CN101712649B

CN101712649B - 一种荷叶提取物及其单体成分和其用途

Info

Publication number: CN101712649B
Application number: CN2009101175962A
Authority: CN
Inventors: 杨中铎; 张旭; 杨明俊; 张东博; 任晋
Original assignee: Lanzhou University of Technology
Current assignee: Lanzhou University of Technology
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2029-11-13
Also published as: CN101712649A

Abstract

一种荷叶提取物及其单体成分和其用途，该提取物的活性单体成分为阿朴啡类生物碱，包括2-羟基-1-甲氧基阿朴啡(2-hydroxy-1-methoxy-aporphine)，荷叶碱(nuciferine)和N-降荷叶碱(N-nornuciferine)。荷叶提取物及单体成分对乙酰胆碱酯酶均有较好的抑制作用，可开发成治疗阿尔茨海默病、青光眼、重症肌无力和肠梗阻等疾病的药物。

Description

一种荷叶提取物及其单体成分和其用途

技术领域

本发明涉及医药领域。

背景技术

乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。如果抑制该酶的活性，即可产生拟胆碱作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂主要用于预防和治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease即老年性痴呆，简称AD)，另外对青光眼、重症肌无力、肠梗阻等症的治疗也有较好的作用(金有豫.药理学(第五版)，2001；54-55.)。

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以进行性痴呆为特征的大脑退行性变性疾病，严重影响患者的认知功能、记忆功能、个人生活能力和情感人格等。研究表明AD患者的胆碱能系统受到损害，导致突触部位乙酰胆碱含量降低，因此增加脑内乙酰胆碱水平可以改善AD患者的症状。乙酰胆碱酯酶抑制剂可抑制乙酰胆碱酯酶活性，使脑内神经突触间乙酰胆碱含量增加，从而发挥治疗AD的作用。

荷叶为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥叶。民间广泛用于食物及药物中。由于荷叶使用价值较大且来源广泛，近年来人们加大了对其活性化学成分和药理方面的研究。荷叶生物碱是荷叶的主要成分，含有莲碱(Roemerine)、原荷叶碱(Pronuciferine)和荷叶碱(Nuciferine)等多种生物碱。人们通过研究已经发现荷叶生物碱具有减肥降脂、降血压、抗衰老、抑菌及抗病毒等作用(雷红松.吉首大学学报(自然科学版)，2007；28(5)：92-94)。但到目前为止，未见荷叶生物碱及其单体成分对乙酰胆碱酯酶抑制的活性报道。

发明内容

本发明的目的是提供荷叶提取物及其有效单体化合物在制备抗乙酰胆碱酯酶药物中的应用。

本发明是一种荷叶提取物及其单体成分和其用途，其荷叶提取物及其单体成分的有效单体成分为阿朴啡类生物碱，其单体为：化合物1为2-羟基-1-甲氧基阿朴啡；化合物2为荷叶碱；化合物3为N-降荷叶碱。其用途为乙酰胆碱酯酶抑制剂。

本发明采用Ellman方法(Ellman G.L..Biochemical Pharmacology，1961；7：88-95)，薄层色谱生物自显影方法(Yang ZD.Journal of SeparationScience，2009；32：3257-3259)研究了荷叶总生物碱提取物及其有效单体成分的抗乙酰胆碱酯酶活性，并且研究了荷叶总生物碱和单体成分中活性最好的化合物1(2-羟基-1-甲氧基阿朴啡)对东莨菪碱诱导的痴呆小鼠的学习记忆能力的影响(姜红柳.中国药理学通报，2008；24(10)：1399-1400)。结果显示，荷叶总生物碱提取物和其单体成分均是良好的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂；荷叶总生物碱提取物和化合物1能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力。荷叶总生物碱提取物及其一个或几个单体成分与药学上可以接受的载体或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型和非口服给药的注射剂或其它剂型，可以在临床上用于开发抗乙酰胆碱酯酶活性药物与治疗神经退行性疾病(阿尔茨海默病等)。

附图说明

图1有效单体成分的薄层色谱生物自显影测试结果图。

具体实施方式

本发明所述的总生物碱提取物的有效单体成分主要是阿朴啡类生物碱，具体包含化合物1为2-羟基-1-甲氧基阿朴啡(2-hydroxy-1-methoxy-aporphine)，化合物2为荷叶碱(nuciferine)，化合物3为N-降荷叶碱(N-nornuciferine)，化合物结构如下，其中化合物1-3的骨架编号顺序相同：

化合物1(2-羟基-1-甲氧基阿朴

化合物2(荷叶碱)

化合物3(N-降荷叶碱)

如图1所示，为有效单体成分的薄层色谱生物自显影测试结果图，从1道到4道依次为毒扁豆碱(阳性对照药)，化合物1(2-羟基-1-甲氧基阿朴啡)，化合物2(荷叶碱)，化合物3(N-降荷叶碱)。

本发明的荷叶提取物及其单体成分的用途，为乙酰胆碱酯酶抑制剂。本发明所述乙酰胆碱酯酶抑制剂是指用于老年痴呆症，或者肠梗阻，或者重症肌无力，或者青光眼的药物。以上所述的荷叶提取物及其单体成分的用途，与药学上可以接受的载体，或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或其它剂型。

化合物1为2-羟基-1-甲氧基阿朴啡(2-hydroxy-1-methoxy-aporphine)，其结构鉴定如下：

白色针状结晶(甲醇)，与Dragendorff试剂作用显橙红色。ESI-MS m/z：281(M⁺)，280(M-1)，266(M-CH₃)，251(M-2×CH₃)，250(M-31)。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：2.55(s，N-CH₃)，2.49(d，1H)，2.68(t，2H)，3.01(t，2H)，3.11(t，2H)，3.56(s，O-CH₃)，6.64(s，1H)，7.26(m，3H)，8.27(d，1H)。以上光谱数据与文献(李志诚.中草药，1996；27卷增刊：50-52)报道相附。¹³C-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：143.1(C₁)，125.7(C_1a)，126.8(C_1b)，148.3(C₂)，114.1(C₃)，129.4(C_3a)，28.5(C₄)，53.2(C₅)，62.2(C_6a)，34.6(C₇)，136.1(C_7a)，127.2(C₈)，127.3(C₉)，127.5(C₁₀)，128.0(C₁₁)，131.7(C_11a)，43.5(N-Me)。以上光谱数据与文献(GuinaudeauH..Journal of Natural Products，1979；42(4)：325-360)报道相附，故该化合物鉴定为2-羟基-1-甲氧基阿朴啡。

化合物2为荷叶碱(nuciferine)，其结构鉴定如下：

白色颗粒状结晶(甲醇)，与Dragendorff试剂作用显橙红色。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：2.55(s，N-CH₃)，3.65(s，O-CH₃)，3.88(s，O-CH₃)，6.63(s，1H)，7.26(m，3H)，8.36(d，1H)。以上光谱数据与文献(李志诚.中草药，1996；27卷增刊：50-52)报道相附。¹³C-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：145.3(C₁)，128.3(C_1b)，152.1(C₂)，111.3(C₃)，127.3(C_3a)，28.8(C₄)，53.1(C₅)，62.2(C_6a)，34.8(C₇)，136.0(C_7a)，127.8(C₈)，127.3(C₉)，127.0(C₁₀)，126.9(C₁₁)，132.0(C_11a)，43.6(N-Me)，60.1(C₁-OMe)，55.8(C₂-OMe)。以上光谱数据与文献(Guinaudeau H..Journal ofNatural Products，1979；42(4)：325-360)报道相附，故该化合物鉴定为荷叶碱。

化合物3为N-降荷叶碱(N-nornuciferine)，其结构鉴定如下：

白色针状结晶(甲醇)，与Dragendorff试剂作用显橙红色。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：3.67(s，O-CH₃)，3.88(s，O-CH₃)，6.65(s，1H)，7.29(m，3H)，8.39(d，1H)。¹³C-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：145.5(C₁)，126.7(C_1a)，152.6(C₂)，111.7(C₃)，29.6(C₄)，42.6(C₅)，53.3(C_6a)，36.4(C₇)，135.2(C_7a)，128.4(C₈)，127.9(C₉)，127.6(C₁₀)，127.2(C₁₁)，132.0(C_11a)，60.2(C₁-OMe)，55.9(C₂-OMe)。以上光谱数据与文献(Guinaudeau H..Journal of Natural Products，1983；46(6)：761-835)报道相附，以上光谱数据与文献报道相附，故该化合物鉴定为N-降荷叶碱。

本发明的荷叶提取物为荷叶总生物碱，选取的荷叶药材符合《中华人民共和国药典》2005版“荷叶”项下的各项规定。

通常提取荷叶总生物碱采用“酸提碱沉”法，但又有水提和醇提两种工艺。为了兼顾得率和纯度，本发明采用了醇提取的方法。具体的工艺路线如下：首先将荷叶药材粉碎成粉末状。第一次采用药材质量5～8倍的比例加入95％甲醇或90％乙醇热回流提取1～2小时；第二次按照药材质量2～5倍的比例加入95％甲醇或90％乙醇热回流提取1小时。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用6M的浓盐酸调pH值到1～2，静置12-18小时后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9～11，然后用中极性有机溶剂萃取2-4次，萃取液合并浓缩至干，得到荷叶总生物碱提取物。

本发明的有效单体成分的分离：

上述步骤中制得的荷叶总生物碱提取物经过柱层析、薄层色谱制备和重结晶等，得到化合物1，化合物2和化合物3。首先，总生物碱提取物通过MCI-gel柱层析甲醇梯度洗脱(50％，60％，70％，80％)得到A，B，C，D四个流分。流分B经反复葡聚糖凝胶柱层析、薄层色谱和硅胶柱层析制备得到化合物1。流分D经甲醇重结晶得到化合物2。流分C经反相柱层析和薄层色谱制备得到化合物3。

下面结合具体实施例进一步对本发明的荷叶提取物及其单体提取过程进行描述，但具体方法不局限于以下所述过程。

荷叶总生物碱提取物的制备：

称取荷叶粉末600g置于圆底烧瓶中，加入90％乙醇4.5L热回流提取2小时，抽滤干；再加入90％乙醇2L热回流提取1小时，再抽滤。两次的提取液合并浓缩至干，加1.5L蒸馏水溶解，用6M的浓盐酸调pH值到2，静置15小时后抽滤。滤液用1M氢氧化钠水溶液调pH值到10。每次加入1L氯仿萃取，共萃取2次，萃取液合并浓缩至干，得到荷叶总生物碱2.36g。

有效单体成分的分离：

取10g荷叶总生物碱提取物，用甲醇溶解后上MCI-gel(CHP 20P75-150μm)柱，甲醇(50％，60％，70％，80％)梯度洗脱得到流分A，B，C，D。流分B上LH-20柱100％甲醇洗脱进行脱色富集，然后通过薄层色谱制备得到化合物131mg。流分D用甲醇重结晶得到化合物221mg。流分C上YMC柱，甲醇(50％，60％，70％)梯度洗脱得到流分C-1，C-2，C-3，其中C-1通过薄层色谱制备得到化合物314mg。

Ellman法测荷叶总生物碱提取物和有效单体成分的抗乙酰胆碱酯酶活性：

利用经典的Ellman方法分别测定了荷叶总生物碱提取物和化合物1、化合物2、化合物3(浓度均为100μg/mL)的抑制率，石杉碱甲作为阳性对照药。结果表明四个样品均对乙酰胆碱酯酶均有不同程度的抑制。又测定了活性较好的总生碱提取物和化合物1的半数抑制浓度(IC₅₀)，发现其IC₅₀较低。实验数据见表1。

表1Ellman法测试结果

薄层色谱生物自显影法测试有效单体成分的抗乙酰胆碱酯酶活性：

在硅胶GF254板上从左到右依次点毒扁豆碱(3×10^-2μg)，化合物1(1μg)，化合物2(1μg)，化合物3(1μg)，氯仿∶甲醇＝20∶1展开，将溶剂吹干，喷上乙酰胆碱酯酶溶液(1.0U/mL)，用吹风机冷风吹至半干，接着喷乙酸-1-萘酯溶液(1.5mg/mL，40％乙醇配制)用冷风吹至半干，37℃密闭湿润环境下培养20min，取出喷快蓝盐溶液(0.5mg/mL)，即生成紫色背景，样品点均显白色，说明对乙酰胆碱酯酶有抑制作用。实验结果如图1所示。

Morris水迷宫实验：

选健康昆明种雄性小鼠70只，随机分成7组：即正常对照组、模型对照组、荷叶总生物碱高剂量组(100mg/kg)、荷叶总生物碱低剂量组(50mg/kg)、化合物1高剂量组(1mg/kg)、化合物1低剂量组(0.5mg/kg)和多奈哌齐对照组(0.1mg/kg)。除正常对照组和模型对照组腹腔注射等量的生理盐水外，各组小鼠每天固定时段腹腔注射给药1次，连续5d。给药2d后进行水迷宫的定位航行训练。除正常对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠均在训练前90分钟腹腔注射东莨菪碱2mg/kg。末次给药后24小时进行空间探索试验，测试2分钟内在平台象限游泳的时间。结果表明，荷叶总生物碱和化合物1都能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力，实验数据见表2。

表2Morris水迷宫实验测试结果

备注：带＊为与两对照组比较P＜0.01

Claims

1.2-羟基-1-甲氧基阿朴啡、荷叶碱和N-降荷叶碱在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的用途。

2-羟基-1-甲氧基阿朴啡

荷叶碱

N-降荷叶碱

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于乙酰胆碱酯酶抑制剂是指用于老年痴呆症，或者肠梗阻，或者重症肌无力，或者青光眼的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于与药学上可以接受的载体，或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或其它剂型。