩ欠損マウスは、因子ＶＩＩＩ、またはフォンウィルブランド因子と水溶性ポリマー、もしくは因子ＶＩＩＩと水溶性ポリマーとの共役体の急速静注で処置することができ、因子ＶＩＩＩの抗原量が、様々な時点において、血漿試料中で測定される。フォンウィルブランド因子抗原および因子ＶＩＩＩ抗原は、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる。
フォンウィルブランド因子部分には、血漿由来のフォンウィルブランド因子および組換えフォンウィルブランド因子を含む。フォンウィルブランド因子部分は、当技術分野で既知であるいずれの方法でも生成することができる。一具体例が、国際公報第ＷＯ８６／０６０９６号で開示されている。
因子ＶＩＩＩ部分に関して、本発明に有用な因子ＶＩＩＩ部分には、未変性のヒト因子ＶＩＩＩと同一活性（必ずしも同程度の活性である必要はないが）を有する任意のタンパク質を含む。可能性のある因子ＶＩＩＩ部分として含まれるのは、未変性のヒト因子ＶＩＩＩであり、それは、構造的にＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２として体系化される、２，３５１アミノ酸の単鎖糖タンパク質である。しかしながら、発現されたポリペプチドが小胞体の内腔に転座される場合、１９−アミノ酸シグナル配列が切断され、第２の配列を生じる。本明細書で提供される、この第２の配列は、先行する１９のアミノ酸を欠く。因子ＶＩＩＩ部分は、因子ＶＩＩＩ（例えば因子ＶＩＩＩａ）の「活性」型のみに限定されず、「因子ＶＩＩＩ部分」という用語は、「前駆体」型、ならびに類似の凝血促進効果を有する他の物質を包含することが、十分理解されるだろう。
任意の所与の部分について、その部分が因子ＶＩＩＩ活性を有するかどうか、決定することが可能である。例えば、いくつかの動物株を、そのような株から産生された動物が、非常に低く、不十分なレベルの因子ＶＩＩＩを有するように、意図的に、血友病の突然変種に繁殖させている。そのような株は、限定されないが、ｔｈｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ａｌｂａｎｙ，ＮＹおよびｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，ＮＣ等の様々な供給源から入手可能である。これらの供給源の両方が、例えば、イヌＡ型血友病を罹患するイヌを提供する。問題の、任意の所与の部分の因子ＶＩＩＩ活性を試験するために、該部分を罹患動物に注入し、小さな切れ目を入れ、対照としての非処理の罹患動物と出血時間を比較する。因子ＶＩＩＩ活性の決定に有用な別の方法は、補因子および凝固促進活性を決定することである。例えば、Ｍｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５：１３３−４２を参照されたい。当業者に既知の他の方法を使用して、所与の部分が因子ＶＩＩＩ活性を有するかどうかを決定することができる。そのような方法は、部分自体（そのため、「因子ＶＩＩＩ部分」として使用することができる）、ならびに対応するポリマー−部分共役体の両方の因子ＶＩＩＩ活性を決定するのに有用である。
因子ＶＩＩＩ部分の非限定例には、以下、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩａ、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、因子ＶＩＩ：ｖＷＦ、Ｂドメイン欠失因子ＶＩＩＩ（および因子ＶＩＩＩの他の切断バージョン）、米国特許第６，１５８，８８８号で説明されるもの等のハイブリッドタンパク質、米国特許出願公報第ＵＳ２００３／００７７７５２号で説明されるもの等の因子ＶＩＩＩ活性を有する糖化タンパク質、ならびに因子ＶＩＩＩ活性を有するペプチド模倣薬を含む。好ましい切断された因子ＶＩＩＩバージョン（「Ｂドメイン欠失因子ＶＩＩＩ」に包含される）は、Ａｒｇ７５９からＳｅｒ１７０９の領域内に少なくとも５８１のアミノ酸に相当する欠失、より好ましくはＰｒｏ１０００からＡｓｐ１５８２の領域、Ｔｈｒ７７８からＰｒｏ１６５９の領域、およびＴｈｒ７７８からＧＩｕ１６９４の領域のうちの１つに相当する欠失を有する、ヒト因子のアミノ酸配列を有するタンパク質に対応する。
フォンウィルブランド因子および因子ＶＩＩＩ部分の両方について、少なくともある程度の所望のフォンウィルブランドまたは因子ＶＩＩＩ活性を維持する、前述のもののうちのいずれかの生物活性断片、欠失変異体、置換変異体、または付加変異体もまた、使用することができる。
アミノ酸の側鎖内の原子への該ポリマーの容易な付着を提供するために、活性薬剤を有利に修飾して、例えば、リジン、システイン、および／またはアルギニン等の１つ以上のアミノ酸残基を含むことができる。アミノ酸残基を付加するための技術は、当業者には周知である。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）を参照することができる。
活性薬剤は、血液由来の供給源から取得することができる。例えば、因子ＶＩＩＩは、当業者に既知である沈殿技術および遠心分離法を使用して、ヒト血漿から分別することができる。例えば、Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ（１９７６）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ １６（４）：３４５−３５０、およびＳｌｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ １６（６）：６１６−６２６を参照されたい。因子ＶＩＩＩは、ヒト顆粒球からも単離することができる。Ｓｚｍｉｔｋｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ（Ｂｕｄａｐ．）１１（ｌ−２）：１７７−１８７を参照されたい。
さらに、活性薬剤は、組換え法からも取得することができる。簡潔に述べると、組換え法は、所望のポリペプチドまたは断片をコードする核酸を構築するステップと、核酸を発現ベクターにクローン化するステップと、宿主細胞（例えば細菌、酵母菌、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞もしくはベビーハムスター腎臓細胞等の哺乳類細胞）を転換するステップと、核酸を発現させて所望のポリペプチドまたは断片を産生するステップと、を伴う。組換えポリペプチドを、体外、ならびに原核性および真核性の宿主細胞に産生および発現するための方法は、当業者に既知である。例えば、米国特許第４，８６８，１２２号を参照されたい。
上記の例示的な生物活性薬剤は、該当する場合、それらの類似体、作用薬、拮抗薬、阻害剤、異性体、および医薬的に許容される塩形態を包含することを意図する。ペプチドおよびタンパク質について、本発明は、これらの合成型、組換え型、未変性型、糖化型、および非糖化型、ならびに生物活性断片を包含することを企図する。さらに、「活性薬剤」という用語は、共役前の活性薬剤、ならびに共役後の活性薬剤「残基」を包含することを企図する。
本発明はまた、医薬賦形剤と組み合わせた、本明細書で提供される共役体を含有する、医薬調製物も含む。概して、共役体自体は、固形（例えば沈殿物）であり、固形または液状のいずれかであり得る、適した医薬賦形剤と組み合わせることができる。
例示的な賦形剤には、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、酸化防止剤、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されるものを含むが、それらに限定されない。
糖等の炭水化物、アルジトール等の誘導体化糖、アルドン酸、エステル化糖、および／または糖ポリマーは、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤には、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖類、乳糖、ショ糖、トレハロース、セロビオース等の二糖類、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖類、およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等のアルジトール類を含む。
賦形剤はまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、およびそれらの組み合わせ等の無機塩または緩衝液も含む。
調製物はまた、微生物の増殖を防止または遅らせるための抗微生物剤を含んでもよい。本発明に適した抗微生物剤の非限定例には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゾトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、およびそれらの組み合わせを含む。
抗酸化剤も同様に調製物中に存在することができる。抗酸化剤は、酸化を防ぎ、したがって、共役体または調製物の他の成分の劣化を防止するために使用される。本発明での使用に適した抗酸化剤には、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせを含む。
界面活性剤は賦形剤として存在し得る。例示的な界面活性剤には、「ツイーン２０」および「ツイーン８０」等のポリソルベート類、およびＦ６８とＦ８８（共にＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから入手可能）等のプルロニック類、ソルビタンエステル、レシチンおよび他のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質等の脂質（ただし好ましくは、リポソーム型ではない）、脂肪酸、および脂肪酸エステル、コレステロール等のステロイド、ならびにＥＤＴＡ、亜鉛、および他の適した陽イオン等のキレート剤を含む。
酸または塩基は、調製物中に賦形剤として存在し得る。使用可能な酸の非限定例には、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される酸を含む。適した塩基の例には、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される塩基を含むが、それらに限定されない。
医薬調製物は、あらゆる種類の製剤を含み、特に注射に適したもの、例えば再構成可能な散剤、ならびに懸濁液および溶液を包含する。組成物中の共役体（つまり、本明細書で説明される活性薬剤とポリマーとの間で形成される共役体）の量は、多くの因子により異なるが、組成物が単位用量容器（例えばバイアル）に保存される場合は、治療的有効用量が最適である。さらに、医薬調製物は、シリンジに収容することができる。治療的有効用量は、どの量が臨床的に所望の終点をもたらすかを決定するために、共役体の量を増加させて繰り返し投与することにより、実験的に決定することができる。
組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性と組成物の特定の必要性により異なる。典型的には、個々の賦形剤の最適量は、日常的実験により、つまり、異なる量（低濃度から高濃度まで）の賦形剤を含有する組成物を調製し、安定性や他のパラメータを調べ、次に大きな副作用無しで最適な性能が達成される範囲を決定することにより、決定することができる。
しかし、概して、賦形剤は組成物中に、約１〜約９９重量％、好ましくは約５〜９８重量％、より好ましくは約１５〜９５重量％の賦形剤の量で存在し、３０重量％未満の濃度が最も好ましい。
これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤とともに、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５），ｔｈｅ ”Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８），およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ，２０００で説明されている。
本発明の医薬調製物は、必ずしもそうとは限らないが、典型的には注射により投与され、したがって、概して投与直前は液体または懸濁液である。医薬調製物は、シロップ剤、クリーム剤、軟膏剤、錠剤、散剤等の他の形態をとることもできる。肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、くも膜下、皮下、動脈内等の、他の投与形式も含まれる。
既に説明したように、共役体は、静脈内注射、またはそれほど好ましくはないが、筋肉内もしくは皮下注射により、非経口的に投与することができる。非経口投与に適した製剤の種類には、とりわけ、即時注射可能な溶液、使用前に溶媒と組み合わされる乾燥散剤、即時注射可能な懸濁液、使用前に媒体と組み合わされる乾燥不溶性組成物、ならびに投与前に希釈されるエマルジョンおよび液体濃縮物を含む。
本発明はまた、共役体による治療に応答性の状態に罹患する患者に、本明細書で提供される共役体を投与する方法を提供する。本方法は、概して注射により、治療的有効量の共役体（好ましくは医薬調製物の一部として提供される）を投与するステップを含む。本投与方法は、特定の共役体の投与により改善または予防可能な任意の状態を治療するために、使用することができる。当業者は、特定の共役体がどの状態を有効に治療できるかを容易に理解する。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、および全般の症状、ならびに治療される疾患の重症度、医療専門家の判断、および投与される共役体により異なる。治療的有効量は、当業者に既知であり、および／または関連する参考書および文献で説明されている。概して、治療的有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の用量であり、より好ましくは０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量の範囲である。
任意の所与の共役体の単位用量（やはり、好ましくは医薬調製物の一部として提供される）は、臨床医の判断、患者の必要性等により、様々な投与計画で投与することができる。具体的な投与計画は当業者に既知であるか、または日常的方法を使用して実験的に決定することができる。投与計画の例には、１日に５回、１日に４回、１日に３回、１日に２回、１日に１回、週に３回、週に２回、週に１回、月に２回、月に１回、およびそれらの任意の組み合わせがあるが、それらに限定されない。臨床的終点が達成されると、組成物の投与が停止される。
本発明を、その好ましい具体的な実施形態と併せて説明したが、前述の説明ならびに以下の実験は、本発明の範囲を例示することを意図し、その範囲を制限するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点および修正は、本発明に関連する当業者には明らかであろう。
本明細書で参照される全ての論文、書物、特許、特許公報、および他の刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
実験
本発明の実施は、特に明記しない限り、有機合成等の従来の技術を採用し、これは、当業者によって理解され、文献に説明されている。以下の実施例において、使用される数字（例えば、量、温度等）に関しては正確性を確保する努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。特に明記しない限り、温度は摂氏であり、圧力は、海面での大気圧またはその付近である。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的に取得した。全ての産生されたＮＭＲは、Ｂｒｕｋｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって製造された３００または４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計から取得した。全ての処理は、ガラスまたはガラス裏打ち容器内で行い、金属含有容器または機器との接触を避ける。
以下の略称を使用する。
ＦＶＩＩＩ、ｒＦＶＩＩＩ 第ＶＩＩＩ因子、組換えＦＶＩＩＩ
ＨＰＬＣ 高圧液体クロマトグラフィ
ｈｙｄｒ 加水分解性
ＰＥＧ−ｒＶＷＦ ペグ化ｒＶＷＦ
ＰＥＧｒＦＶＩＩＩ ペグ化ｒＦＶＩＩＩ
ｒＶＷＦ 組換えフォンウィルブランド因子
ｒＦＶＩＩＩ 組換えＦＶＩＩＩ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ペグ化のために使用したｒＶＷＦ生成物は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に由来する、精製されたｒＶＷＦ調製物であり、従来の精製技術を使用して精製した。
ポリマー試薬は、米国特許出願公報第２００６／０２９３４９９号に説明される基本的な手法に従って生成され、以下の構造を有した。
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 （実施例１Ａ）
ｖＷＦ共役体の調製
（２０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ２０Ｋ ｂｒ長」）
Figure 2010514773
 （式中、ＶＷＦは、フォンウィルブランド因子の残基である）
適正な量のＶＷＦタンパク質溶液を解凍し（±３０℃の温水を使用）、６０ｍｇのタンパク質含有量を有するタンパク質溶液を得た。タンパク質溶液を、新しい無菌化した４００ｍＬ使い捨てポリプロピレンビーカーに注いだ。必要であれば、タンパク質溶液の温度を、２２℃（±１℃）に調節した。必要であれば、タンパク質溶液を、溶液［２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｖショ糖］で希釈したか、または０．４５ｍｇ／ｍＬ±０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度を確実にするために濃縮した。０．２ｍＬの試料を保持し、後の濃度検査のために４℃で保存した。タンパク質溶液ビーカーは、オーバーヘッド撹拌機の下に設置され、インペラは、タンパク質溶液中に約３／４下方（つまり、底面から１／４）に下げ、インペラは、６０ｒｐｍ（±２ｒｐｍ）で攪拌するよう設定された。できる限り混入を防ぐために、ビーカーに覆いをした。
約２０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量（つまり、各ポリマー「アーム」の重量平均分子量の和）を有する７５モル過剰（２７８ｋダルトンのフォンウィルブランド因子モノマー質量と比べて）のポリマー試薬Ｂを、秤量して５０ｍＬ ポリプロピレンＦａｌｃｏｎ管に入れ、５％ｗ／ｖＰＥＧまたは５０ｍｇ／ｍＬＰＥＧ溶液を提供するのに十分な量で、２ｍＭ ＨＣｌを添加することによって溶解した）。ＰＥＧ溶液は、任意で遠心分離することができ（５０ｍＬＦａｌｃｏｎ管へのフォルダーを備えたＢｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機を１０００ｒｐｍで使用）、これは、管の底で収集される透明な溶液をもたらす。ＰＥＧ溶液が形成され次第、これを、注射器ポンプによって、１．５ｍＬ／分（９０ｍＬ／時間）の速度でタンパク質溶液中に投入した。ＰＥＧ溶液が、インペラの高さでタンパク質溶液中に注がれるように、ＰＥＧ溶液を運搬する管をビーカーに入れた。今後、ＰＥＧ溶液と組み合わせたタンパク質溶液は、「ペグ化反応混合物」と称する。ペグ化反応混合物の攪拌は、必要に応じた間隔で監視された温度（２２℃±１℃）およびｐＨで、５時間継続した。
撹拌の５時間後（ペグ化反応溶液のｐＨは、７．３±０．１であるべきである）、１４．５ｍＬの０．１Ｍグリシン溶液を添加し（ＰＥＧ溶液をペグ化反応溶液に添加したのと同じ方法で１．５ｍＬ／分で）、それによって、グリシン含有のペグ化反応混合物を形成した。グリシン含有のペグ化反応混合物中のグリシンの最終的な濃度は、１０ｍＭ（±１ｍＭ）であるべきである。グリシン含有のペグ化反応混合物を６０ｒｐｍでさらに２時間攪拌した。
２時間の撹拌後、０．２ｍＬ試料を除去して、タンパク質定量のために４℃で保存した。
グリシン含有のペグ化反応混合物内の共役体を精製するために、グリシン含有のペグ化反応混合物は、１００ｍＭより下の濃度にＮａＣｌ濃度を減少させ、非結合遊離ポリマー試薬Ｂを希釈するために、３グリシン含有のペグ化反応体積の溶液Ａ［２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、０．５％ｗ／ｖショ糖］で希釈した。希釈後、グリシン含有のペグ化反応溶液を、緩やかな回転（回旋）で混合またはオーバーヘッド撹拌機を用いて混合した。共役体は、Ａ¨ＫＴＡ Ｂａｓｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ上で陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖａｎｔａｇｅ ４４ｍｍ ＩＤカラムを、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃ ＳＰ−ＨＰ培地で充填した。充填層の高さは、１５０〜１６０ｍＬのカラム体積をもたらす１００〜１０５ｍｍであり、それによって、カラム負荷が≦０．４ｍｇ／ｍＬとなった。カラム内の流速は、１５ｍＬ／分（１ｃｍ／分の線流速）に設定した。精製のための使用した移動相は、溶液Ａ［２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、０．５％ｗ／ｖショ糖］および溶液Ｂ［２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．１）、０．５％ｗ／ｖショ糖、１．０Ｍ ＮａＣｌ］、またはその両方の混合物を含み、移動相は勾配を使用して実行した。ステップ１：０％の開始移動相が溶液Ｂを含有した、ステップ２：カラム体積の０．７に等しい最初の保持容量のために、移動相は、溶液Ｂの０から７０％を含有した、ステップ３：カラム体積の２．５に等しい次の保持容量のために、移動相の７０％が溶液Ｂを含有した。溶出剤のＵＶ吸光度を２８０ｎｍで監視した。非結合遊離ポリマー試薬Ｂは、ステップ１の間に溶出した。吸光度が、ベースラインから上がり、ピークが最大ピーク高さの７％に戻って減少した時に停止し次第、ステップ２および３の間に溶出した共役体を収集した。この手順に従って調製した典型的なクロマトグラムは、図１の通りに提供する。
（実施例１Ｂ）
ＶＷＦ共役体の調製
（４０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ４０Ｋ ｂｒ長」）
約４０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ｂを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用した点を除いて、実施例１Ａの基本的な手順を繰り返した。
（実施例１Ｃ）
ＶＷＦ共役体の調製
（６０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ６０Ｋ ｂｒ長」）
約６０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ｂを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用した点を除いて、実施例１Ａの基本的な手順を繰り返した。
（実施例２Ａ）
ＦＶＩＩＩ共役体の調製
（２０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ２０Ｋ ｂｒ長」）
Figure 2010514773
 （式中、ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子の残基である）
ＦＶＩＩＩタンパク質溶液（３．２３ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度）を急速に解凍し（５分間室温で温水浴を使用）、１０００μＬ分注器を使用して、約３．１ｍＬの温めたＦＶＩＩＩタンパク質溶液を、５０ｍＬ円錐管に入れた。
約２０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量（つまり、各ポリマー「アーム」の重量平均分子量の和）を有する４２．８モル比（第ＶＩＩＩ因子と比べて）のポリマー試薬Ｂ（３８ｍｇ）を、２ｍＬ微小遠心分離管に入れた。秤量したポリマー試薬Ｂを、５００μＬの２ｍＭ ＨＣｌ中で懸濁させた。ポリマー試薬Ｂは、２０秒にわたって微小遠心分離管を交替させて、遠心分離することによって可溶化した。
分注器を使用して、そのように形成されたポリマー試薬Ｂの溶液を、１０〜２０秒にわたって、温めたＦＶＩＩＩタンパク質溶液に滴下して加えた。結果として生じた混合物を室温（約２２℃）で１時間維持した。１時間後に、３６μＬの０．１Ｍグリシン溶液を添加して、それによってグリシン含有のペグ化反応混合物を形成した。１００μＬ試料を５００μＬ微小遠心分離管に入れ、次いで、−８０℃の冷凍庫に入れた。
グリシン含有のペグ化反応混合物内の塩を除去するために、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＤｅＳａＩｔカラムを、２０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５］で事前に平衡化させた。平衡化され次第、グリシン含有のペグ化反応混合物の全体積をカラムに充填し、画分を収集して、プールした。タンパク質含有の画分を収集して、容器に入れ、標準的な氷浴に即時に入れた。
グリシン含有のペグ化反応混合物の共役体を精製するために、グリシン含有のペグ化反応混合物を１：１０溶液Ａ［２０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５］で希釈した。共役体を、Ａ¨ＫＴＡ Ｂａｓｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ上で陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。使用したカラムは、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（システムおよびカラムを０．１Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、ＮａＯＨの完全な除去は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水または精製緩衝液で洗浄後に、中和または中和付近のｐＨ試験によって検証した）であった。カラムは、２．０ｍＬ／分で１０ｍＬの溶液Ａで洗浄し、フロースルーを５ｍＬ画分で収集した。精製のために使用した移動相は、溶液Ａ、溶液Ｂ［２０ｍＭヒスチジン、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５、１Ｍ ＮａＣｌ］、またはその両方の混合物を含み、移動相は、勾配を使用して実行した。溶液Ａの２カラム体積（１０ｍＬ）のカラム洗浄を行った。以下の勾配を使用した。開始移動相の０％が溶液Ｂを含有した。移動相中の溶液Ｂの５０％を使用し、１５ｍＬ（ピークを約２ｍＬ画分で収集し、氷上に保存した）に対して保持するステップ、移動相中の溶液Ｂの１００％を使用し、５ｍＬに対して保持するステップ、および最後に、移動相中の溶液Ｂの０％を使用し、１５ｍＬに対して保持するステップに戻る。典型的な分離特性は、図２Ａの通りに提供する。
タンパク質定量は、１×０．２ｍＬの一定分量の精製かつ共役した試料および１００μＬ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子を解凍することによって行った。０．２、０．５、０．７５および１．５ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子の点を有する標準曲線を用意した。各測定に対して（試料、標準物質、または精製緩衝液）、３０μＬの適した物質をきれいな５ｍＬ管に入れ、１．５ｍＬのＰｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）を管に添加し、続いて、管の内容物を混合した。室温（２２℃）で１０分間のインキュベーション後、各管の内容物を、５９５ｎｍの分光光度計を使用して読み取った。
イオン交換クロマトグラフィによる分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００クロマトグラフィ系（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）上に４．６×５０ Ｍｉｎｉ Ｑ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を設置することによって行い、緩衝液は、精製のために使用したものと同じであり、最大流速は０．５ｍＬ／分であった。３０マイクロリットルの精製した共役体試料（または対照としての第ＶＩＩＩ因子）を、３０μＬの２ｍＭ ＨＣｌで希釈し、２００μＬでＨＰＬＣバイアル中に入れた。以下の勾配を使用した。時間ゼロで、移動相の０％が溶液Ｂを含有し、時間ゼロから２分の間で、移動相の０％が溶液Ｂを含有し、時間２分から２．５分の間で、移動相の２７％が溶液Ｂを含有し、時間２．５分から８分の間で、移動相の２７％が溶液Ｂを含有し、時間８分から８．５分の間で、移動相の７０％が溶液Ｂを含有し、時間８．５分から１４分の間で、移動相の７０％が溶液Ｂを含有した。３０μＬの試料または対照を、各注入に使用した。２８０ｎｍのクロマトグラムにおいて、ピークは以下に相当する。約１１分での未変性第ＶＩＩＩ因子および共役された第ＶＩＩＩ因子が早期であった。この手順に従って調製した典型的なクロマトグラムは、図２Ｂの通りに提供する。
精製した共役体試料は、３〜８％トリス酢酸ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を室温に温めることによってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、２ｍＭ ＨＣＬ中のポリマー試薬Ｂの標準曲線は、０．００１％、０．０１％および０．１％のポリマー試薬Ｂ（ｗ／ｖ）の濃度である。標準物質は、１０μＬのＨｉＭａｒｋ分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）をレーン１に入れることによって調製した。精製した共役体試料または対照（第ＶＩＩＩ因子）（１０μＬ容積）は、３０μＬの２ｍＭ ＨＣｌでそれぞれ個々に希釈し、３０マイクロリットルの各ＨＣｌ希釈の試料または対照を、１０μＬの４ｘＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）と組み合わせ、次いで、２５μＬの溶液を指定のウェルに移動させた。直ちに、ゲルをゲル装置内に設置し、１５０ボルトで６０分間実行させた。実行完了後、ゲルをゲル装置から除去し、脱イオン水ですすいだ。次いで、ゲルをヨウ化バリウム染色（１５ｍＬ ０．１Ｍ過塩素酸へのゲルの添加に続く５分間のインキュベーション、続いて、５ｍＬの５％塩化バリウムのゲル、次いで２ｍＬのヨウ素の添加に続く５分間のインキュベーションによって行った）で染色し、続いて脱イオン水ですすいだ。ゲルを脱イオン水ですすいだ５分後、ゲルは、Ｋｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ Ｓｃａｎｎｅｒシステム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）で分析し、未反応ポリマー試薬Ｂを同定した。走査後、あらゆる残留水をゲルから除き、５０ｍＬのＰｉｅｒｃｅ Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）をゲルに添加した。３０分間の室温でのインキュベーション後、ゲルを脱イオン水ですすぎ、２００ｍＬ脱イオン水中に１時間静置させた。１時間の間、水の幾つかの変化が完了した。１時間後、ゲルをＫｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ Ｓｃａｎｎｅｒシステム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）で分析した。
（実施例２Ａ１）
ＦＶＩＩＩ共役体の調製
（２０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長-再合成」）
実施例２Ａの合成手順を繰り返した。再度手順を行った後、ポリマー対第ＶＩＩＩ因子の比率における幾らかの差が、再合成した共役体と実施例２Ａのものとの間で観察されたことが認められ、これは、異なる分析方法の使用が原因であると説明され得る。しかしながら、ヨウ化バリウム染色による調査では、遊離ポリマー試薬Ｂは、いかなる試料溶液中にも残らなかった。
（実施例２Ｂ）
ＦＶＩＩＩ共役体の調製
（４０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長」）
約４０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ｂを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用した点を除いて、実施例１Ａの基本的な手順を繰り返した。
（実施例２Ｂ１）
ＦＶＩＩＩ共役体の調製
（４０，０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ４０Ｋ ｂｒ長−再合成」）
実施例２Ｂの合成手順を繰り返した。再度手順を行ったところ、ポリマー対第ＶＩＩＩ因子の比率における幾らかの差が、再合成した共役体と実施例２Ａのものとの間で観察されたことが認められ、これは、異なる分析方法が原因であると説明され得る。しかしながら、ヨウ化バリウム染色による調査では、遊離ポリマー試薬Ｂは、いかなる試料溶液中にも残らなかった。
（実施例２Ｃ）
ＦＶＩＩＩ共役体の調製
（６０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ６０Ｋ ｂｒ長」）
約６０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ｂを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用した点を除いて、実施例２Ａの基本的な手順を繰り返した。
（実施例３Ａ）
ｖＷＦ共役体の調製
（２０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ２０Ｋ ｂｒ短」）
Figure 2010514773
 （式中、ＶＷＦは、フォンウィルブランド因子の残基である）
（１７５ｍＬ）のフォンウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）溶液（２０ｍＭヘペス中０．３４４ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、ｐＨ７．４）を室温に解凍させた。７．７ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌ中に新たに溶解した、約２０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量（つまり、各ポリマー「アーム」の重量平均分子量の和）を有する１７５モル比（ＶＷＦと比べて）のポリマー試薬Ａ（７６６．３ｍｇ）を、ＶＷＦ溶液中にゆっくりとピペットした。混合物は、室温で２時間、振盪機上で緩やかに振盪させた。水中１．８ｍＬの１Ｍグリシンを添加することによって反応停止し、室温でさらに３時間、振盪機上で緩やかに振盪させた。溶液は、０．５ｗｔ％ショ糖とともに、ｐＨ６．１０での１７５ｍＬのＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒをゆっくりと添加することによって希釈した。溶液を緩やかな回旋で良く混合させ、次いで、４℃で一晩保存した。次いで、溶液中の非結合ポリマー試薬Ａをイオン交換クロマトグラフィで除去した。下記のクロマトグラムを参照されたい。結果として生じた共役体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けした。アニオン交換クロマトグラフィ後のクロマトグラムを図３Ａに提供する。図３Ｂおよび図３Ｃは、それぞれ還元および非還元条件下における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後のゲルを示す。
（実施例３Ｂ）
ｖＷＦ共役体の調製
（４０，０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ４０Ｋ ｂｒ短」）
一定分量（１７５ｍＬ）のフォンウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）溶液（６０．２ｍｇタンパク質含有量）を室温に解凍させた。１３．７ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌ中に新たに溶解した、約４０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量（つまり、各ポリマー「アーム」の重量平均分子量の和）を有する１３５モル比（ＶＷＦと比べて）のポリマー試薬Ａ（１．３７４ｇ）を、ＶＷＦ溶液中にゆっくりとピペットした。混合物は、室温で３時間、振盪機上で緩やかに振盪させた。水中９４５μＬの２Ｍグリシンを添加することによって反応を停止し、室温でさらに３時間、振盪機上で緩やかに振盪させた。溶液は、０．５ｗｔ％ショ糖とともに、ｐＨ６．１０での１７５ｍＬの２０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒをゆっくりと添加することによって希釈した。溶液を緩やかな回旋で良く混合させ、次いで、４℃で一晩保存した。次いで、溶液中の非結合ポリマー試薬Ａをイオン交換クロマトグラフィで除去した。対応するクロマトグラムは図４Ａを参照されたい。
（実施例３Ｃ）
ｖＷＦ共役体の調製
（６０，０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ６０Ｋ ｂｒ短」）
一定分量（１７５ｍＬ）のフォンウィルブランド因子（「ＶＷＦ」）溶液（６０．２ｍｇタンパク質含有量）を室温に解凍させた。１３．７ｍＬの２ｍＭ ＨＣｌ中に新たに溶解した、約６０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量（つまり、各ポリマー「アーム」の重量平均分子量の和）を有する１５０モル比（ＶＷＦと比べて）のポリマー試薬Ａ（２．４０６ｇ）を、ＶＷＦ溶液中にゆっくりとピペットした。混合物は、室温（２２℃）で３時間、振盪機上で緩やかに振盪させた。水中８７５μＬの２Ｍグリシンを添加することによって反応を停止し、室温でさらに３時間、振盪機上で緩やかに振盪させた。溶液は、０．５ｗｔ％ショ糖とともに、ｐＨ６．１０での１７５ｍＬの２０ｍＭ ＭＥＳ Ｂｕｆｆｅｒをゆっくりと添加することによって希釈した。溶液を緩やかな回旋で良く混合させ、次いで、４℃で一晩保存した。次いで、溶液中の遊離ＰＥＧをイオン交換クロマトグラフィで除去した。対応するクロマトグラムは図４Ｂを参照されたい。
（実施例４Ａ）
第ＶＩＩＩ因子共役体の調製
（２０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ２０Ｋ ｂｒ短」）
Figure 2010514773
 （式中、ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子の残基である）
第ＶＩＩＩ因子タンパク質溶液（３．２３ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度）を、急速に解凍し（室温５分間の温水浴を使用）、１６５μＬの温めたＦＶＩＩＩタンパク質溶液を、１ｍＬ微小遠心分離管に入れた。微小遠心分離管を、標準的な氷浴（溶液は凍結すべきでないため、ドライアイスではない）に入れることによって、冷却した第ＶＩＩＩ因子タンパク質溶液を形成した。
約２０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量（つまり、各ポリマー「アーム」の重量平均分子量の和）を有する７０モル比（第ＶＩＩＩ因子と比べて）のポリマー試薬Ａを、１ｍＬ微小遠心分離管に入れた。秤量したポリマー試薬Ａを、２ｍＭ ＨＣｌ中で懸濁させ、ポリマー試薬Ａ溶液を形成した。ポリマー試薬Ａが確実に溶解した後（溶液を５秒間ボルテックスし、続いて、１０秒間遠心分離させることによって達成された）、全てのポリマー試薬Ａ溶液を冷却した第ＶＩＩＩ因子タンパク質溶液に添加し、結果として生じる混合物を、１時間室温でロッカープレート上に置いた。１時間後、１８．８μＬの５０ｍＭグリシン溶液を添加し、それによって、グリシン含有のペグ化反応混合物を形成した。グリシン含有のペグ化反応混合物を、ロッカープレート上で室温で２０分間振盪させた。
グリシン含有のペグ化反応混合物内の塩を除去するために、ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＤｅＳａＩｔカラムを、２０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５で事前に平衡化させた。平衡化され次第、反応物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で１ｍＬの最終容積まで希釈した。次いで、全体積をカラム上に充填し、画分を収集して、プールした。タンパク質含有の画分を標準的な氷浴に即時に入れた。この手順に従って調製した典型的なクロマトグラムは、以下に提供される。
脱塩したグリシン含有のペグ化反応混合物内の共役体を精製するために（非共役体ＰＥＧ種を除去するために）、共役体をＡ¨ＫＴＡ Ｂａｓｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ上で陽イオン交換クロマトグラフィによって精製した。使用したカラムは、２０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５＋１Ｍ ＮａＣｌで再生した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムであり、２０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＣａＣＬ２、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５で事前に平衡化した。脱塩したグリシン含有のペグ化反応混合物を、カラム上に充填し、精製を、０〜５０％ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＣａＣ１２、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．５＋１Ｍ ＮａＣｌのステップ勾配で行った。画分を収集し、プールして、標準的な氷浴中に即時に設置された容器内に保存した。図５の通りに提供したクロマトグラムを参照されたい。
精製した共役体は、３〜８％トリス酢酸ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を室温に温めることによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ここで、２ｍＭ ＨＣＬ中のポリマー試薬Ｂの標準曲線は、０．００１％、０．０１％および０．１％のポリマー試薬Ｂ（ｗ／ｖ）の濃度である。標準物質は、１０μＬのＨｉＭａｒｋ分子量マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）をレーン１に入れることによって調製した。精製した共役体試料または対照は、３０μＬの２ｍＭ ＨＣｌでそれぞれ個々に希釈し、３０マイクロリットルの各ＨＣｌ希釈の試料または対照を、１０μＬの４ｘＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）と組み合わせ、次いで、２５μＬの溶液を指定のウェルに移した。直ちに、ゲルをゲル装置内に設置し、１５０ボルトで６０分間実行させた。実行完了後、ゲルをゲル装置から除去し、脱イオン水ですすいだ。次いで、ゲルをヨウ化バリウム染色（１５ｍＬ ０．１Ｍ過塩素酸へのゲルの添加に続く５分間のインキュベーション、続いて、５ｍＬの５％塩化バリウムのゲル、次いで２ｍＬのヨウ素の添加に続く５分間のインキュベーションによって行った）で染色し、続いて脱イオン水ですすいだ。ゲルを脱イオン水ですすいだ５分後、ゲルは、Ｋｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）で分析した。図６Ａを参照されたい。
走査後、あらゆる残留水をゲルから除き、５０ｍＬのＧｅｌ Ｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）をゲルに添加した。３０分間の室温でのインキュベーション後、ゲルを脱イオン水ですすぎ、２００ｍＬ脱イオン水中に１時間静置させた。１時間の間、水の幾つかの変化が完了した。１時間後、ゲルをＫｏｄａｋ Ｇｅｌ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）で分析し、非共役第ＶＩＩＩ因子を同定した。図６Ｂを参照されたい。
（実施例４Ｂ）
第ＶＩＩＩ因子共役体の調製
（４０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ４０Ｋ ｂｒ短」）
約４０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ａを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用した点を除いて、実施例４Ａの基本的な手順を繰り返した。
（実施例４Ｂ１）
第ＶＩＩＩ因子共役体の調製
（４０．０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短−再合成」）
（ａ）約４０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ａを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用し、（ｂ）第ＶＩＩＩ因子と比べて１５０のモル過剰のポリマー試薬を共役ステップに使用し、５ｍｇのポリマー試薬Ａを、きれいな１ｍＬ微小遠心分離管に入れ、５０μＬの２ｍＭ ＨＣｌ中で溶解した点を除いて、実施例４Ａの基本的な手順を繰り返した。溶液を５秒間ボルテックスし、次いで１０秒間遠心分離して、ＰＥＧを完全に溶解する。全５０μＬのＰＥＧ溶液を冷却したＦＶＩＩＩに添加し、室温で１時間ロッカープレート上に置く。２１．５μＬの５０ｍＭグリシンで反応停止する。室温で２０分間振盪させ続ける。
（実施例４Ｃ）
第ＶＩＩＩ因子共役体の調製
（６０，０００ダルトン総ポリマー重量平均分子量）
（「Ｌｖｓ ６０Ｋ ｂｒ短」）
約６０，０００ダルトンの総ポリマー重量平均分子量を有するポリマー試薬Ａを、約２０，０００ダルトンの代わりに使用した点を除いて、実施例４Ａの基本的な手順を繰り返した。
（実施例５）
ペグ化ｒＶＷＦの体外および体内実験
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、この実施例５に説明したような還元条件下で行い、続いて、銀染色法（図７、パネＡ）およびクーマシー染色法（図７、パネルＢ）を行った。還元条件下で、成熟ｒＶＷＦは、１５０キロダルトンまで下がるいくらかの微量バンドとともに、約２６０キロダルトンのＭＷを有する顕著な単一バンド（モノマー）として現れた。ゲルがポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体で免疫ブロットされた場合、図７パネルＣに示すように、ｒＶＷＦモノマーは、異なるＭＷ標準物質の使用に起因して、２８０キロダルトンより明らかに高いＭＷを示す。未変性ｒＶＷＦ１３３Ｐｌは、いくらかの微量非関連分解バンドとともに、抗ＶＷＦ免疫ブロットにおいて単一ＶＷＦモノマーとして現れた。多量体組成物は、多量体構造の完全性を示すため、およびサテライトまたは他の分解バンドが発生しなかったことを確認するために、高分解能ゲルを使用して非還元アガロースゲル電気泳動で調査した（図７、パネルＤ）。未変性ｒＶＷＦ１３３Ｐｌの解析データを表１に提供する。
Figure 2010514773
 解離可能なｒＶＷＦ共役体：ｒＶＷＦのリジン残基のアミノ基を介した解離可能な結合でのＰＥＧ−ｒＶＷＦ共役体を、実施例１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに従って調製した。ＰＥＧ−ｒＶＷＦ共役体は、約２０Ｋ、４０Ｋまたは６０Ｋの総ＰＥＧ分子量を有した。表２は、共役体のペグ化度を要約する。
Figure 2010514773
 ペグ化ｒＶＷＦのタンパク質含有量は、標準物質として非修飾ｒＶＷＦ１３３Ｐｌを用いてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して決定した。残りの遊離ＰＥＧは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのヨウ化バリウム染色によって決定した。
＊分子当たりのＰＥＧ数は、クーマシー染色の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを分析し、続いてゲル走査分析によって計数した。
＊＊分子当たりのＰＥＧ数は、プロナーゼ／アンモニウムフェロチオシアネート方法で決定した。
適用した異なる方法で決定したＶＷＦモノマー比率へのＰＥＧにおけるいくらかの差を示した。ＰＥＧ抽出ステップを必要としないＨＰＬＣ方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法で得られるものよりも、高い数の平均ＰＥＧ／モノマー数が得られた。したがって、低いペグ化度の１〜２ＰＥＧ／ＶＷＦモノマー（「モノペグ化」）の本来の標的は、Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長低共役体を除いて、全ての調製において上回った。ヨウ化バリウム染色の調査によると、遊離ＰＥＧは、試料溶液中に残らなかった。
試料のタンパク質含有量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを使用したＢｒａｄｆｏｒｄによって説明される原理に従って測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４。微量検定法手順は、製造業者の使用説明書に従って行い、認定されたヒト血清製剤（Ｑｕａｌｉｔｒｏｌ ＨＳ−Ｎ，ＤｉａＳｙｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｈｏｌｚｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｙ ＶＷＲ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して較正し、２０から１．８μｇタンパク質／ｍｌの較正範囲を得た。濃縮した試料の事前の希釈ならびに試料希釈は、０．９％ＮａＣｌ溶液で調製した。
ＶＷＦ：Ａｇの決定：２つの異なるＶＷＦ：Ａｇアッセイ、すなわちＳＩＭＩＴおよびサンドイッチＥＬＩＳＡを実験時に使用した。
共役体の体外特徴付けのための単一インキュベーション多層免疫技術（ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＳＩＭＩＴ）が、使用した１つの技法であった。ダブルサンドイッチＶＷＦ：Ａｇ ＥＬＩＳＡは、単一インキュベーション多層免疫技術ＳＩＭＩＴを使用し、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ：抗体（Ａ−０８２）およびペルオキシダーゼで標識したポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｐ−０２２６、どちらもＤａｋｏｐａｔｔｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手）の市販の抗体の組み合わせで構成した。マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ Ｆ９６、ＶＷＲから入手）のウェルは、被覆緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ＨＣｌでｐＨ９．５に調節した）中で希釈された１μｇ抗ヒトＶＷＦ：抗体で被覆した。洗浄緩衝液として使用したＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、７ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物および０．５ｍｌＴｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＥＩＡグレード）から成った。試料および抗体共役体の希釈のために、０．１％脱脂粉乳および２ｍＭベンズアミジンを洗浄緩衝液に添加した。全てのインキュベーションは、室温で行った。ペルオキシダーゼ活性は、基質としてテトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。顕色強度は、４５０ｎｍにおいてＥＬＩＳＡリーダーで測定した。実際のＷＨＯ標準物質に対して較正した正常基準血漿は、較正曲線の構築のために使用した。６つの幾何的１＋１希釈度１／１００〜１／３２００から成る希釈系列を調製し、各単一プレート上で重複して分析し、０．０１〜０．０００６ＩＵ／ｍｌのＶＷＦ：Ａｇ濃度範囲を得た。試料は、少なくとも１＋１で希釈し、さらに５の１＋１希釈を重複して分析した。また、アッセイブランクも重複で操作した。データ評価のために、線形回帰曲線は、測定したブランク補正光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ）および６つのキャリブレータの既知のＶＷＦ：Ａｇ濃度の両方の対数間で計算した。試料ＯＤは、それらが、較正曲線によって定義される範囲内にあった時のみに、この曲線に外挿し、結果はＩＵ／ｍｌで報告した。
また、体外解離実験のため、および薬物動態学的研究からの生体外血漿試料の分析のためのサンドイッチＥＬＩＳＡも使用した。ＶＷＦ：ＡｇをサンドイッチＥＬＩＳＡで決定した。マイクロプレートのウェル（Ｎｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏ９６−マイクロウェルプレート、Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）は、ｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液中の１μｇ／ウェルポリクローナル抗ＶＷＦ抗体（Ａ−０８２，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で一晩被覆した。次いで、プレートを洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、０．０２から０．００１ＩＵ／ｍｌ ＶＷＦ：Ａｇ［洗浄緩衝液＋０．３％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）中］の範囲の希釈した試料を、２５〜３２℃で、２時間ウェル中でインキュベートし、続いて、洗浄緩衝液＋０．３％ＢＳＡにおいて西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｐ−０２２６，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共役されたポリクローナル抗ヒトＶＷＦで洗浄およびインキュベーションを行った。洗浄ステップ後、リン酸−クエン酸緩衝液中に０．４ｍｇ／ｍｌのオルト−フェニレンジアミン（Ｐ１０６３，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加した。着色は、３Ｍ硫酸で停止した。ウェルの吸光度は、４９２ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーで読み取った。吸光度は、試料中のＶＷＦ含有量に直接比例する。試料中のＶＷＦ：Ａｇ濃度は、ヒト血漿基準調製物（ＳＳＣ／ＩＳＴＨ２次的凝固標準物質、＃２）に対して計算した。
ＶＷＦ：ＲＣｏ活性の決定：ＶＷＦ：ＲＣｏ活性は、安定化血小板およびリストセチンＡ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）を含有する凍結乾燥したフォンウィルブランド試薬を用いて、製造業者の使用説明書に従って、ＢＣＳ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）分析計（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。試料からのＶＷＦ（リストセチン補助因子）は、リストセチンの存在下において安定化血小板の凝集をもたらす。結果として生じる凝集は、反応懸濁液の濁度を減少させる。５７０ｎｍにおいてＢＣＳ分析計で測定した吸光度の変化は、試料のリストセチン補助因子活性に比例する。試料のリストセチン補助因子活性は、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で産生された基準曲線を用いて定量化し、ＩＵ ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｍｌで報告する。
コラーゲン結合活性の決定：ＶＷＦ：ＣＢ活性は、製造業者の使用説明書に従って、市販のＥＬＩＳＡ（Ｔｅｃｈｎｏｚｙｍ ＶＷＦ：ＣＢＡ，Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で決定した。固定化されたヒトＩＩＩ型コラーゲンを有する事前に被覆したＥＬＩＳＡ検査片を、試料溶液中とともにインキュベートした。コラーゲン結合ＶＷＦは、ペルオキシダーゼ共役のポリクローナル抗ＶＷＦ抗体を添加することによって検出した。試料のＶＷＦ：ＣＢは、検査キットとともに提供され、Ｕ／ｍｌ ＶＷＦ：ＣＢで表される正常ヒト血漿で作製された基準曲線を用いて定量化した。
ＥＬＩＳＡ発色アッセイ（ＥＣＡ）によるＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ−結合能力の決定：ＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ相互作用は、Ｂｅｎｄｅｔｏｗｉｃｚらによって説明されるアッセイに基づいてＥＣＡで決定した。Ｂｅｎｄｅｔｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２（２）：５２９−５３８を参照されたい。市販のポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体Ａ０８２（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、マイクロタイターウェルに固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；６．５ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を洗浄緩衝液として使用した。試料希釈のため、およびブロッキング溶液として、０．１％脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液に添加した。一定量のｒＦＶＩＩＩ［０．２ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ発色活性（ＦＶＩＩＬＣ）］を、別々の管内で、希釈したＶＷＦ含有の試料（ＶＷＦ：Ａｇ濃度範囲０．１５６から１０ｍＩＵ／ｍｌ）と混合し、３７℃で２５分間インキュベートした。ｒＦＶＩＩＩ源は、第ＶＩＩＩ因子（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＡＤＶＡＴＥブランドに由来する凍結バルクであった。ｒＦＶＩＩＩバルクは、４０４６ＩＵ／ｍｌの発色ＦＶＩＩＩ活性を有し、ｒＦＶＩＩＩの５μｇ未満（約０．５単位）ＶＷＦ：Ａｇ／１０００ＩＵを含有した。ｒＦＶＩＩＩ産物は、−６０℃未満の一定分量で凍結保存し、アッセイ前に即時に解凍した。
このＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ複合体を、ブロックしたマイクロタイタープレートに移動し、室温で６０分間インキュベートした。非結合ＦＶＩＩＩは、洗浄緩衝液を用いたその後の洗浄ステップによって除去した。結合ＦＶＩＩＩは、試薬が微量のトロンビン、ＦＩＸａ、リン脂質およびＦＸを含有する、市販のＦＶＩＩＩ発色アッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍ ＦＶＩＩＬＣ試薬キット、Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で定量化した。このアッセイの原理は、ＦＶＩＩＩがトロンビンによって活性化され、したがって、ＶＷＦから解離され、その後、リン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムイオンを有する複合体を形成することである。この複合体は、ＦＸを、ＦＸａに活性化させて、次いで、発色基質を開裂させて、３７℃での動態モードを使用する４０５ｎｍのＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定される呈色反応をもたらす。全ての試料を連続的に希釈し、重複して分析した。受け取った（ｍＯＤ／分で）ブランク補正光学濃度は、対数目盛でＶＷＦ：Ａｇ濃度に対してプロットした。１ＩＵのＶＷＦが、１ＵのＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ活性を有すると仮定して、試料のＦＶＩＩＩ−結合活性を、正常基準血漿から構築された適合基準曲線から計算した。
０．１５６から１０ｍＩＵ／ｍｌ ＶＷＦ：Ａｇの適用した濃度範囲に対して、正常血漿のＶＷＦに結合している内在性ＦＶＩＩＩは、測定に影響を及ぼさなかった。試料のＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ活性は、基準曲線から読み取られる通りにＵ／ｍｌで表し、ＦＶＩＩＩ−結合能力は、試料中で測定されたＶＷＦ：Ａｇのパーセントで計算した。
表面プラズモン共鳴技術によるＶＷＦ−ＦＶＨＩ親和性の測定：非改変およびペグ化ＶＷＦを、製造業者の使用説明書に従って、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＧ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）装置のＣＭ５センサチップのフローセル上に一定水準まで固定化した。次いで、ＦＶＩＩＩ試料の一連の希釈は、「ｋｉｎｊｅｃｔ」モードを使用してチップに適用し、ＦＶＩＩＩを３分間会合および１０分間解離させた。これらの各サイクルの後、ＦＶＩＩＩをチップから除去（「再生」）し、実験は、新しいＦＶＩＩＩ試料で繰り返した。
フロー条件下での未変性ｒＶＷＦの存在下におけるＰＥＧ−ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ−結合能力の決定：一定量のｒＶＷＦを、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＧ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のＣＭ５センサチップのフローセル上に固定化した。異なる量のｒＶＷＦを、３７℃で５分間５ＩＵ／ｍｌ ｒＦＶＩＩＩとともにインキュベートして、複合体を形成し、次いで、固定化されたｒＶＷＦを有するフローセルに注入した。固定化されたｒＶＷＦに結合しているある量の遊離ＦＶＩＩＩは、０．１から５ＩＵ／ｍｌの範囲においてｒＶＷＦの非存在下でｒＦＶＩＩＩを注入することによって確立された、基準曲線から計算した。複合体に残っているｒＦＶＩＩＩを計算し、ｒＶＷＦの非存在下において結合している追加のｒＦＶＩＩＩのパーセントで表した。
ＶＷＦ開裂プロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）に対する感受性の測定：ＡＤＡＭＴＳ１３に対するｒＶＷＦの感受性は、ＶＷＦをアンフォールドする変性条件下において事前に活性化されたＤＡＭＴＳ１３の濃度増加とともに、共役体をインキュベートすることによって調査した。ＶＷＦの分解は、インキュベーション前および４時間後に、ＶＷＦの多量体サイズに依存するコラーゲン結合（ＶＷＦ：ＣＢ）活性によって測定した。多量体数の低下および特定のサテライトバンドの形成は、多量体分析によって可視化した。
ｒＶＷＦの分解のために、正常ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋｓ，ＫＳ，ＵＳＡ）ＡＤＡＭＴＳ １３源として使用した。血漿の希釈中のＡＤＡＭＴＳ１３は、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０の存在下において３７℃で３０分間ＢａＣｌ２を用いて活性化し、一定量のｒＶＷＦ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０で事前に希釈）で混合し、３７℃で４時間さらにインキュベートした。インキュベーション混合物は、６μｇ／ｍｌの未変性またはペグ化ｒＶＷＦ共役体および１から３３ｍＵ／ｍｌのＡＤＡＭＴＳ１３を含有した。反応は、Ｎａ２ＳＯ４を添加することによって停止し、インキュベーション混合物は、その後２５００ｇで５分間遠心分離させ、上清をさらなる分析のために使用した。
コラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢ）を決定した。高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を、６．５ｍＭリン酸水素二ナトリウム二水和物、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）中で１００μｌの１．５μｇ／ｍｌヒトＩＩＩ型コラーゲン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩事前被覆し、その後、３０分間室温で２００μｌの「Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｉｎ ＰＢＳ」（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）でブロックした。遠心分離した消化混合物を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１０％のブロッキング溶液を含有するＰＢＳで１／５に希釈し、１００μｌのこれらの希釈をブロックしたウェルに添加した。室温での２時間のインキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１０％のブロッキング溶液を含有するｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中で１／１００００に希釈した、１００μｌのポリクローナル西洋わさびペルオキシダーゼ共役した抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｐ−０２２６，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の溶液で、プレートを１時間さらにインキュベートした。各ステップの間、マイクロタイターウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２５０μｌＰＢＳで３回洗浄した。呈色反応は、１００μｌの「ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）の添加によって達成し、５分間のインキュベーション後に、１００μｌ １Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を終了させた。吸光度は、ＥＬＩＳＡリーダー６８０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して４５０ｎｍにおいて測定した。陰性対照として、通常の血漿の代わりに、同じ手順で生理食塩水を使用した。０．０１７Ｕ／ｍｌ ＡＤＡＭＴＳ１３を有する試料は、下記の「ＶＷＦ多量体分析」で説明するように、低および高分解能多量体分析に曝露した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法：ＶＷＦ試料（２０ｍｌＵ、レーン当たり０．２μｇタンパク質に相当）を、勾配（３〜８％）Ｔｒｉｓ−酢酸ゲルに添加し、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって説明される通りに、還元条件下で電気泳動を、続いて銀染色法を行った。分子量標準として、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ ｓｔａｎｄａｒｄを使用した（２５０〜１０キロダルトン，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色法：ＶＷＦ試料（１００ｍｌＵ、レーン当たり１μｇタンパク質に相当）を、勾配（３〜８％）Ｔｒｉｓ−酢酸ゲルに適用し、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって説明される通りに、還元条件下での電気泳動、続いてクーマシー染色法を行った。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ ｓｔａｎｄａｒｄを、分子量標準として使用した（２５０〜１０キロダルトン／Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
ＶＷＦに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットＶＷＦ試料（０．５５ｍＩＵ、レーン当たり５．５ｎｇタンパク質に相当）を勾配（３〜８％）Ｔｒｉｓ酢酸ゲルに適用し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上への、還元条件下での電気泳動、続いて標準的なブロッティング手順を行った。ＶＷＦバンドを可視化するために、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（Ａ−０８２，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１次抗体として使用した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを、２次抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）として適用した。ブロットは、ＡＬＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で顕色した。全種類の着色マーカー（２５０〜１０キロダルトン、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を分子量標準として使用した。
ＰＥＧに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットＶＷＦ試料（５．５ｍｌＵ、レーン当たり５５ｎｇタンパク質に相当）を勾配（３〜８％）Ｔｒｉｓ酢酸ゲルに適用し、ＰＶＤＦ膜上への、還元条件下での電気泳動、続いて標準的なブロッティング手順を行った。ＰＥＧを可視化するために、ポリクローナルウサギ抗ヒトＰＥＧ抗体を１次抗体として使用した。抗ＰＥＧ抗体は、ペグ化タンパク質による免疫化によって、ウサギ中に産生された。ウサギ血清のＩｇＧ画分は、タンパク質Ｇセファロース４Ｂ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上での親和性クロマトグラフィ、続いて、特異的な陰性免疫吸着によって精製した。ＡＬＰで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）を２次抗体として適用した。ブロットは、ＡＬＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で顕色した。全範囲の着色マーカー（２５０〜１０キロダルトン、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を分子量標準として使用した。
ＶＷＦ多量体分析ｒＶＷＦ調製物のサイズ分布を、高分解能（２．５〜２．７％アガロース）条件を使用して、高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動によって分析した。試料を、０．３〜１．０ＩＵ／ｍｌ ＶＷＦ：Ａｇの範囲内で同じ濃度まで希釈し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＳＤＳ緩衝液とともにインキュベートした。多量体を、非還元条件下で、アガロースゲル上で分離した。
ＶＷＦ多量体、およびＶＷＦ多量体上のＰＥＧの分布は、ＰＶＤＦ−膜へのエレクトロブロティング後に、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（Ａ−０８２，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはポリクローナルウサギ抗ＰＥＧ抗体で、続いて、ＡＬＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＡＬＰ共役のヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＋Ｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｏｈａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ ＵＫ）で免疫染色することによって可視化した。
血友病モデルとして、ＦＶＩＩＩ−ノックアウトマウス［Ｌａｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．ＪＪ）（Ｉ）：１１９−１２１］を使用した。マウスは、重症血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ＜０．０１ＩＵ／ｍｌ）に罹患したが、正常レベルのＶＷＦ（ヒトＶＷＦ基準に対して約０．１５ＩＵ／ｍｌ）を有し、ヒト血友病Ａを模倣した。
ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの適用：Ｂａｘｔｅｒからの組換えＦＶＩＩＩ（２１４ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌ）を、この実施例の全ての実験で使用し、ｒＶＷＦとともに同時注入した。凍結乾燥した最終の容器を２〜８℃で保存し、使用前に再構成した。溶解したｒＦＶＩＩＩおよび非ペグ化またはペグ化ｒＶＷＦを、２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．２％マンニトール、０．８％トレハロース、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１％ヒトアルブミン、ｐＨ７．４緩衝液と混合して、注入に適した濃度を達成した。混合物を等分し、−２０℃で凍結させ、適用直前に解凍した。標的用量は、２００ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｃおよび１．６から２．１ｍｇ／ｋｇＶＷＦであった。濃度は、解凍した試料から再度測定し、適用した用量を計算した。用量を図の説明文に示す。１０ｍｌ／ｋｇ体重を、尾静脈より注射し、５〜６匹のマウスの群を、５分、３時間、６、９、１６および２４時間後、ならびに必要であれば、３２および４２時間後に心臓穿刺によって出血させた。９容量の血液を、１容量の３．８％クエン酸ナトリウムと混合し、３０００ｇで１０分間即時に遠心分離させた。上清を３０００ｇで５分間再度遠心分離させ、血漿を分離し、一定分量で凍結させて、分析のために−６０℃未満で保存した。
マウス血漿中のＦＶＩＩＩ活性の決定：ＦＶＩＩＩ活性は、ＥＬＩＳＡ発色アッセイによるＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ結合能力の決定に関して上記に記載したように、アッセイ原理に従った発色方法で決定した。基質から解離したパラニトロアニリン（ｐＮＡ）の時間経過を、動態モードを使用して４０５ｎｍのマイクロプレートリーダーで測定した。反応の傾斜は、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に比例する。試料中のＦＶＩＩＩ濃度は、ヒト血漿基準調製物と比べて計算し、ＷＨＯ血漿基準（ヒト血漿中のＦＶＩＩＩおよびＶＷＦに対する第５ＩＳ、ＮＩＢＳＣ番号０２／１５０）に対して較正して、ＩＵ／ｍｌで表した。
マウス血漿中のＶＷＦ抗原の決定：ＶＷＦ：Ａｇは、体外解離実験のための、および薬物動態学的研究からの生体外血漿試料の分析のためのサンドイッチＥＬＩＳＡに関して上述したようなサンドイッチＥＬＩＳＡで決定した。試料のＶＷＦ：Ａｇ濃度は、ヒト血漿基準調製物（ＳＳＣ／ＩＳＴＨ２次的凝固標準物質、＃２）と比べて計算した。マウスＶＷＦのベースラインレベルを減算した。マウス血漿におけるアッセイの定量限界は、０．０３ＩＵ／ｍｌのＶＷＦ：Ａｇであった。
ヒトＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの循環半減期パラメータの計算：ＦＶＩＩＩレベルを分析するために、ｔｏ＝０時間に対する濃度は、ＦＶＩＩＩ欠損マウスを研究したように、ゼロに設定した。ＶＷＦ：Ａｇレベルを分析するために、ｔｏ＝０時間に対する濃度をゼロに設定し、未処置マウスの算術平均濃度を、その後の時点で平均濃度から減算した。経時的なＦＶＩＩＩレベルは、ゼロから２４時間の薬物動態パラメータＡＵＣ、最終脱離速度および平均滞留時間を使用して要約した。経時的なＶＷＦ：Ａｇレベルは、ゼロから２４時間の薬物動態パラメータＡＵＣによって要約した。
０から２４時間の濃度対時間曲線（ＡＵＣ）下面積：０から２４時間の濃度対時間曲線（ＡＵＣ）下面積は、個々の時点で観察された濃度の算術平均を使用して、線形台形公式で計算した。用量とＡＵＣとの間に直線関係が存在することが想定された。この想定の下に、異なる項目に対するＡＵＣは、異なる用量が投与される場合の用量に対して調節した。用量調節は、計算したＡＵＣを、投与された体重１ｋｇ毎の用量で除算することによって行った。
最終脱離速度：最終脱離速度（λ）は、バイアス補正で修正した最後の３つの時点における個々の濃度の自然対数の算術平均を使用して推定した。Ｗｏｌｆｓｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．３２（５−６）：７５７−７６６を参照されたい。
平均滞留時間：平均滞留時間（ＭＲＴ）は、ＡＵＣ０〜無限で除算したＡＵＭＣ０〜無限で計算した。ＡＵＭＣ０〜無限およびＡＵＣ０〜無限は、異なる時点および３点尾部面積補正に対して観察された濃度の算術平均を使用して線形台形公式で計算した。尾部面積補正は、項目毎に最後の３つの時点で観察された算術平均の対数線形フィッティングによって計算した。
結果
ＰＥＧ−ｒＶＷＦの機能パラメータ：ＶＷＦの異なる生物学的機能を、異なるパラメータによって特徴付けた。ＶＷＦ：ＣＢ、ＶＷＦ：ＲＣｏおよびＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢは、止血の第１段階の１ つであるＶＷＦ媒介の血小板粘着に必要とされる、コラーゲンおよび血小板結合部位の完全性を特徴付けるために測定した。ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ能力および親和性は、ＶＷＦのシャペロン機能に必要とされる、ＦＶＩＩＩ−結合部位の有効性を説明する。表３は測定した値を要約し、一方、計算した比率および特異的活性を表４に要約する。
解離可能なＰＥＧ試薬との共役の推定される作用を調査するために、全工程を一通り行ったが、ペグ化されなかった模擬調製物（対照）もまた製作した。この調製は、対照と同様の活性を有し、工程がｒＶＷＦに対して悪影響を及ぼさなかったことを確認した。
全てのパラメータは同様に影響を受けたため、ＶＷＦ：Ａｇレベルのパーセントで表されるＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ能力は、ごく僅かに減少した。
６０Ｋ試薬でのペグ化は、低度のペグ化でさえも特異的活性に実質的減少作用を及ぼした。ペグ化度（Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ中およびＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ高度共役体）の増加は、全ての活性の減少、特に、ＶＷＦ：ＣＢおよびＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢの著しいな減少をもたらし、初期活性のほんの数パーセントのみをＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ高度共役体に対して検出することができた。
解離可能なＰＥＧ試薬でのペグ化は、低度のペグ化においてさえも、特異的活性の大幅な減少をもたらした。試薬のＭＷが高いほど、観察した活性の減少は大きかった。同じＭＷの「短」および「長」誘導体間に大きな差は見られなかった。
ＦＶＩＩＩ親和性は、固定化されたｒＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ間の均一な１：１相互作用を想定して決定し、会合および解離定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置の「Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」プログラムのラングミュアモデルを使用して決定した。ペグ化ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ相互作用の親和性定数（ＫＤ）は、適用したＰＥＧ試薬の種類またはＭＷとは無関係に、非ペグ化ＶＷＦで測定されたものと同じ桁のままであった。
Figure 2010514773
 全ての結果は、新たに解凍した試料から取得したもので、少なくとも２回の測定の平均である。
表４：ｒＶＷＦ共役体の特異的活性
Figure 2010514773
 表４に示した値は測定データから計算した。
解離可能なｒＶＷＦ共役体：安定な共役体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と同様に、成熟ｒＶＷＦは、１５０キロダルトンまで下がるいくらかの微量バンドとともに、約２６０キロダルトンのＭＷを有する顕著な単一バンド（モノマー）として現れた。非ペグ化ｒＶＷＦモノマーの残量は、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ調製物内に、特に４０Ｋ誘導体内に依然として存在していた。
ペグ化は、より高いＭＷへのバンド移行をもたらした。それは適用したＰＥＧ試薬のＭＷと相関している。対照調製物に対する構造変化は見られなかった。
タンパク質染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を検証するために、ゲルを、図９のパネルＡに実証するようにポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体で免疫ブロットした。非修飾の未変性ｒＶＷＦ１３３Ｐｌは、いくらかの微量かつ非関連分解バンドとともに、抗ＶＷＦ免疫ブロットにおいて単一ＶＷＦモノマーとして現れた。模擬調製物（対照）において構造変化は検出されなかった。
全ての解離可能な共役体は、より高いＭＷ範囲内で非ペグ化バンドおよび一部の特徴的なバンドを示した。増加したバンドの数は、モノ、ジ、トリおよび高ペグ化モノマーを表している可能性がある。これらのバンドのＭＷは、適用したＰＥＧ試薬のＭＷと相関していた。
図９のパネルＢは、ブロットが、ポリクローナル抗ＰＥＧ抗体で染色され、より高いＭＷバンドがＰＥＧを含有したことが確認された場合のＰＥＧに対する免疫ブロットを示す。非ペグ化材料ｒＶＷＦ１３３ＰｌおよびｒＶＷＦ対照への反応は観察されなかった。より低いＭＷバンドは、全ての試料中に現れ、試料調製時に解離された試料中の一部の遊離ＰＥＧを表す可能性が高い。
ＶＷＦ多量体分析によって示されるペグ化ｒＶＷＦの構造的完全性：多量体組成物およびこのパラメータへのペグ化の作用を、低分解能（１％）ゲルを使用する非還元アガロースゲル電気泳動によって調査し、多量体および高分解能（２．５％）ゲルの数を決定して、多量体の微細構造を調査した。
安定な共役体と同様に、ＰＥＧサイズの増加は、低分解能アガロースゲル電気泳動（図１０のパネルＡのぼやけた領域）において、高ＭＷ多量体範囲内での解像度の減少をもたらし、多量体の正確な数を決定することが困難であった。ＰＥＧ（図１０、パネルＢ）に対する免疫ブロットは、明らかに全ての多量体がペグ化されたことを示し、これは、各多量体が、少なくとも１つのペグ化ＶＷＦモノマーを含有したことを意味する。
高分解能アガロースゲル（図１１）は、Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短低に対する微量なＭＷ増加およびＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長低共役体に対する中度の増加とともに、より高い分子量へのＭＷＦ多量体の大規模かつ明らかな移行を示した（パネルＡ）。ペグ化度と相関しているこれらのデータを表３に記載する。４０Ｋおよび特に６０Ｋ共役体の多量体分析は、特徴的バンドではなく、ぼやけた領域をもたらした。
図１１のパネルＢは、明らかに全ての多量体がペグ化されたことを確証し、これは、各多量体が、少なくとも１つのペグ化ＶＷＦモノマーを含有したことを意味する。６０Ｋ共役体に対して、一部のより低いＭＷバンドが抗ＰＥＧ抗体で染色され、これは、電気泳動的条件下で恐らく解離された一部の遊離ＰＥＧを表している可能性がある。
フロー条件下での非修飾ｒＶＷＦの存在下におけるペグ化−ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能力の決定：ペグ化ｒＶＷＦと非共有的に複合体を形成したｒＦＶＩＩＩで治療される血友病Ａ患者は、正常レベルの内在性ＶＷＦを有する。したがって、このＶＷＦが、注入されるｒＦＶＩＩＩにおいてペグ化ｒＶＷＦと競合するかどうかの問題が生じた。この問題に対処するために、ペグ化ｒＶＷＦと複合体を形成したＦＶＩＩＩの未変性ｒＶＷＦとの競合を、フロー条件下での未変性ｒＶＷＦの存在下におけるＰＥＧ−ｒＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合能力の決定に関して上述したとおり、Ｂｉａｃｏｒｅシステムで測定した。一定量の非修飾ｒＶＷＦを、Ｂｉａｃｏｒｅ機器のセンサチップ上に固定化し、５ＩＵ／ｍｌ ｒＦＶＩＩＩを含有する未変性またはペグ化ｒＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ複合体、および増加量のＶＷＦ：Ａｇを注入した。注入したＶＷＦと複合体を形成したｒＦＶＩＩＩは、追加したＦＶＩＩＩのパーセントで表した。
図１２は、解離可能なペグ化ｒＶＷＦ共役体との複合体内に残存したｒＦＶＩＩＩのパーセントを、μｇｒＶＷＦ／ＩＵ ＦＶＩＩＩの関数として示す。星記号（＊）の線は、全てのＦＶＩＩＩを複合体内に維持するために、最も低いＶＷＦ対ＦＶＩＩＩの比率（約１μｇ／ＩＵ）を必要とする未変性ｒＶＷＦを示す。十字（＋）の線は、約５０％のプロＶＷＦおよび成熟ＶＷＦを含有する自家ｒＶＷＦ調製物（ｒｐｒｏＶＷＦ１９８）を表す。この調製は、プロペプチドがＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合部位を遮蔽するために、あまりＦＶＩＩＩを結合することができない。Ｂｅｎｄｅｔｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２（２）：５２９−５３８。
ＥＬＩＳＡベースのＶＷＦ：ＦＶＩＩＩ結合アッセイ（ＥＣＡ）は、解離可能な共役体の結合能力間に大きな差がなかったことを明らかにした（表５）。全て、未変性ｒＶＷＦと比較して減少した能力を示した。全ての共役体は、１μｇＶＷＦ／Ｕ ＦＶＩＩＩの比率を上回るＦＶＩＩＩの１００％結合を示した。これらの結果は、動物モデルと良好な相関がある。
ＡＤＡＭＴＳ１３に対する感受性：生理学的条件下で、ＶＷＦの超大型多量体を、ＶＷＦ−開裂プロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）で分解し、したがって、これは、これらのＶＷＦの超大型多量体によって誘発され得る血小板凝集を防止する役割を果たす。発現されたｒＶＷＦは、ＡＤＡＭＴＳ１３に決して曝露されなかったため、ＡＤＡＭＴＳ１３に対するその感受性は、ｒＶＷＦ産物の構造的完全性の重要な尺度である。ＡＤＡＭＴＳ１３誘発の生理学的分解は、変性条件下でｒＶＷＦおよびＡＤＡＭＴＳ１３をインキュベートすることによって、体外で模擬させるすることができる。
図１３は、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度の関数として、共役体のＶＷＦ：ＣＢ活性（ＡＤＡＭＴＳ１３の非存在下において測定したＶＷＦ：ＣＢ活性％）の相対的変化を示す。Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ共役体は、非常に低いＶＷＦ：ＣＢ活性を有した（表４）。したがって、それを試験することはできなかった。全ての共役体は、増加量のＡＤＡＭＴＳ １３とともにインキュベートしたＶＷＦ：ＣＢ活性が同様に徐々に失われることを示した。ペグ化共役体は、それらの親未変性ｒＶＷＦよりも、ＡＤＡＭＴＳ１３に対して僅かに高い感受性を示した。多量体分析は、より高い分子量の多量体の脱離を示した（図１４）。全ての調製物は、ＡＤＡＭＴＳ１３に対して同様の感度を示した。
解離可能なＰＥＧ−ｒＶＷＦの体外解離：ｒＶＷＦからのＰＥＧ部分の動態を調査するために、ペグ化ｒＶＷＦ試料を、ヘペス緩衝液（２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ショ糖、１００ｍＭ ＴｒｉｓでｐＨ約７．５に調節）で約１００μｇ／ｍｌまで希釈した。対照として、未変性ｒＶΛＶＦを同じ方法で処置した。全ての試料を８日間外気温で保持した。副試料は、毎日同じ時間に取り出し、等分し、凍結させて、分析まで−８０℃で保存した。
表５は、計算したＶＷＦ：Ａｇ／タンパク質比率（ＩＵ／ｍｇ）を示す。未変性ｒＶＷＦ１３３Ｐｌは、全時間にわたって安定であった。ＶＷＦ：Ａｇ値は、異なるＰＥＧ−ｒＶＷＦ共役体間でのＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質の比率の変動のために、出発点（０時間）で異なる。だが、６つの全ての誘導体が、異なる程度ではあるが、インキュベーション時にＶＷＦ：Ａｇレベルの増加を示した。Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ短低共役体を除いて、ＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質の比率は、未変性ｒＶＷＦの範囲に達した。
Figure 2010514773
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 ＊ＶＷＦ：緩衝液中の解離反応後の６０Ｋ長共役体のＦＶＩＩＩＢは、非平行希釈曲線のために測定できなかった。
表６は、Ｕ／ｍｇタンパク質として計算した特異的ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ能力の変化を示す。インキュベーション時間の間、ＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢの完全な回復が評価した全バッチに観察された。
ｒＶＷＦの分解の可能性およびペグ化グレードの変化を評価するために、試料を、還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、ポリクローナル抗ＶＷＦ抗体およびポリクローナル抗ＰＥＧ抗体を用いた免疫ブロットに曝露した（図１５）。図１５に示すように、全てのＰＥＧ−ｒＶＷＦ誘導体は、中等度に増加したｐＨ（７．５〜７．７）とともに、緩衝液中の体外解離後のＰＥＧの徐々の解離を示した。「短」および「長」の共役体の解離挙動に対応して、ペグ化度のいくらかの差が、長いインキュベーション時間後に観察することができた。対照的に、恐らく、インキュベーション緩衝液での希釈後に、第１の試料中に既に示された遊離ＰＥＧの存在のために、インキュベーションの間に遊離ＰＥＧにおいて大幅な増加はなかった。免疫ブロットが７５キロダルトンを超えるＭＷ範囲のみを示したため、２０Ｋ共役体に対して可視化された遊離ＰＥＧはなかった。
血友病マウスモデルにおけるペグ化ｒＶＷＦおよび同時注入したｒＦＶＩＩＩの薬物動態：ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスは、１．６〜２．１ｍｇｒＶＷＦ対２００ＩＵｒＦＶＩＩＩ／ｋｇ（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量に基づく）の目標比率で、ｒＶＷＦ／ｒＦＶＩＩＩの混合物またはペグ化ｒＶＷＦ／ｒＦＶＩＩＩのいずれかを注入した。実験において、時間群当たり６匹のマウスを各共役体に使用した。
図１６〜図２１は、物質注入後のＶＷＦ：Ａｇ（パネルＡ）およびＦＶＩＩＩ活性（パネルＢ）の血漿レベルの変化を示す。注入した材料の正確な量を、適した図の説明文に示す。
概して、全てのペグ化ｒＶＷＦが、未変性対照に対して、薬物動態の向上を示した（パネルＡ）。６０Ｋ ＰＥＧ共役体は、注入後に検出可能なＶＷＦ：Ａｇの増加をもたらし、これは、ＰＥＧ鎖の解離からの影響である可能性があり、したがって、遮蔽したエピトープは検出抗体に接近可能となる。ＰＥＧ−ｒＶＷＦと一緒に注入したｒＦＶＩＩＩは、未変性ｒＶＷＦと同時注入したｒＦＶＩＩＩよりも低い程度に脱離した（パネルＢ）。薬物動態パラメータの向上の度合いは、統計的方法で計算した（表７および表８参照）。
体内実験のために、対照混合物（未変性ｒＶＷＦおよびｒＦＶＩＩＩ）を、１つまたは２つの候補混合物（ＰＥＧ−ｒＶＷＦおよびｒＦＶＩＩＩ）を有する１つの実験セットにおいて比較し、脱離曲線を構築した（図１６〜図２１）。解離可能なＰＥＧ−ｒＶＷＦ候補の比較分析を可能にするために、脱離曲線を正規化した。適用の５分後に取得した血漿レベルを１００％に設定し、その後の全レベルをそれに対して計算した。調査全体を通じて行った全ての対象群の平均（各時間群でｎ＝４８マウス）を、比較のために全ての候補と一緒に図２２に示す。
比較分析より、全てのペグ化ｒＶＷＦは、未変性ｒＶＷＦと比較して、ＦＶＩＩＩ欠損マウス中でより長く循環したことが確認された。ＰＥＧ−ｒＶＷＦと一緒に注入したｒＦＶＩＩＩは、対照混合物（ｒＦＶＩＩＩおよび変性ｒＶＷＦ）よりも優位な脱離を有した。
ＶＷＦ：Ａｇに対する曲線下面積は、適用したＶＷＦ：Ａｇ単位と相対的に、および適用したタンパク質の量との関連で計算した。ＰＥＧ−ｒＶＷＦ候補対対照に対する相対的増加因子を表７に示す。
Figure 2010514773
 ＰＥＧ−ｒＶＷＦ抗原に対する曲線下面積は、注入したＶＷＦ抗原単位に用量調節した時に、２．９から５．１の範囲内で全ての候補に対して増加した。増加は、全ての候補に対して統計的に有意であった。タンパク質用量と比べて計算した場合に、ＡＵＣは、１．５から３．２倍の間で増加し、統計的有意性は計算されなかった。
図２３は、９５％信頼区間とともに用量調節ＡＵＣ値を示す。
表８は、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ候補とともに同時注入したｒＦＶＩＩＩに対して計算された半減期パラメータを要約する。
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 ｓ：有意、ｎｓ：有意でない
表８に示すように、全てのペグ化ｒＶＷＦ候補が、同時注入ｒＦＶＩＩＩに対する用量調節ＡＵＣを統計的に有意に増加させた。ＦＶＩＩＩ半減期は、全ての候補によって有意に変化しなかった。平均滞留時間は、１．２から２．０倍に上昇したが、有意性は、使用した統計的モデルでは計算することができなかった。
図２４は、９５％信頼区間とともに、ＦＶＩＩＩに対する用量調節ＡＵＣ値および末期半減期を示す。
同時注入ＦＶＩＩＩに対する用量調節ＡＵＣは、未変性ｒＶＷＦ対照と比較して、全てのペグ化ｒＶＷＦ候補で高かった。対照的に、ペグ化ｒＶＷＦの存在下におけるＦＶＩＩＩ末期半減期は、ｒＦＶＩＩＩおよび未変性ｒＶＷＦ対照で取得した半減期と非常に似ており、これは、図２２の後の時点でのＦＶＩＩＩ活性曲線の平行走行を反映する。
ＦＶＩＩＩに対する平均滞留時間（図３１）は、ペグ化ｒＶＷＦ候補とともに同時注入された時に常に増加した。
概して、全てのペグ化ｒＶＷＦ共役体が、いかなる分解もなく、多量体構造を保った。対照的に、全ての機能的活性は減少した。低いＶＷＦ：ＲＣｏおよびＶＷＦ：ＣＢ活性は、ＶＷＦのシャペロン機能に影響を及ぼさなかった。これは、血小板粘着を回避する利点を有する可能性さえある。静的アッセイで測定されたＶＷＦ：ＦＶＩＩＩＢ能力の低下は、せん断条件下で向上し、ＰＥＧ−ｒＶＷＦが循環中に適した量のＦＶＩＩＩを保有することが可能であることが示唆される。結論として、全ての体内データを統合して考えると、全てのペグ化ｒＶＷＦ候補は、ＦＶＩＩＩ欠損マウス中のＶＷＦ：Ａｇに対する薬物動態プロファイルの向上を示し、これは、同時注入ｒＦＶＩＩＩに対する薬物動態プロファイルの向上と平行関係にある。
（実施例６）
ペグ化ＦＶＩＩＩの体外および体内実験
未変性組換えＦＶＩＩＩは、Ｂａｘｔｅｒ ＡＧの認可された凍結乾燥薬物製品である、アドベイトｒＡＨＦ−ＰＦＭ［抗血友病因子（組換え）血漿／アルブミンを含まない方法、バルク原体］である。このｒＦＶＩＩＩバルク物質は、５０ｍＭヘペス、５ｍＭ ＣａＣｌ２、３５０ｍＭ ＮａＣｌおよびｐＨ６．９に調節した０．１％ポリソルベート８０の緩衝液中で処方した。このｒＦＶＩＩＩの分析データを表９に示す。タンパク質含有量は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して決定して、特異的活性は、ＦＶＩＩＩ発色活性（ＩＵ）／タンパク質（ｍｇ）の比率で表す。ｒＦＶＩＩＩバルクは、ｒＦＶＩＩＩの２．３μｇ未満ＶＷＦ：Ａｇ／１０００ＩＵを含有した。還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続くポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体での免疫ブロットは、ＦＶＩＩＩの完全なドメイン構造を示した（図２６）。
Figure 2010514773
 ｒＦＶＩＩＩのリジン残基のアミノ基を介した解離可能な結合でのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体を、実施例２Ａ、２Ａ１、２Ｂ、２Ｂ１、２Ｃ、４Ａ、４Ｂ、４Ｂ１、および４Ｃに従って調製した。分枝ＰＥＧ誘導体は、それぞれが２つの異なる解離特性（短いおよび長い解離時間）を持つ２０Ｋ、４０Ｋおよび６０Ｋの分子量を有した。解離可能なＰＥＧ試薬での共役条件の推定される作用を調査するために、全工程を一通り行ったが、ペグ化されなかった模擬調製物（対照）もまた製作した。
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのタンパク質含有量は、標準物質として非修飾ｒＦＶＩＩＩを用いるＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）の「ＤＣタンパク質アッセイ」を使用して決定した。
＊分子当たりのＰＥＧ数は、比色分析決定を使用して決定した。
＊＊分子当たりのＰＥＧ数は、ＨＰＬＣ方法によって決定した。
−：利用可能なデータなし
残りの遊離ＰＥＧは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのヨウ化バリウム染色によって決定した。
長時間の体外および体内分析試験のために、３つの共役体を再合成して調査を完了する必要があった。ＰＥＧ対ＦＶＩＩＩ比率のいくらかの差が、２０Ｋｂｒ長およびＬｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ誘導体に対して、再合成共役体と、第１のバッチとの間で観察され、これは使用した異なる分析方法が原因であると説明され得る。ヨウ化バリウム染色での調査では、遊離ＰＥＧは、いかなる試料溶液中にも残らなかった。
ＦＶＩＩＩ活性の決定：ＦＶＩＩＩ活性を発色方法で決定した。アッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ含有の試料を、カルシウムを含有する緩衝液中でトロンビン、活性化因子ＩＸ（ＦＩＸａ）、リン脂質および第Ｘ（ＦＸ）因子と混合した。ＦＶＩＩＩは、トロンビンによって活性化され、その後リン脂質、ＦＩＸａおよびカルシウムイオンとの複合体を形成する。この複合体は、ＦＸをＦＸａに活性化させ、次いで、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）を解離する特異的発色基質を開裂させて、呈色反応をもたらす。
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体の分析のために、試料および基準を、ヒトＦＶＩＩＩ欠損血漿中で約１ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ活性に事前に希釈し、０．５から０．００８ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍの範囲に希釈緩衝液でさらに希釈した。基質から解離したｐＮＡの時間経過は、動態モードを使用して４０５ｎｍのマイクロプレートリーダーで測定した。反応の傾斜は、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に比例する。試料中のＦＶＩＩＩ濃度は、組換えＦＶＩＩＩ濃縮物標準と比べて計算し、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）濃縮物基準（ＷＨＯ６）に対して較正して、ＩＵ／ｍｌで表した。アッセイの定量限界は、０．０３ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩであった。
酵素連結の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＦＶＩＩＩ抗原の決定：ＦＶＩＩＩ抗原レベルは、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から取得したアッセイキットを使用して、一部微修正を加えた製造業者の使用説明書に従って決定した。高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）は、１００μｌ／ウェルのポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体で被覆し、室温で２時間インキュベートした。試料は、キットからの希釈緩衝液で０．００７８から０．５ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ：Ａｇまで希釈した。次いで、プレートは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：６．５ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄した。１００μｌの希釈した試料を、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄ステップ後、１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ共役のポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（＃ＥＩＡ８−００１５Ｒｌ，Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）をプレートに添加した。ペルオキシダーゼ活性は、基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）としてテトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）を使用して検出した。顕色強度は、４５０ｎｍのＥＬＩＳＡリーダーで測定した。標準物質として、ヒト正常血漿プール（凝固基準、ロット１Ｒ９２００３Ｉ，Ｂａｘｔｅｒ）および対照として組換えｒＦＶＩＩＩバルク（アドベイト番号Ｂ０２０６０００−０５／０１）を使用した。ＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度は、標準的な調製と比べて計算し、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ ＩＵ／ｍｌで表した。
表面プラズモン共鳴技術によるＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ親和性の測定：未変性ｒＶＷＦは、製造業者の使用説明書に従って、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＧ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）装置のＣＭ５センサチップのフローセル上に一定水準まで固定化した。次いで、未変性およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料の一連の希釈を、「ｋｉｎｊｅｃｔ」モードを使用してチップに適用し、ＦＶＩＩＩを３分間会合および１０分間解離させた。これらの各サイクルの後、ＦＶＩＩＩをチップから除去（「再生」）し、実験は、新しいＦＶＩＩＩ試料で繰り返した。
ＦＶＩＩＩに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット：ＦＶＩＩＩ試料（１００ｍＩＵ、レーン当たり１０ｎｇタンパク質に相当）を、勾配（４〜１２％）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに適用し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上への、軽度の還元条件下での電気泳動、続いて標準的なブロッティング手順を行った。ＦＶＩＩＩバンドを可視化するために、ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（ＣＬ２００３５Ａ；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、モノクロナール抗ヒト重鎖Ａ２ドメイン抗体（ＯＢＴ００３７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）またはモノクロナール抗ヒト軽鎖Ａ３ドメイン抗体（１０１０４；ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を１次抗体として使用した。２次抗体として、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したウサギ抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ１３０−１０１ＡＰ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）をポリクローナル抗体に対して、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ９０−２１６ＡＰ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ．）をモノクロナール抗体に対して適用した。ブロットは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ．ＵＳＡ）のＡＬＰ着色キットで顕色した。全範囲の着色マーカー（２５０〜１０キロダルトン、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を分子量標準として使用した。
ＰＥＧに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット：ＦＶＩＩＩ試料（３００ｍＩＵ、レーン当たり３０ｎｇタンパク質に相当）を、勾配（４〜１２％）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに適用し、ＰＶＤＦ膜上への、還元条件下での電気泳動、続いて標準的なブロッティング手順を行った。ＰＥＧを可視化するために、ポリクローナルウサギ抗ヒトＰＥＧ抗体を１次抗体として使用した。抗ＰＥＧ抗体は、ペグ化タンパク質による免疫化によって、ウサギ中に産生された。ウサギ血清のＩｇＧ画分は、タンパク質Ｇセファロース４Ｂ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上での親和性クロマトグラフィ、続いて、特異的な陰性免疫吸着によって精製した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ１２０−２０１ＡＰ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）を２次抗体として適用した。ブロットは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ．ＵＳＡ）のＡＬＰ着色キットで顕色した。全範囲の着色マーカー（２５０〜１０キロダルトン、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を分子量標準として使用した。
ＦＩＸａ補助因子活性アッセイ：トロンビン特異的阻害剤（Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＴＨ，Ｐｅｎｔｈａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下で、１ＩＵ／ｍｌ（それらの発色活性に従って）まで希釈した未処置またはトロンビン活性の未変性ｒＦＶＩＩＩａおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料を、ＦＩＸａ、ＦＸ、リン脂質（ＰＬ）小胞［６０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）および４０％ホスファチジルセリン（ＰＳ）から成り、どちらもＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ（Ａｌａｂａｓｔａ，Ａｌ，ＵＳＡ）から］およびＣａＣｌ２の調製混合物に添加した。この反応混合物を３７℃でインキュベートし、複合体形成およびその後のＦＸａ生成を可能にした。副試料は、最大３０分間の規定の間隔で取り除き、およびＦＸａによって選択的に開裂される発色基質に添加した。基質緩衝液は、これ以上のＦＸａ生成を停止するために、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有した。インキュベーションの１５分後、反応を酢酸の添加によって終了させた。ＦＸａ濃度に比例する４０５ｎｍ（Ａ４０５）での吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。基準曲線は、精製されたＦＸａ（ＨＦＸａ １０１１，Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｗａｎｓｅａ，ＵＫ）を使用することによって構築し、吸光度値をＦＸａ濃度に変換した。
トロンビン活性のｒＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩａ）は、３７℃で１分間１ｎＭトロンビンとともに１ＩＵ／ｍｌ未変性またはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩをインキュベートすることによって、試験毎に新たに調製し、反応は、１０μＭのトロンビン−特異的阻害剤（Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＴＨ，Ｐｅｎｔｈａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加することによって停止した。
ＦＸ活性化の時間経過（図２７）は、以下の通りに描写し、分析した。ＦＸ活性化の最大率は、曲線の線形部分の傾斜を決定することによって計算し、ｎＭ ＦＸａ／分として表した。遅滞期は、曲線の線形部分のＸ軸切片を計算することによって決定した。最大活性は、２０から３０分の間で測定した平均ＦＸａ濃度として決定し、半値時間（ｔ１／２）は、式、ｔ１／２＝（最大ＡＦＸａ／２＋遅滞期時間＊傾斜）／傾斜を使用して計算した。全てのパラメータは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの内部関数を使用することによって計算した。
ＦＩＸａ補助因子活性アッセイにより測定されたＦＶＩＩＩのトロンビン媒介の活性化および不活性化の動態：未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩを、２５ｎＭヘペス、１７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ｐＨ７．３５緩衝液で１ＩＵ／ｍｌ ＦＶＩＩＩ活性（それらの発色活性に従って）まで希釈し、３７℃で０．５ｎＭトロンビンとともにインキュベートした。最大で４０分までの種々の時点で取った副試料を、ＦＶＩＩＩのさらなる活性化を停止するために、ＦＩＸａ、ＦＸ、リン脂質（ＰＬ）小胞（６０％ＰＣおよび４０％ＰＳから成る）、ＣａＣｌ２およびトロンビン阻害剤の一定分量の調製混合物に添加した。これらの反応混合物を、３７℃で３分間インキュベートし、ＦＸａを生成させた。この混合物の副試料は、ＦＸａによって選択的に開裂される発色基質に添加した。ＦＸａ濃度は、ＦＩＸａ補助因子活性アッセイに関して上述したように決定し、トロンビンとのＦＶＩＩＩのインキュベーション時間に対してプロットした。不活性化の速度は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの内部関数を使用して、それらを単一指数関数に適合させることによって、曲線の上昇部分から定量的に評価した。
トロンビン生成アッセイ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ：ＴＧＡ）：Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋｓ，ＫＳ，ＵＳＡ）から取得した重症血友病Ａ血漿（ＦＶＩＩＩ活性＜１％）は、０．００２５から１μｇ／ｍｌの未変性またはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩでスパイクし、トロンビン産生は、製造業者によって説明される通りにテクノトロンビン（Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（登録商標））ＴＧＡキット（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）で測定した。反応は、低ＴＦおよび低ＰＬ濃度を含有する再脂肪付加された組織因子（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ：ＴＦ）調製物（ＴＦＰＬ ＲＢ試薬）によって誘発した。このＴＦＰＬ溶液の１０μｌの量は、ＥＬＩＳＡプレートのウェルにおいて、ＦＶＩＩＩを有しないか、またはＦＶＩＩＩおよび５０μｌのＴＧＡ蛍光基質を補充した４０μｌ ＦＶＩＩＩ欠損血漿へピペットした。プレートは、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｄｅｒ ＦＬ８００（Ｂｉｏ−ＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）内に設置した。生成されたトロンビンの濃度に比例する蛍光強度の増加は、３６０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの放射波長を使用して、最大で１２０分まで１分毎に自動で読み取ることによって３７℃で継続的に監視した。
トロンビン基質は、アッセイ混合物中に存在するので、生成され、反応時に蛍光発生基質を分割させる全てのトロンビンの累積効果を表す曲線が見られた。したがって、実際の有効なトロンビン濃度を反映する蛍光強度（曲線の最初の誘導体）の増加率は、各読み取り（ＦＵ／分）毎に計算し、精製されたヒトトロンビンによる基質変換率を測定することによって用意された基準曲線を使用して、トロンビン−等価濃度（ｎＭ）に変換した。トロンビン生成曲線は、トロンビン濃度対時間として描写し、定量パラメータ（ピークトロンビン、開始時間、およびピーク時間）は、リーダーの内蔵ＫＣ４ソフトウェア（Ｂｉｏ−ＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）で計算した。
ＡＰＣ媒介のＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａ不活性化：未処置またはトロンビン活性の未変性およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料を、１ＩＵ／ｍｌ（それらの発色活性に従って）まで希釈し、１０μＭ ＰＬ小胞（６０％ＰＣおよび４０％ＰＳから成り、どちらもＡｖ抗Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ，Ａｌａｂａｓｔａ，Ａｌ，ＵＳＡから）および５ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下において、０．０５Ｕ／ｍｌ活性タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）とともにインキュベートした。対照実験において、ｒＦＶＩＩＩ試料は、ＡＰＣの非存在下でインキュベートした。副試料は、規定時間点で取り、ＦＩＸ−補助因子活性アッセイに関して上述したように、そのＦＩＸａ補助因子活性を測定することによって残留活性ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａを決定した。
トロンビン活性のＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）は、１ｎＭトロンビン（＃２３１１ＰＬ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｗａｎｓｅａ，ＵＫ）とともに、３７℃で１分間、２ＩＵ／ｍｌ未変性またはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩＩ試料をインキュベーションすることによって試験毎に新たに調製した。反応は、１０μＭのトロンビン特異的阻害剤（Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＴＨ，Ｐｅｎｔｈａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加することによって停止した。
マウスモデル：血友病モデルとして、ＦＶＩＩＩ−ノックアウトマウスを使用した。マウスは、重症血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ＜０．０１ＩＵ／ｍｌ）に罹患したが、正常レベルのＶＷＦ（ヒトＶＷＦ基準に対して約０．１５ＩＵ／ｍｌ）を有し、ヒト血友病Ａを模倣する。
ＦＶＩＩＩの適用：共役のために使用した同じ組換えＦＶＩＩＩバルクを、対照物質（ｒＦＶＩＩＩ ＭＯＱ＿ＨＥＰＥＳ＿０１Ｅ）として使用した。バルクは、一定分量で−６０℃未満で保存し、使用前に解凍した。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補または未変性ｒＦＶＩＩＩ対照は、解凍し、２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．２％マンニトール、０．８％トレハロース、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１％ヒトアルブミン、ｐＨ７．４緩衝液と混合して、注入に適した濃度を達成した。ＦＶＩＩＩ溶液を等分し、−２０℃で凍結させて、適用の直前に解凍した。標的用量は、２００ＩＵ／ｋｇ ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍであった。濃度は、解凍した試料から再度測定し、適用した用量を計算した。用量は、結果項目の図の説明文に示す。７から１０ｍｌ／ｋｇ体重を尾静脈より注射し、６匹のマウスの群を、６分、３、６、９、１６および２４時間後、ならびに必要であれば、３２時間後に心臓穿刺によって出血させた。９容量の血液を、１容量の３．８％クエン酸ナトリウムと混合し、３０００ｇで１０分間即時に遠心分離させた。上清を３０００ｇで５分間再度遠心分離させ、血漿を分離し、一定分量で凍結させて、分析のために−６０℃未満で保存した。
マウス血漿中のＦＶＩＩＩ活性の決定：ＦＶＩＩＩ活性は、上記のようにアッセイ原理に従って決定した。基質から解離したｐＮＡの時間経過を、動態モードを使用して４０５ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーで測定した。反応の傾斜は、試料中のＦＶＩＩＩ濃度に比例する。試料中のＦＶＩＩＩ濃度は、ヒト血漿基準調製物と比べて計算し、ＷＨＯ血漿基準（ヒト血漿中のＦＶＩＩＩおよびＶＷＦに対する第５ＩＳ、ＮＩＢＳＣ番号０２／１５０）に対して較正して、ＩＵ／ｍｌで表した。アッセイの定量限界は、０．０３ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩであった。
ヒトＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの循環半減期パラメータの計算：ＦＶＩＩＩレベルを分析するために、ｔ０＝０時間に対する濃度は、ＦＶＩＩＩ欠損マウスを研究した通りにゼロに設定した。経時的なＦＶＩＩＩレベルを、ゼロから２４時間の薬物動態パラメータＡＵＣ、最終脱離速度および平均滞留時間を使用して要約した。
０から２４時間の濃度対時間曲線（ＡＵＣ）下面積：０から２４時間の濃度対時間曲線（ＡＵＣ）下面積は、個々の時点で観察された濃度の算術平均を使用して、線形台形公式で計算した。用量とＡＵＣとの間に直線関係が存在することが想定された。この想定の下に、異なる項目に対するＡＵＣは、投与される異なる用量に対して調節した。用量調節は、計算したＡＵＣを、投与された体重１ｋｇ毎の用量で除算することによって行った。
最終脱離速度：最終脱離速度（λ）は、Ｗｏｌｆｓｅｇｇｅｒに提案されるように、バイアス補正で修正した最後の３つの時点における個々の濃度の自然対数の算術平均を使用して推定した。Ｗｏｌｆｓｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．３２（５−６）：７５７−７６６を参照されたい。
平均滞留時間：平均滞留時間（ＭＲＴ）は、ＡＵＣ０〜無限で除算したＡＵＭＣ０〜無限で計算した。ＡＵＭＣ０〜無限およびＡＵＣ０〜無限は、異なる時点および３点尾部面積補正に対して観察された濃度の算術平均を使用して線形台形公式で計算した。尾部面積補正は、項目毎に最後の３つの時点で観察された算術平均の対数線形フィッティングによって計算した。
ペグ化ｒＦＶＩＩＩの機能パラメータ：修飾されたＦＶＩＩＩの作用強度は、その発色活性によって測定した。アッセイ条件下において、ＦＶＩＩＩは、トロンビンによって活性化され、しがたって、アッセイは、ＦＩＸａ媒介のＦＸ活性化を増強させる最大作用強度を反映する。生物活性および不活性ＦＶＩＩＩを区別するために、ＦＶＩＩＩ：Ａｇは、実験項目で説明したようにＥＬＩＳＡによって決定した。異なる共役体の特異的活性を比較するために、両方のパラメータは、生成物のタンパク質含有量に関連している。表１１は、測定値を要約する。
表１１：ペグ化ｒＦＶＩＩＩ共役体の定量パラメータ
Figure 2010514773
 （全ての結果は、全ての結果は、新たに解凍した一定分量から取得したもので、少なくとも２回の測定の平均である。）
ＶＷＦに対するＦＶＩＩＩ親和性は、液相中の固定化された未変性ｒＶＷＦ（ｒＶＷＦ１３３Ｐ１）および試料（未変性ｒＦＶＩＩＩまたはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体）を用いた表面プラズモン共鳴技術によるＶＷＦ−ＦＶＩＩＩ親和性の測定に関して上述したように、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００システムを使用して決定した。ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩ間の均一な１：１相互作用を想定して、会合および解離定数を、Ｂｉａｃｏｒｅの「Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」プログラムのラングミュアモデルを使用して決定した。ＶＷＦとの親和性定数（ＫＤ）に対して、未変性およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ間の関連する差異は見出せなかった。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、恐らく、ペグ化に起因するｒＦＶＩＩＩの一部の構造変化の理由により、この相互作用モデルまたは任意の他の相互作用モデルとの最適な適合をもたらさなかったので、およその評価のみを行うことが可能であった。測定値および特異的活性の比率を表１２に要約する。
表１２：ＰＥＧ−ｒＦＶＨＩ共役体の特異的活性
Figure 2010514773
 値は、表３に示した測定データから計算した。
全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、未変性ｒＦＶＩＩＩと比較して顕著に減少したＦＶＩＩＩ活性を有した。しかしながら、また、ＦＶＩＩＩ特異的活性は、ペグ化されなかったが、全工程を一通り行ったＦＶＩＩＩ対照に対しても僅かに減少した。
活性の減少は、ＭＷにも、またはＰＥＧ試薬の特性にも関連しなかった。例えば、Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長共役体は、未変性ｒＦＶＩＩＩと比較して、約６５％減少したＦＶＩＩＩ特異的活性を有し、一方、Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長共役体の特異的活性は約１４％まで減少した。ＨＰＬＣ方法で取得したデータが、本来の共役体および再合成材料の両方に利用可能である、ペグ化度を決定するための２つの異なる方法が、Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長共役体を除いて、分析的特徴全体にわたって使用されたため、ペグ化度と特異的活性との相関は評価することができない。再合成されたＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長は、本来の共役体よりも低いペグ化度を有したが、どちらも同様の特異的活性を有した。
ＦＶＩＩＩ抗原対タンパク質の比率は、全ての共役体において１０％を下回った。２つのポリクローナル抗体は、酵素連結の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＦＶＩＩＩ抗原の決定に関して上述したアッセイに適用したため、この減少は、分子全体にわたったＰＥＧ部分の強力な遮蔽作用を示す。ＦＶＩＩＩ発色活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ）対ＦＶＩＩＩ：Ａｇ比率は上昇し、これは、一部のエピトープの強力な被覆にかかわらず、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩが活性化され得ること、または恐らく試薬中のトロンビンの作用に起因して、ＰＥＧ部分の部分的な解離が、活性決定条件下で即時に発生したことを示唆する可能性がある。
詳細な生化学的特徴付けは、各ＰＥＧｒＦＶＩＩＩ共役体の最初のバッチ上で行った。原材が不足していたため、再合成した共役体を、ｒＦＶＩＩＩのＡＰＣ媒介の不活性化（「ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａのＡＰＣ媒介の不活性化」において後述）の調査のため、およびヒトＦＶＩＩＩ欠損血漿中の体外加水分解（「ヒトＦＶＩＩＩ欠損血漿中の解離可能なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ体外解離」において後述）の調査のために使用した。
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体のドメイン構造は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いてポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体での免疫ブロットによって可視化した（図２８、パネルＡ）。成功したペグ化を評価するために、ゲルは、図２８のパネルＢで実証するように、ポリクローナル抗ＰＥＧ抗体で免疫ブロットした。全ての試料は、測定したタンパク質に従ってゲルに適用した。
ＦＶＩＩＩの特徴的なドメイン構造は、ＰＥＧｒＦＶＩＩＩ共役体のいずれにおいてもペグ化によって影響されなかった。ペグ化の結果として、新しい高ＭＷバンドは、一部の重鎖（ＨＣ）−Ｂドメインバンドの強度の同時減少とともに現れた。抗ＰＥＧ抗体での染色により、成功したペグ化が確認された。ゲル上に分解産物は見られなかった。
ポリクローナル抗体は、異なるドメインに対して同じ親和性を有しなかったため、ゲルを、ＨＣ−Ａ２断片および軽鎖（ＬＣ）−Ａ３ドメインに対して特異的な抗体でも免疫ブロットした（図２９）。
図２９のパネルＡは、ＨＣ含有のバンドのＰＥＧ ＭＷ依存性の増加を示す。抗体は、これ以上の分解バンドのない一部の９０キロダルトンの完全なＨＣバンドをも示す。出発材料として使用したｒＦＶＩＩＩは、「伸長した」軽鎖を含有したが、これも、抗ＬＣ抗体によって検出された（図２９、パネルＢ）。ＭＷ増加は、免疫ブロットにおいて８０キロダルトンおよび１６０キロダルトンバンドの両方に観察され、恐らく低い程度までではあるが、軽鎖がペグ化されたことも示唆される。いくらかの低ＭＷ分解産物が４０Ｋ ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体内に現れた。
ＦＩＸａ−補助因子活性へのｒＦＶＩＩＩのペグ化の効果：ＦＩＸａ−補助因子アッセイとしても知られるＦＸａ産生アッセイは、ＦＶＩＩＩおよびトロンビン活性のＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）の両方が、ＦＸを急速に活性化させるＣａ＋＋イオンの存在下において、適したリン脂質（ＰＬ）表面上でＦＩＸａとの複合体を形成するという事実に基づいている。Ｅｌ
ｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：６９５を参照されたい。複合体のアセンブリおよび活性の動態は、ＦＶＩＩＩによって制御され、ＦＶＩＩＩ分子の機能的完全性の高感度な尺度である。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体ならびにＦＶＩＩＩ対照および未変性ｒＦＶＩＩＩを、測定したＦＶＩＩＩ発色活性に従って１ＩＵ／ｍｌまで希釈し、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＰＬ−小胞および塩化カルシウムの調製混合物に添加した。最大３０分までの規定の間隔で、副試料を取り除き、生成されたＦＸａを、ＦＩＸａ補助因子活性アッセイに関して上述したように決定した。しかしながら、全てのｒＦＶＩＩＩ共役体を１ＩＵ／ｍｌまで希釈したとしても、達成される最大ＦＸａには僅かな差があった（表１３）。したがって、ＦＸ活性化の時間経過の良好な目視比較のために、ＦＸａ活性を、最大ＦＸａ活性のパーセントで表した（図３０）。
トロンビン活性化なしで、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、遅延された複合体形成と、未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ対照のものよりも遅いＦＸ活性化速度を示した。Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長が、若干減少したＦＸ活性化速度を示したことを除いて、共役体間においてＦＸ活性化速度に関連する差異は観察されなかった。対照は、未変性ｒＦＶＩＩＩよりも若干活性であると考えられた。
表１３：トロンビン活性化なしでのＦＩＸａ補助因子活性の定量パラメータ
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 トロンビン活性のｒＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩａ）は、３７℃で１分間１ｎＭトロンビンとともに１ＩＵ／ｍｌ未変性またはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩをインキュベートすることによって、全ての生成物から調製した。反応は、１０μＭのトロンビン−特異的阻害剤（Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＴＨ，Ｐｅｎｔｈａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加することによって停止し、ｒＦＶＩＩＩａの補助因子活性は、非活性化ｒＦＶＩＩＩに関して測定した。
異なるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体で取得したＦＸ活性化の時間経過を示すために、ＦＸａ活性を最大ＦＸａ活性のパーセントで表した（図３１）。定量的動態パラメータを表１４に要約する。
Figure 2010514773
 トロンビンでの活性化後、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、活性の増強を依然として有した未変性ｒＦＶＩＩＩまたは対照のものと同様のＦＸ活性化速度を示した。また、最大ＦＸａ産生能力においても僅かな増加が観察された。
ＦＩＸａ補助因子活性アッセイによって測定されたＦＶＩＩＩのトロンビン媒介の活性化および不活性化の動態：トロンビン活性化および不活性化の時間経過は、ＦＩＸａ補助因子活性アッセイで測定した。１ＩＵ／ｍｌ未変性またはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩを含有する試料を、０．５ｎＭトロンビンとともにインキュベートした。副試料を、トロンビンの添加前に取り除き、およびその後最大４０分までの間隔で、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＰＬ−小胞、塩化カルシウムおよびトロンビン阻害剤の調製混合物に添加して、ＦＶＩＩＩへのさらなる反応を停止した。この時点では、トロンビンなしでの最小ＦＸａ形成のみが存在し、最大活性の約４０％が、トロンビンによる完全な活性化後に既に到達されていたため、この反応混合物は、３分間インキュベートした。
図３２は、未変性およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対するトロンビン活性化および不活性化の時間経過を示す。表１５は、未変性ｒＦＶＩＩＩのものと比較した相対的な一次不活性化速度を示す。
Figure 2010514773
 ０．５ｎＭトロンビンの存在下において、未変性ｒＦＶＩＩＩおよび対照のどちらも、２分以内の最大活性での急速な活性化、続いて、それぞれ２０および３０分以内にほぼ終了した高速の不活性を示した。ＦＸａ生成特性に従って、対照は、トロンビンによってより活性化することができ、僅かに遅い不活性化速度を示した。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補は、最大３から５分に達する僅かに遅い活性化速度と、残留ＦＩＸａ補助因子活性での実質的に減少した不活性化速度を示した。
ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａのＡＰＣ媒介の不活性化：未変性およびペグ化ＦＶＩＩＩ（１ＩＵ／ｍｌ、ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ活性に従って希釈）は、ＰＬ−小胞およびＣａＣｌ２（上記のような）の存在下でのトロンビンによる事前の活性化をともない、また、伴わず、０．０５Ｕ／ｍｌ活性タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）とともにインキュベートした。ＡＰＣ不活性化後の残留ＦＶＩＩＩ活性は、トロンビン媒介の活性化および不活性化動態の調査に関して説明したのと同様に、ＦＩＸａ補助因子活性を測定することによって決定した。ＡＰＣ−ｒＦＶＩＩＩ混合の副試料は、最大１０分までの間隔で取り除き、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＰＬ−小胞、および塩化カルシウムの調製混合物に添加した。混合物は、非活性化時に１０分間、およびトロンビン活性化ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩを調査する時に５分間インキュベートした。これらのインキュベーション時間は、非活性化および活性化ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体（図３０および図３１）の存在下において測定したＦＸａ産生の時間経過に基づいており、選択した時点で、約７０％の完全な活性が、ＰＥＧ共役体で既に到達している。適した対照実験において、未変性およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩは、ＡＰＣの非存在下でインキュベートした。図３３および３４は、不活性化の時間経過を示し、ＦＸａ活性は、ＡＰＣなしでインキュベートした適切な対照混合物において、最初１分の間に測定されたＦＸａのパーセントで表した。表１６および１７は、未変性ｒＦＶＩＩＩに対して測定したものと比較して、計算した相対的な一次速度定数を示す。
Figure 2010514773
 非活性の未変性ｒＦＶＩＩＩを０．０５Ｕ／ｍｌＡＰＣとともにインキュベートした時に、０．２２０＊分−１のｋ’で、一次速度不活性化が観察された。対照的に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、約５０％遅い速度ではあるが、最初に、それらのＦＩＸａ補助因子活性の過渡的増加、続いて一次不活性化を示した。ＡＰＣの非存在下でインキュベートした試料にそのような変化はなかった。未変性およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体のどちらも安定のままであった（図３３の挿入部分）。試験時点での試験材料の不足により、対照に利用可能なデータはない。
Figure 2010514773
 トロンビン活性の未変性またはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインキュベーションは、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体（表９）の約５０％遅い速度で、一次不活性化（図３４）を示した。トロンビン活性の未変性ｒＦＶＩＩＩａおよびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩａ共役体は、安定のままであったか、またはＡＰＣの非存在下において、ＦＩＸａ補助因子活性のごく僅かな減少のみを示した。
ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＦＶＩＩＩのトロンビン産生能力へのペグ化の効果：０．０１Ｕ／ｍｌ（＜１％）より低いＦＶＩＩＩ活性を有する重症血友病Ａ患者の血漿試料を、０．０２５から１ＩＵ／ｍｌの完全なＦＶＩＩＩの活性範囲に相当する０．００２５から０．１μｇ／ｍｌの範囲において、未変性の増加量およびＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩを体外でスパイクした。低濃度のＴＦおよびＰＬ複合体で誘発されたトロンビン生成は、実験手順で説明したように測定した。図３５（パネルＡ）に示すように、未変性ｒＦＶＩＩＩの添加は、ＦＶＩＩＩ欠損血漿のトロンビン産生の障害を用量依存的に改善させた。改善は、開始時間およびピーク時間の短縮およびピークトロンビンの増加をもたらし、これは、図３５のパネルＢに描写したように、対数で表されたＦＶＩＩＩ濃度での線形用量反応を示した。この相関は、低い濃度範囲内で最も大きな効果が生じることを示唆する。
図３６は、ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ試料で取得したトロンビン生成曲線（パネルＡ〜Ｆ）およびピークトロンビン値の用量反応曲線（パネルＧ）を示す。
全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、用量依存性の様態で、ＦＶＩＩＩ欠損血漿のトロンビン産生の障害を補正したが、０．０１μｇ／ｍｌ血漿を下回る最小の効果であった。この濃度を上回ると、未変性ｒＦＶＩＩＩでの平行な用量反応曲線が測定され、これは、未変性ｒＦＶＩＩＩと同じピークレベルを達成するためには、より多くのＦＶＩＩＩが必要とされることを示唆する。Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長共役体は、特により高い濃度範囲内で、このアッセイにおいてより高い活性を有するようであった。
増加したｐＨでの解離可能なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩの体外解離：ｒＦＶＩＩＩからのＰＥＧ部分の体外解離の動態を調査するために、ペグ化ｒＦＶＩＩＩ試料は、１／１０体積の０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８．１に調節した本来のｒＦＶＩＩＩ緩衝液（５０ｍＭヘペス、５ｍＭ ＣａＣ１２、０．１％ポリソルベート８０、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ〜６．９）中でインキュベートした。対照として、未変性ｒＦＶＩＩＩおよび非ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ対照を同じ方法で処置した。全ての試料を外気温で保持した。副試料を異なる時点で取り、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ、ＦＶＩＩＩ発色活性の変化を測定した。構造変化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いてＦＶＩＩＩおよびＰＥＧ−特異的抗体での免疫ブロットによって調査した。
ＰＥＧ部分の体外解離時のＦＶＩＩＬＡｇおよび発色活性の変化：図３７はＦＶＴＩＩ特異的活性の変化、および図３８はＦＶＩＩＬＡｇの変化を示し、どちらもＩＵ／ｍｇタンパク質で表す。
未変性ｒＦＶＩＩＩおよびシッピング対照は、活性および抗原レベルの継続的な減少を示した。対照的に、ペグ化ｒＦＶＩＩＩ共役体の活性および抗原レベルは両方とも、最初の４８時間およびプラトーが再び減少した後に、徐々に増加した。最も高い相対的活性の増加（２．４倍）は、Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短共役体で達成された。最短プラトーでの最速の増加は、２つの６０Ｋ共役体で観察された。
ＰＥＧ部分の体外解離時のＰＥＧ−ｒＦＶＨＩの構造変化：より高いｐＨのｐＨ８．１でのインキュベーション後、構造変化を可視化するために、試料を、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと、続いて、ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（図３９）、モノクロナール抗ヒト重鎖Ａ２ドメイン抗体（図４０）およびポリクローナル抗ＰＥＧ抗体（図４１）での免疫ブロットに曝露させた。未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ対照は、インキュベーション時のＦＶＩＩＩの分解に対応する、ＦＶＩＩＩ活性およびＦＶＩＩＩ：Ａｇレベルの継続的な減少を示した。
ＦＶＩＩＩ：ＡｇレベルおよびＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ活性はどちらも、緩衝液ｐＨ８．１でのインキュベーション後に増加するので、ＰＥＧ解離の破蔽作用、解離反応を行うことのない、材料の測定されたＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ活性に合ったゲルに適用されるＦＶＩＩＩの量（抗ＦＶＩＩＩ 抗体に対して１００ｍＩＵＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍおよび抗ＰＥＧ抗体に対して３００ｍＩＵ ＦＶＩＩＩ：Ｃｈｒｏｍ）が示唆される。
図３９に示すように、緩衝液ｐＨ８．１中での３日間のインキュベーション後、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対して実質的な変化を発見することはできなかったが、抗ＦＶＩＩＩ免疫ブロットでの未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ対照の両方に対して僅かなぼやけ効果が観察された。最大７日のより長いインキュベーションは、検出不可能なエピトープでの分解をもたらした。異なる候補を比較すると、Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長およびＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長共役体は、最長の構造的完全性を示した。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体の重鎖のいくらかのＭＷ減少は、図４０で示すように、インキュベーションの３日後に発生した。インキュベーションの７日後、全ての共役体中にＨＣ−Ａ２断片が現れた。また、全てのドメインの分子量の時間依存性減少も、抗ＰＥＧ免疫ブロット（図４１）で観察され、これは、結合したＰＥＧの一部の解離を反映する。相当量の遊離ＰＥＧは検出されなかった。７日間のインキュベーション時間の後、全ての共役体は、それらが、ＦＶＩＩＩ特異的免疫ブロットによって可視化できない程度にまで分解された（データ図示せず）。
ヒトＦＶＩＩＩ−欠損血漿中の解離可能なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの体外解離：生理学的条件を模倣するために、２回目の解離実験において、２０Ｋおよび４０Ｋ ＰＥＧを有するＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体を、＋３７℃でヒトＦＶＩＩＩ欠損血漿中においてインキュベートした。ＰＥＧの解離は、ＦＶＩＩＩ発色活性およびＦＶＩＩＩ抗原レベルの変化を測定することによって、これらの条件下で調査した。未変性ｒＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ対照とともに、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体を０．１μｇ／ｍｌタンパク質濃度まで希釈し、インキュベーション時間の間の微生物学的混入を防ぐために、０．００５％アジ化ナトリウムとともに、１％未満のＦＶＩＩＩ活性（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋｓ，ＫＳ，ＵＳＡ）でＦＶＩＩＩ欠損血漿に添加した。試料は、規定の時点で取り除き、ＦＶＩＩＩ発色活性決定の場合は即時に試験し、等分して、ＦＶＩＩＩ：Ａｇ決定のために−８０℃で凍結させた。
材料不足により、この実験のためにＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体を再合成し、最初の生成からはＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短のみであった。再合成したＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長は、低いペグ化度を有した。また、再合成したＬｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長も低いペグ化度を有したが、異なる分析方法に起因して、直接的な比較は不可能であった（表９）。特異的活性にはいくらかの差もあったが、それらはペグ化度と相関するとは考えられなかった（表１１）。
未変性ｒＦＶＩＩＩの特異的活性は、血漿系中のインキュベーション後に減少した（図４２）。これとは対照的に、共役体の特異的活性は、インキュベーション後に過渡的増加し、約１０時間後に最大レベルに達した。未変性ｒＦＶＩＩＩの初期の特異的活性を達成した共役体はなかった。異なる共役体と未変性ｒＦＶＩＩＩとの間の曲線の上昇部分から決定した、不活性化速度間に実質的な差異はなかった（データ図示せず）。また、ＦＶＩＩＩ抗原レベルもインキュベーション時に増加し（図４３）、これは、破蔽効果を示唆する。ＦＶＩＩＩ活性結果と同様に、未変性ｒＦＶＩＩＩの初期のレベルを達成した共役体はなかった。
ＦＶＩＩＩ欠損ノックアウトマウスは、２００ＩＵ ＦＶＩＩＩ／体重ｋｇの標的用量で、ｒＦＶＩＩＩまたはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのいずれかを注入した。１時点当たり６匹のマウスの群を、共役体毎に使用した。適用したＦＶＩＩＩ用量と無関係である脱離曲線の直接的な比較を可能にするために、ＦＶＩＩＩ血漿レベルは、物質適用の５分後に血漿中に見られたＦＶＩＩＩ濃度に対して正規化した（正規化％）。
図４４〜図４９は、ＩＵ ＦＶＩＩＩ／ｍｌ（パネルＡ）での、またはパーセント（パネルＢ）で正規化した物質注入後のＦＶＩＩＩの血漿レベルを示す。注入した材料の正確な量を適した図の説明文に示す。
概して、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩは、未変性対照よりも向上した薬物動態を示した。薬物動態パラメータの向上の度合いは、統計的方法で計算し、表１０に要約する。
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの注入直後、血漿ＦＶＩＩＩ活性は増加し、３時間から６時間の間でプラトーに達し、その後減少した。注入の２４時間後、未変性ｒＦＶＩＩＩの注入後よりも、約１０倍以上のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ活性をマウス血漿中で測定した。
Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短候補と同様に、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ ２０Ｋ ｂｒ長は、未変性ｒＦＶＩＩＩよりもずっと長く循環した。
４０Ｋ ｂｒ短ＰＥＧでペグ化した組換えＦＶＩＩＩは、未変性ｒＦＶＩＩＩよりも長く循環した。
注入の２４時間後、未変性ｒＦＶＩＩＩは、定量化の限度に近く、一方で、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ長は、注入の３２時間後に依然検出可能であった。
短い解離可能な特性を有する６０Ｋ共役体は、マウス血漿からの未変性ｒＦＶＩＩＩよりもずっと遅い速度で脱離した。
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長共役体は、未変性対照ｒＦＶＩＩＩよりもずっと長く血友病マウス中で循環した。直接的な比較のために、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補に対する正規化脱離曲線を図２５に要約する。対照群は、調査全体にわたって行った全ての実験の平均である（時点毎に２４匹の動物）。
統計的評価からの結果を表１８に示す。データは、各ｒＦＶＩＩＩ共役体によって実行された薬物動態パラメータ対特定の対照の増加として提供する。ＦＶＩＩＩ曲線下面積（ＡＵＣ）は、全ての候補について有意に増加したが、他よりも優れていると考えられる候補はない。ＦＶＩＩＩ半減期の増加は、候補間で異なった。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長は、ＦＶＩＩＩ半減期の有意な増加をもたらした。４０Ｋ候補に対して、有意に増加したＦＶＩＩＩ半減期への統計的傾向が観察されたが、しかし、最大６０時間までの血漿サンプリング点を用いた研究の拡張が、有意性を確認するために必要であろう。６０Ｋ変異体は、半減期の有意な増加を与えなかった。平均滞留時間は、未変性対照よりもＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対して常に高かった。ＭＲＴの最も高い増加が、Ｌｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短候補に対して観察された一方で、Ｌｙｓ ６０Ｋ共役体は、最も低い増加をもたらした。
表１８：ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩに対する薬物動態パラメータ（対照と対比した増加）
Figure 2010514773
Figure 2010514773
 ｓ：有意、ｓ§：統計的傾向、ｎｓ：有意でない
データは、各ＰＥＧ−ｒＦＶＩＨ共役体と一緒に走行された薬物動態パラメータ対未変性ｒＦＶＩＩＩを有する各対照群の増加を示す。
表１８の結果は、個々の対照実験に対する相対増加として与えられているが、図５１は、候補間の直接的な比較を可能にするために、９５％信頼区間とともに、統計的評価からのＡＵＣおよび半減期に対する絶対データを示す。
全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対するＡＵＣは、平均未変性ｒＦＶＩＩＩ対照に対してよりも明らかに高かった。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩに対する９５％信頼区間は、対照からのものと重複しなかった。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補の内で、Ｌｙｓ ６０Ｋ共役体およびＬｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長候補は、最も顕著な効果を有するようであった。ＦＶＩＩＩ半減期も、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補で増加した。
平均滞留時間は、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補について、未変性ｒＦＶＩＩＩ対照（未変性対照の範囲は、５．６から８．９時間であった）に対して上昇した。最も高いＭＲＴが、Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ長およびＬｙｓ ４０Ｋ ｂｒ短および長候補で見られた。
概して、全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、何らの分解もなくドメイン構造を保存した。対照的に、全ての機能的活性が減少し、これは、体外インキュベーション後に部分的にのみ回復することができた。しかしながら、測定値は、３つの併発反応、つまり、ＰＥＧ部分の解離、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの不活性化および遊離した未変性ｒＦＶＩＩＩの不活性化の速度によって影響されたことを考慮すべきである。Ｌｙｓ ６０Ｋ ｂｒ長共役体は、より高い特異的活性を有し、結果として、トロンビン生成能力が上昇した。しかしながら、行った試験において、これは、２０Ｋまたは４０Ｋ ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体よりも優れた何らの他の機能または構造上有益な特性を示さなかった。
ＦＶＩＩＩ欠損マウスに、ｒＦＶＩＩＩまたはＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩを注入し、最大３２時間まで、血漿中のＦＶＩＩＩ活性を追跡した。全てのＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体は、未変性ｒＦＶＩＩＩ対照のものよりも遅い脱離を示した。未変性ｒＦＶＩＩＩが、より高速な初期相およびより遅い最終相の２相性の様態で、マウスモデル中で脱離した一方で、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補は、より線形な脱離特徴に従った。Ｌｙｓ ２０Ｋ ｂｒ短候補は、血友病マウスへの注入後最大６時間までのＦＶＩＩＩ血漿レベルの増加と、続いてＦＶＩＩＩ活性の減少をもたらした。ＦＶＩＩＩ活性の初期の増加は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩからの解離可能なＰＥＧの解離、すなわちＦＶＩＩＩ活性の回復によって説明され得る。
ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体でのＦＶＩＩＩ活性のより遅い脱離は、継続的に未変性ｒＦＶＩＩＩを遊離させて、次いで正常の脱離速度で除去されるより長い循環のＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの、２つの重複効果の結果である可能性もある。
動物モデルに適用したＦＶＩＩＩ用量は、検出可能なＦＶＩＩＩ活性に基づいた。ＦＶＩＩＩの特異的活性は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ候補に対してより低かったため、これは、未変性ｒＦＶＩＩＩ対照よりもＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ共役体に対して１．９から６．７倍高いタンパク質用量をもたらした。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの遅い脱離は、適用したタンパク質のより高い用量に依存していないと考えられるが、しかし、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの同様のタンパク質用量と比較して、ＦＶＩＩＩ血漿レベルで未変性ｒＦＶＩＩＩの高いタンパク質用量の効果を評価するために、さらなる実験が必要とされる。

Claims (36)

  1. 以下の構造を有する化合物であって、
    Figure 2010514773
     式中、
    ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり、
    ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり、
    Ｘ１は、第１のスペーサ部分であり、
    Ｘ２は、第２のスペーサ部分であり、
    Ｈαは、イオン化水素原子であり、
    Ｒ１は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
    Ｒ２は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
    （ａ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
    （ｂ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
    Ｒｅ１は、存在する場合、第１の電子変化基であり、
    Ｒｅ２は、存在する場合、第２の電子変化基であり、
    Ｙ１は、ＯまたはＳであり、
    Ｙ２は、ＯまたはＳであり、
    （ｖＷＦ／Ｆ８）は、フォンウィルブランド因子部分および第ＶＩＩＩ因子部分から成る群から選択されるアミン含有の生物活性薬剤の残基である、化合物。
  2. 前記アミン含有の生物活性薬剤は、フォンウィルブランド因子部分である、請求項１に記載の化合物。
  3. 前記フォンウィルブランド因子部分は、ヒト組換えフォンウィルブランド因子である、請求項２に記載の化合物。
  4. 前記アミン含有の生物活性薬剤は、第ＶＩＩＩ因子部分である、請求項１に記載の化合物。
  5. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、ヒト組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である、請求項４に記載の化合物。
  6. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、ヒト組換え全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項５に記載の化合物。
  7. 前記第１の水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）であり、前記第２の水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）である、請求項１に記載の化合物。
  8. 前記第１の水溶性ポリマーは、１０，０００ダルトンから８５，０００ダルトンの重量平均分子量を有し、前記第２の水溶性ポリマーは、１０，０００ダルトンから８５，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
  9. 以下から成る群から選択される構造を有し、
    Figure 2010514773
    Figure 2010514773
     各構造に対して、および各場合において、（ｎ）は、独立に４から１５００の整数であり、（ｖＷＦ／Ｆ８）は、フォンウィルブランド因子部分および第ＶＩＩＩ因子部分から成る群から選択されるアミン含有の生物活性薬剤の残基である、請求項１に記載の化合物。
  10. 以下の構造を有し、
    Figure 2010514773
     ｖＷＦは、アミン含有の組換えヒトフォンウィルブランド因子の残基であり、（ｎ）は、各場合において、独立に４から１５００である、請求項１に記載の化合物。
  11. 以下の構造を有し、
    Figure 2010514773
     ｖＷＦは、アミン含有の組換えヒトフォンウィルブランド因子の残基であり、（ｎ）は、各場合において、独立に４から１５００である、請求項１に記載の化合物
  12. 以下の構造を有し、
    Figure 2010514773
     Ｆ８は、第ＶＩＩＩ因子部分のアミン含有の残基であり、（ｎ）は、各場合において、独立に４から１５００である、請求項１に記載の化合物。
  13. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である、請求項１２に記載の化合物。
  14. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、ヒト組換え全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項１２に記載の化合物。
  15. 以下の構造を有し、
    Figure 2010514773
     Ｆ８は、アミン含有の第ＶＩＩＩ因子部分の残基であり、（ｎ）は、各場合において、独立に４から１５００である、請求項１に記載の化合物。
  16. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である、請求項１５に記載の化合物。
  17. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、ヒト組換え全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項１５に記載の化合物。
  18. ポリマー試薬と前記生物活性薬剤との間の共有結合を形成するのに適切な条件下で、フォンウィルブランド因子部分および第ＶＩＩＩ因子部分から成る群から選択されるアミン含有の生物活性薬剤に、前記ポリマー試薬を接触させるステップを含む方法であって、前記ポリマー試薬は、以下の構造を有し、
    Figure 2010514773
     式中、
    ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり、
    ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり、
    Ｘ１は、第１のスペーサ部分であり、
    Ｘ２は、第２のスペーサ部分であり、
    Ｈαは、イオン化水素原子であり、
    Ｒ１は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
    Ｒ２は、Ｈまたは有機ラジカルであり、
    （ａ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
    （ｂ）は、ゼロまたは１のいずれかであり、
    Ｒｅ１は、存在する場合、第１の電子変化基であり、
    Ｒｅ２は、存在する場合、第２の電子変化基であり、
    （ＦＧ）は、活性薬剤のアミノ基と反応して、解離可能な連結を形成することが可能な官能基である、方法。
  19. 前記解離可能な連結は、カルバミン酸連結である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ポリマー試薬は、以下から成る群から選択される構造を有し、
    Figure 2010514773
    Figure 2010514773
     各構造に対して、および各場合において、（ｎ）は、独立に４から１５００の整数である、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記アミン含有の生物活性薬剤は、フォンウィルブランド因子部分である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記フォンウィルブランド因子部分は、ヒト組換えフォンウィルブランド因子である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記アミン含有の生物活性薬剤は、第ＶＩＩＩ因子部分である、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、ヒト組換えＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第ＶＩＩＩ因子部分は、ヒト組換え全長第ＶＩＩＩ因子である、請求項２４に記載の方法。
  26. 請求項１から１７のいずれか１項に記載の化合物および医薬的に許容される賦形剤を含む、組成物。
  27. 請求項２６に記載の組成物を、患者に投与するステップを含む、方法。
  28. 少なくとも１つの第ＶＩＩＩ因子部分に結合している請求項２に記載の化合物を含む構築物。
  29. フォンウィルブランド因子分子の体内半減期と比較して増加する前記体内半減期を有する、請求項２８に記載の構築物。
  30. 前記構築物に結合していない第ＶＩＩＩ因子部分の体内半減期と比較して増加する前記体内半減期を有する、請求項２８に記載の構築物。
  31. フォンウィルブランド因子分子の体内半減期と比較して増加する前記体内半減期を有する、請求項２に記載の化合物。
  32. 前記体内半減期は、フォンウィルブランド因子分子の前記体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍に増加する、請求項３１に記載の化合物。
  33. 前記体内半減期は、フォンウィルブランド因子分子の前記体内半減期と比較して、少なくとも２倍に増加する、請求項３１に記載の化合物。
  34. ＦＶＩＩＩ分子の体内半減期と比較して増加する前記体内半減期を有する、請求項４に記載の化合物。
  35. 前記体内半減期は、ＦＶＩＩＩ分子の前記体内半減期と比較して、少なくとも１．５倍に増加する、請求項３４に記載の化合物。
  36. 前記体内半減期は、ＦＶＩＩＩ分子の前記体内半減期と比較して、少なくとも２倍に増加する、請求項３４に記載の化合物。
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