CN103387580A

CN103387580A - 百部生物碱单体成分及其用途

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Publication number: CN103387580A
Application number: CN201210149954XA
Authority: CN
Inventors: 杨中铎; 赖东海
Original assignee: Lanzhou University of Technology
Current assignee: Lanzhou University of Technology
Priority date: 2012-05-12
Filing date: 2012-05-12
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2032-05-12
Also published as: CN103387580B

Abstract

百部生物碱单体成分及其用途，百部生物碱单体为stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin，其用途是用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂，即在制备预防和治疗老年痴呆症、或者肠梗阻、或者重症肌无力、或者青光眼、或提高智力的药物的用途。

Description

百部生物碱单体成分及其用途

技术领域

本发明涉及生物碱单体的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以记忆损伤、认知功能障碍、行为障碍和生活自理能力下降为特征的慢性神经退行性疾病，是老年痴呆中最常见的疾病。AD的发病率与年龄呈正相关。近年来，国内外临床研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂(actylcholinesterase inhibitor，AChEI)是治疗AD最有效的药物，另外对青光眼、重症肌无力、肠梗阻等症的治疗也有较好的作用(金有豫.药理学(第五版)，2001；54-55.)。几种强效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，比如石杉碱甲和加蓝他敏，最初都是从草药中分离得到，对于寻找潜在的乙酰胆碱酯酶抑制剂来说，药用植物是一个非常丰富的资源，其药用成分具有疗效好、副作用小、作用面广等优点。

百部为百部科植物直立百部(Stemona sessilifolia(Miq.)Miq.)、蔓生百部(Stemona japonica(BI.)Miq.)或对叶百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥块根。春、秋二季采挖，除去须根，洗净，置沸水中略烫或蒸至无白心，取出，晒干。百部生物碱是百部主要成分，如含百部碱(stemomne)、直立百部碱(sessilistemonine)、对叶百部碱(tuberostemonine)、原百部碱(protostemomno)和蔓生百部碱(stemonamlne)等多种生物碱。百部为中医常用药，具有润肺止咳、杀虫灭虱的功效，用于新久咳嗽、肺痨、百日咳、蛲虫病、体虱、疥癣。(中国药典，2010版1部：123-124)。但到目前为止，尚未见百部总生物碱其单体成分stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin关于乙酰胆碱酯酶抑制活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供百部生物碱单体成分及其用途。

百部生物碱单体成分，由stenin、neostenine、sessilifoline B、neotubero-stemonin四个化合物组成，结构分别为：

百部生物碱单体的用途，百部生物碱单体成分stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin能用于作为乙酰胆碱酯酶抑制剂。

本发明采用改良的Ellman方法(Ellman G.L..Biochemical Pharmacology，1961，7：88-95)，研究了百部生物碱单体成分stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin的抗乙酰胆碱酯酶活性，并且研究了对东莨菪碱诱导的痴呆小鼠的学习记忆能力的影响(姜红柳.中国药理学通报，2008；24(10)：1399-1400)。结果显示stenin、sessilifoline B、是良好的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂；能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力，neostenine、neotuberostemonin具有弱的改善痴呆小鼠的学习记忆能力。stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin与药学上可以接受的载体或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型和非口服给药的注射剂或其它剂型，可以在临床上用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂药物治疗神经退行性疾病(阿尔茨海默病等)。

具体实施方式

下面结合具体实例进一步对本发明进行描述，但不限制本发明。

实施例1：百部生物碱单体成分的分离

(1)百部总生物碱提取物的制备

取百部药材5kg，粉碎，加入95％乙醇10L回流提取两次，每次两小时，合并提取液，浓缩至干，加入3L蒸馏水溶解，用4M的浓盐酸调pH值到1-2，静置12-16h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9-11，然后用加入5L氯仿萃取2次，萃取液合并浓缩至干，得到百部总生物碱提取物(75g)。

(2)百部总生物碱提取物中有效单体成分的分离及鉴定

按上述所得百部总生物碱提取物通过大孔树脂柱层析，乙醇-水梯度洗脱(20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％)，每500mL收集一次，浓缩至干，利用薄层色谱检测并合并相同组分得到A-H共八个组分，组分F(50％-90％洗脱部分)利用反复硅胶柱层析进行分离，得到化合物1(stenine)(85mg)、化合物2(neostenine)(350mg)、化合物3(sessilifoline B)(60mg)和化合物4(neotuberostemonin)(450mg)。

本发明百部生物碱单体成分stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin的结构鉴定如下：

化合物1(stenine)：

与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：278(M+H)⁺。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.92(t，J＝7.4Hz，3H)，1.28(d，J＝7.1Hz，3H)，1.30-1.75(complex，10H)，1.90(m，2H)，2.05-2.50(m，2H)，2.86(dt，J＝4.2，13.0Hz，1H)，3.17(dt，J＝3.5，9.0Hz，1H)，4.46(dd，J＝9.2，12.0Hz，1H)；13C NMR(100.6MHz，CDCl₃)δ9.8，15.0，22.3，26.2，27.5，29.2，29.7，39.7，40.4，42.5，42.9，47.3，53.1，55.0，68.0，80.3，179.5，以上波谱数据与文献(Zeng Y.B.et al，J.AM.CHEM.SOC.2005，127：15712-1571)完全一致，所以该化合物1鉴定为stenine。

化合物2(neostenine)：

白色块状结晶(甲醇)，与Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MS m/z：278(M+H)⁺。¹H NMR(400MHz)δ0.99(t，J＝7.2Hz，3H)，1.22(dd，J＝7.2Hz，3H)，1.41(m，2H)，1.56-1.91(complex，10H)，2.05(m，1H)，2.29(m，2H)，2.48(m，2H)，2.89(m，2H)，3.19(m，1H)，4.51(m，1H)；¹³C NMR(100MHz)δ10.0，11.2，20.1，21.1，28.0，28.2，30.0，34.2，37.2，37.4，42.4，42.7，55.6，55.8，70.9，79.7，179.5.以上波谱数据与文献(Lainchbury M.D.et al，J.Org.Chem.2008，73：6497-6505)完全一致，所以该化合物2鉴定为neostenine。

化合物3(sessilifoline B)：

白色粉末，Dragendorff试剂显橙红色。结合¹³C NMR谱和DEPT谱及高分辨质谱(m/z 278.4092[M+H]⁺)确定化合物分子式为C₁₇H₂₇NO₂(m/z278.4092[M+H]⁺，C₁₇H₂₈NO₂的分子量计算值为278.4086)。¹H，¹³C NMR、DEPT和HMQC谱显示该化合物有7个sp³杂化的次甲基、7个sp³杂化的亚甲基、一个酯羰基(δ_C 177.78)和两个甲基。在这些基团当中，有一个连氧的次甲基(δ_H 4.15(br s)；δ_C 79.77)、一个连接到N上的次甲基(δ_C 65.27)和两个连接到N上的亚甲基(δ_C 52.66，52.33)。¹H NMR和¹³C NMR谱图数据与具有C₁₇H₂₇NO₂分子式的百部碱如neostenine，stenine很相似，这表明化合物3与neostenine和stenine具有相同的平面结构，不同之处在于相对构型。在化合物3的NOESY谱中，可观察到如下相关峰：H-11对H-17、H-16、H-8、H-9、H-12、和H-13；CH₃-15对H-1和H-10。上述相关峰表明H-8、H-9、H-11、H-12、H-13在环的同面，而CH₃-15和H-1处在环的另一面。因此化合物3的结构可确定为如下结构：

化合物3(sessilifoline B)的结构

化合物3的结构与文献报道(Qian J et al.，Helvetica Chimica Acta，2007，90：326-331)的sessilifoline B结构完全一致。化合物3在多种溶剂中都不能结晶，因此无法通过单晶X-衍射实验进一步确证。将化合物3用30％H₂O₂处理即可得到其N-氧化物，此N-氧化物在甲醇中重结晶得到无色针状晶体。通过单晶X-衍射实验确定N-氧化物的结构如下：

化合物3的N-氧化物的结构

化合物3的N-氧化物经单晶X-衍射分析得出的结构

上述实验进一步确证了化合物3的结构为本发明中所述的结构。化合物3的光谱及理化数据如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.57(m，1H)，2.25(dt，J＝12.4，6.0Hz，1H)，1.60(m，1H)，3.65(m，1H)，3.47(m，1H)，2.96(m，1H)，3.13(m，1H)，1.62(m，1H)，1.35(m，1H)，1.84(m，2H)，1.66(m，2H)，2.13(m，1H)，2.07(m，1H)，2.03(m，1H)，4.15(br s，1H)，2.42(m，1H)，2.79(dq，J＝7.2，3.8Hz，1H)，1.18(d，J＝7.2Hz，3H)，1.38(m，2H)，1.91(t，J＝7.2Hz，3H)。¹³C NMR(125MHz，CDCl3)δ33.4(C1)，29.1(C2)，52.6(C3)，52.3(C4)，27.3(C5)，22.3(C6)，30.5(C7)，37.5(C8)，65.3(C9)，46.8(C10)，79.9(C11)，45.2(C12)，41.5(C13)，177.8(C14)，11.4(C15)，24.9(C16)，12.9(C17)。ESI-MS m/z：278(M+H)⁺。

化合物4(neotuberostemonin)：

白色块状结晶(甲醇)，与Dragendorff试剂显橙红色。¹H NMR(400MHz)δ1.75(m，1H)，1.65(m，2H)，3.30(dd，J＝7.7，14.0Hz，1H)，3.05(m，1H)，2.92(m，1H)，1.67(m，2H)，1.64(m，1H)，1.48(m，1H)，1.91(m，1H)，1.65(m，1H)，1.85(m，1H)，3.17(dd，J＝3.8，3.9Hz，1H)，1.72(m，1H)，4.51(dd，J＝3.3， 3.0Hz，1H)，2.07(m，1H)，2.88(dq，J＝6.7，7.1Hz1H)，1.23(d J＝7.1Hz，3H)，1.35(m，1H)，1.65(m，1H)，0.99(d J＝7.3Hz，3H)，4.38(m，1H)，2.36(m，1H)，1.45(m，1H)，2.59(m，1H)，1.26(d J＝7.0Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz)δ10.2，11.1，14.8，21.1，22.9，28.7，29.0，32.7，34.7，34.8，34.9，36.0，37.3，41.6，42.6，50.8，67.2，67.2，78.6，78.6，179.0，179.1，以上波谱数据与文献(Ye Y.et al.Phytochemistry，1994，37：1201-1203)完全一致，所以该化合物4鉴定为neotuberostemonin。

实施例2：改良的Ellman法测定百部生物碱单体成分的抗乙酰胆碱酯酶活性

利用改良的Ellman方法测定百部生物碱单体成分化合物1-4对乙酰胆碱酯酶的抑制率，石杉碱甲作为阳性对照药。具体实验过程如下：

运用96孔酶标板来测定样品对酶的抑制活性，样品组中每孔加入140μL0.1M的磷酸缓冲液(pH＝8.0)，然后加入20μL的样品，空白孔中加入160μL磷酸缓冲液不加任何样品，阳性对照控制组中加入20μL 0.1mg/mL的毒扁豆碱和140μL的磷酸缓冲液，样品本底孔中20μL的样品和155μL的磷酸缓冲液，除了样品本底以外的其它孔中均加15μL的乙酰胆碱酯酶，混匀在4℃下培养20min，然后每孔加10μL 0.01mM的DTNB(5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸))和10μL 0.075mM的ATCI(碘化硫代乙酰胆碱)，混匀在37℃下培养20min，立即在405nm下测定各孔OD值。每组实验重复三次。并以下面公式计算样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

根据量效关系和直线回归法可以计算出样品对酶的半数抑制浓度值(IC₅₀)。结果表明化合物1-4对乙酰胆碱酯酶具有不同程度的抑制活性。并测定了活性较好的化合物1和化合物3的半数抑制浓度(IC₅₀)，发现IC₅₀较低，说明具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性。实验数据见表1。

表1 改良的Ellman法测试结果

实施例3：Morris水迷宫实验

健康昆明种雄性小鼠110只，随机分成11组：正常对照组、模型对照组、化合物1-4高剂量组(1mg/kg)、化合物1-4低剂量组(0.5mg/kg)和多奈哌齐对照组(0.1mg/kg)。除正常对照组和模型对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠每天固定时段腹腔注射给药1次，连续5d。给药2d后进行水迷宫定位航行训练。除正常对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠均在训练前腹腔注射东莨菪碱2mg/kg。末次给药1h后进行定位航行训练，24h后进行空间探索试验，测试2min内各组小鼠在Morris水迷宫实验中的逃避潜伏期。结果表明：与正常对照组比较，模型组的潜伏期明显增加，说明东莨菪碱可造成小鼠空间记忆障碍。与模型组比较，化合物1和3均能明显缩短小鼠潜伏期，说明化合物1和3均能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力。而化合物2和4在一定程度上能缩短小鼠潜伏期，改善痴呆小鼠的学习记忆能力，但作用较弱。实验数据见表2。

表2 Morris水迷宫实验测试结果

组别	动物数(只)	平台象限游泳时间
			正常对照组	10	35.3±7.9^**
模型对照组	10	63.2±16.8^★★
			化合物1高剂量组	10	42.4±11.5^**

[0044]

化合物1低剂量组	10	47.8±13.2^**
			化合物2高剂量组	10	54.5±14.7^*
化合物2低剂量组	10	60.1±17.4
			化合物3高剂量组	10	38.9±8.8^**
化合物3低剂量组	10	41.1±9.4^**
			化合物4高剂量组	10	55.5±13.5^*
化合物4低剂量组	10	59.9±14.3
			多奈哌齐对照组	10	38.3±8.1^**

^★：模型对照组与正常对照组比较P＜0.01；^*：与模型对照组比较P＜0.05，^**：与模型对照组比较P＜0.01。

Claims

1.百部生物碱单体成分，由stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin四个化合物组成，结构分别为：

。

2.百部生物碱单体的用途，百部生物碱单体成分stenin、neostenine、sessilifoline B、neotuberostemonin能用于作为乙酰胆碱酯酶抑制剂。

3.根据权利要求2所述百部生物碱单体的用途，其特征在于乙酰胆碱酯酶抑制剂是指用于老年痴呆症，或者肠梗阻，或者重症肌无力，或者青光眼的药物。

4.根据权利要求2所述百部生物碱单体的用途，其特征在于与药学上可以接受的载体，或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂。