JP2017524709A - 肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製におけるアルカロイドの応用 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製におけるアルカロイドの応用に関する。【解決手段】肺線維症を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、構造式Ｉに示される化合物の新たな用途を開示する。構造式１を有する化合物は、病変した肺組織の炎症レベルを著しく軽減させ、病変した肺組織中の線維化を促進する増殖因子ＴＧＦ−β１の含有量を低下させ、病変した肺組織中のコラーゲンの過剰沈着を減少させることができ、肺線維症の予防及び治療に対し著しい効果を有している。【化１】【選択図】なし

Description

本発明は、抗肺線維症活性を有するアルカロイドに関し、特に肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における構造式Ｉに示されるようなアルカロイドの使用に関する。

肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＰＦ）は、肺炎で肺胞損害が持続的に引き起こされることによって過度な細胞修復を招き、細胞外マトリックスが過剰沈着し、正常な肺組織の構造変化、機能喪失に至る病気であり、臨床症状は進行性呼吸困難、息切れ、疲労、病状の持続的進行が見られる。通常に言えば、肺線維症は、肺組織の瘢痕が積み重なり、肺胞が徐々に繊維状物質に変質することで、肺組織が硬化膨隆し、徐々に酸素交換能力が失われて、異なるレベルの酸素欠乏が生じて、患者が呼吸困難に陥り、最終的に呼吸不全で死に至ることである。過去２０年間、環境汚染によってその発症率は年々増加している。現在、肺線維症の治療は、プレドニゾン、シクロホスファミド、コルヒチンなどの糖質コルチコイド、免疫抑制剤が主流となっている。近年の臨床実践では、臓器の線維症に対して、糖質コルチコイド、抗生物質及び免疫抑制剤を使用することで初期段階の肺胞の炎症を軽減し、患者の臨床症状を軽減できるが、線維症の進行を抑制することはできず、ステロイドや抗生物質を長期に渡って大量使用することで、重大な合併症を引き起こし、さらには線維症を悪化させてしまうことが実証されている。病因と発症メカニズムが不明であるため、今でも肺線維症の治療は医療分野の難題の一つとなっており、新薬の研究開発が継続して行われてはいるものの有効な治療プログラムや専用治療薬は見つかっておらず、予後が悪い平均寿命はわずか３年であり、５年の生存率は５０％未満であるため、非がん性のがんと呼ばれている。

肺線維症の発症メカニズムは明らかではないが、体内のコラーゲン代謝の不均衡が生じて、コラーゲンの合成量が分解量を上回ることが共通の特徴であるため、肺線維症の発症は、様々なサイトカインによって開始及び維持されるコラーゲンの代謝調節が異常をきたした結果であると思われる。近年の国内外の研究では、肺線維芽細胞の増殖、形質転換及び分泌に対し重要な調節作用を持つサイトカインが注目されている。多数の肺線維症の患者組織中に炎症と線維化が併存することを観察できる。持続性炎症による損傷で線維化が引き起こされるが、肺線維症の発生過程では、ＴＧＦ−β１、ＦＧＦｓ、ＰＤＧＦｓ、ＶＥＧＦｓ等のサイトカインが重要な作用を果たしている。その中では、ＴＧＦ−β１は、公知の線維化を促進するマーカーであり、肺線維症の発生及び形成と最も関係している媒介因子であり、ＴＧＦ−β１のアップレギュレーションが古典のＳｍａｄの下流シグナル経路を活性化させ、細胞を刺激して、細胞外マトリックスを大量に合成と分泌させ、細胞外マトリックスの沈着及び線維化過程での、上皮間葉転換を悪化させて、線維化の進行を速めるため、ＴＧＦ−β１は抗線維化における主要なターゲットとされている。肺組織中のヒドロキシプロリン含量はコラーゲン含量を示すことができ、ＴＧＦ−β１の発現レベルは肺線維症に対する薬剤介入の推定メカニズムを示し、即ち薬剤が炎症を抑制することではなく、ＴＧＦ−β１のレベルを低下させることによってＴＧＦ−β１／Ｓｍａｄ経路を抑制し、それにより肺線維症のレベルを軽減させる、というものである。例えば、日本、インド、ＥＵで最新販売されているピルフェニドン（ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）は、ＴＧＦ−β１等の線維化を促進する増殖因子を阻害できるが、臨床では光線過敏症など多くの副作用を有する。

咳嗽は呼吸器疾患によく見られる症状であるが、多くの呼吸器疾患と同じように、肺線維症がその初期段階において咳嗽の症状も出る。咳嗽と肺線維症は多少関連するものの、それらは全く異なるものである。咳嗽は多くの呼吸器疾患に発現する症状ではあっても、厳密に言えば実際の疾患ではない。肺線維症の初期及び進行段階においても咳の症状が現れ、咳止め薬によって肺線維症が原因となる初期の咳嗽や喘息などの症状を緩和されるが、病状が激しく進行する場合に咳止め薬は効果がなくなり、ステロイドや抗生物質を使用して症状を緩和することしかない。これらはみな対症療法であり、肺線維症を根本的に治療又は阻止することはできず、ステロイドや抗生物質を長期に使用することで肺線維症の進行をさらに悪化、加速させることでできる。

要約すると、現在、肺線維症の有効な治療法がない現状であり、肺線維症の症状を軽減又は治療するための効果の高い新たな治療薬の開発が急務となっている。

漢方薬のビャクブは、ビャクブ科（Ｓｔｅｍｏｎａｃｅａｅ）ビャクブ属（Ｓｔｅｍｏｎａ）に属する多種植物であり、潤肺下気、止咳、駆虫の薬能を有し、臨床では主に百日咳、肺結核、慢性の咳嗽の治療、頭・体の蟯虫症の外用治療に用いられている。ステモナアルカロイドはビャクブの主要な有効成分であり、タマビャクブから分離して得られたｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｊ，ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｈ，ｉｓｏｓｔｅｎｉｎｅ及びｎｅｏｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅなどの化合物は、クエン酸が誘発したモルモットの咳嗽に対し良好な鎮咳作用を有しており、中でもｉｓｏｓｔｅｎｉｎｅ、ｎｅｏｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅの鎮咳効果はコデインと同等、ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｊ及びｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｈの鎮咳効果はそれに若干劣ることが既に研究で明らかになっている。同様に、タマビャクブ中のｃｒｏｏｍｉｎｅ、ｎｅｏｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ、ｓｔｅｍｏｎｉｎｉｎｅの鎮咳活性は相当であり、ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅの活性はやや弱いことが研究で分かっている。メカニズム研究では、ｎｅｏｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ、ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ及びｓｔｅｍｏｎｉｎｉｎｅが末梢性咳嗽反射経路に作用する、末梢性鎮咳薬に属し、ｃｒｏｏｍｉｎｅは咳中枢を抑制することで鎮咳作用が発揮されることが分かっている。肺線維症の症状の一つが咳嗽であるとしても、今のところ鎮咳薬が肺線維症を改善又は治療できる事に関する何らかの研究報告はなされていない。

ステモナアルカロイドに関する特許は数少なく、その多くは総アルカリの調製方法又はアルカロイドの鎮咳や殺虫活性に関するものである。それ以外に構造式Ｉで示されるようなアルカロイドに関する特許は１件しかなく（特許文献１：２０１２１０１４９９５４．Ｘ）、その用途はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の調製である。今現在、ネオツベロステモニンが肺線維症の予防又は治療効能を有する、或いは肺線維症の治療薬中で使用することという文献は報告されていない。

中国特許出願番号２０１２１０１４９９５４．Ｘ

本発明は、肺線維症の予防又は治療に有効な薬が足りない状況に対し、構造式Ｉに示されるアルカロイドの新たな用途を開示しており、該アルカロイドは肺線維症を効果的に予防又は治療することができる。

本発明の技術案は、肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における構造式Ｉに示されるアルカロイドの応用である。

式中：
Ｒ_１は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基、α又はβのメチル基−γ−ブチロラクトン基から選択される；
Ｒ_２は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基から選択される；
Ｒ_３は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基から選択される；
或いはＲ_２、Ｒ_３は、下記の式のような環状のα又はβ構造である：

式中：Ｒ_８は、α又はβアルキル基から選択される；
Ｒ_４は、α又はβアルキル基から選択される；
Ｒ_５は、α又はβ水素から選択される；
Ｒ_６は、α又はβ水素、α又はβ−ヒドロキシ基から選択される；
Ｒ_７は、α又はβ水素から選択される。

肺線維症の予防及び／又は治療用医薬組成物の調製における化合物の使用であって、その化合物は構造式Ｉａを有する。

式中：
Ｒ_１は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基、α又はβのメチル基−γ−ブチロラクトン基から選択される；
Ｒ_２は、α又はβ水素から選択される；
Ｒ_３は、α又はβ水素から選択される；
Ｒ_４は、α又はβアルキル基から選択される；
Ｒ_５は、α又はβ水素から選択される；
Ｒ_６は、α又はβ水素、α又はβヒドロキシ基から選択される；
Ｒ_７は、α又はβ水素から選択される；
Ｒ_８は、α又はβアルキル基から選択される。

上述の応用では、上述の化合物は、構造式Ｉに示されるアルカロイド又はその医薬用誘導体であることを特徴とする。

上述の応用では、上述の化合物の医薬用誘導体は、構造式Ｉに示されるようなアルカロイドの塩又はエステルであることを特徴とする。

上述の応用では、上述の医薬組成物は、少なくとも一種の構造式Ｉに示されるアルカロイドの活性成分及び一種の薬用担体が含まれることを特徴とする。

上述の応用では、上述の医薬組成物は、質量パーセントが０．０１％〜９９％の構造式Ｉに示されるアルカロイド及び質量パーセントが０．０１％〜９９％の薬用担体が含まれることを特徴とする。

本発明で述べる「肺線維症」とは、特発性肺線維症の病態生理学的変化を特徴とする、様々な要因で人間又は動物に引き起こす肺線維症を指す。

上述の「予防」とは、肺線維症をもたらしかねない要素が存在する状況下で、使用後に肺線維症の発症を防止又は低減させることを指す。上述の「治療」とは、肺線維症のレベルを軽減させる、又は肺線維症を正常な状態に治癒させる、或いは肺線維症の進行を遅くさせることを指す。

アルカロイドの塩又はエステルとは、薬学的に許容される塩、エステルなどの形態を指す。

上述の医薬組成物には、少なくとも一種の構造式Ｉに示されるアルカロイドの活性成分及び一種の薬用担体が含まれることを特徴とする。いわゆる「活性成分」とは、肺線維症の予防又は治療効果を有することを指す。該組成物において、該アルカロイドは単独又は他の化合物と一緒に活性成分として使用してよい。上述の薬用担体は、薬学的に許容される賦形剤、充填剤、希釈剤などが含まれる。該医薬組成物において、構造式Ｉに示されるアルカロイドの含有量は０．０１％〜９９％であり、薬用担体の含有量は０．０１％〜９９％であり、百分率は質量パーセントである。

上述の医薬組成物の投与形態は特に限定されず、固体、半固体又は液体の形態でもよく、水溶液、非水溶液又は懸濁液でもよく、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内又は皮下投与でもよい。該医薬組成物の１日投与量は約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇである。

肺線維症の予防又は治療において、上述の構造式Ｉに示されるアルカロイドの医薬組成物は、単独使用又は他の薬剤と組み合わせて使用できる。

本発明の上述の構造式Ｉに示されるアルカロイドは、ビャクブ科植物中から分離して得られるが（９８％以上の純度）、それ以外の原料又は試薬は市販品から調達できる。

１．本発明は、肺線維症の予防又は治療に用いられる、構造式Ｉに示されるアルカロイドの化合物を提供するが、該化合物はブレオマイシン誘発性肺線維症マウスに対する顕著な予防及び治療効果を有し、実験動物の肺線維症レベルを明らかに軽減することが生体外実験によって証明されており、肺線維症の治療薬の調製に使用することができる。また通常の咳止め薬は肺線維症に効果がないことも同時に説明した。本発明は、構造式Ｉに示される種々の化合物（Ｉ−ＶＩＩＩ）が肺線維化を抑制する効果があることを初めて発見したもので、これより以前に文献で報告されていない。

具体的には：本発明の結果は、構造式Ｉに示される母核を有する化合物、例えば化合物 Ｉ〜ＶＩＩＩなどの８つの化合物が、肺線維症の予防及び／又は治療に顕著な効果（実施例３）があることを示している。化合物Ｉ及びＶＩＩ（Ｒ１側鎖を有する））、ＶＩＩＩ（Ｒ１側鎖なし）など３つの化合物の活性研究では、構造式Ｉに示される構造は肺線維化を抑制する効果があることが一層明らかになった。多重指標モデルの動物実験結果では、該類化合物は肺線維症改善効果が近頃日本で発売された陽性対照のピルフェニドンより優れており、ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの死亡を著しく減少させ、モデルマウスの肺湿乾重量比も著しい減少させ、モデルマウスの肺線維症レベルを改善し、肺組織中のＨｙｐ及び線維化促進因子ＴＧＦ−β１の含有量を著しく減少させることができることで、、構造式Ｉに示される構造を有する化合物がブレオマイシン誘発性マウスの肺炎症を緩和し、肺のコラーゲン沈着を減少させることができることが示された。本発明の結果は、構造式Ｉに示される構造を有する化合物が肺線維症の予防及び／又は治療用医薬組成物における応用において科学的根拠を提供している。

２．本発明に係る実験材料は、タマビャクブ、タチビャクブ及びツルヒャクブを主とした種々のビャクブ生薬由来であり、低価格で容易に手に入る。既に国内外で有機合成法が試みられている。

８つのアルカロイドとペントキシベリンがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスに与える影響。Ａ：ヒドロキシプロリン含有量；Ｂ：ＨＥ染色した病理スライス；Ｃ：Ｍａｓｓｏｎ染色した病理スライス。その中で、１−偽手術群、２−モデル群、３−ペントキシベリン、４−ピルフェニドン、５−化合物Ｉ、６−化合物ＩＩ、７−化合物ＩＩＩ、８−化合物ＩＶ、９−化合物Ｖ、１０−化合物ＶＩ、１１−化合物ＶＩＩ、１２−化合物ＶＩＩＩ。偽手術群に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；モデル群に比べ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺湿乾重量比に与える影響。その中で、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。偽手術群に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；モデル群に比べ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺組織の病理学的変化に与える影響（ＨＥ染色）。その中で、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺組織の炎症スコアに与える影響（ＨＥ染色）。その中で、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。偽手術群に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；モデル群に比べ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺組織の病理学的変化に与える影響（Ｍａｓｓｏｎ染色）。その中で、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺組織のコラーゲン含有量に与える影響（統計平均光学密度）。その中で、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。偽手術群にくらべ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；モデル群にくらべ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺組織のヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）含有量に与える影響。その中で、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。偽手術群に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；モデル群に比べ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ３つのアルカロイドがブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの肺組織のＴＧＦ−β１含有量に与える影響（ＥＬＩＳＡ）。図中、Ａ：予防群、Ｂ：治療群；１−偽手術群、２−モデル群、３−化合物Ｉ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物Ｉ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、５−化合物ＶＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、６−化合物ＶＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、７−化合物ＶＩＩＩ低用量（３０ｍｇ／ｋｇ）群、４−化合物ＶＩＩＩ高用量（６０ｍｇ／ｋｇ）群、９−ピルフェニドン（３００ｍｇ／ｋｇ）群。偽手術群に比べ、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１；モデル群に比べ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。

実施例１ アルカロイドの調製及び構造解析
１．生薬と試薬
生薬はタマビャクブ（Ｓｔｅｍｏｎａ ｔｕｂｅｒｏｓａ Ｌｏｕｒ．）の乾燥根であり、河北安国薬材市場にて購入。エタノール、塩化メチレン、メタノールなどの試薬はすべて分析級試薬とする。

２．抽出分離
タマビャクブ生薬に９０％エタノールを使用し、パーコレーション法による抽出し、浸透液を濃縮した後にＴＬＣ検出法でヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応が基本的に無い状態になるまで続ける。浸透濃縮液に希塩酸５％を添加してｐＨを１−２に調整し、濾過し、ろ液を濃アンモニア水でｐＨを１０に調整し、クロロホルムで抽出し、クロロホルムを回収して総アルカロイド分画を得る。総アルカロイドをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ジクロロメタン−メタノール勾配（１００：０〜１：５）で溶出し、ＴＬＣの結果に基づき同じ成分を混同して、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ジクロロメタン−メタノール（１００：０）で溶出した画分から分離して化合物Ｉ及び化合物ＶＩＩを得て、残りの部分は分取高速液体クロマトグラフィーを用いて、アセトニトリル−水（４２：５８）で溶出し、分離して化合物ＩＩを得る。ジクロロメタン−メタノール（１００：２）の溶出画分から分離して化合物ＩＶ及び化合物ＩＩＩを得て、残りの部分は分取高速液体クロマトグラフィーを用いて、アセトニトリル−水（２３：７７）で溶出し、分離して化合物Ｖ及び化合物ＶＩを得る。ジクロロメタン−メタノール（１００：４）の溶出画分から分離して化合物ＶＩＩＩを得る。上記の化合物をＨＰＬＣで分析して、純度はすべて９８％以上であった。

３．構造解析
化合物Ｉ（Ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ、ツベロステモニン）：無色針状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）δ：１．８０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１），２．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２α），１．１０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２β），３．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．４７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５α），２．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５β），１．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．８２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），３．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，４．０Ｈｚ，Ｈ−９ａ），１．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０），４．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，３．５Ｈｚ，Ｈ−１１），２．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２），２．４１（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．５，７．５Ｈｚ，Ｈ−１３），１．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−１５），１．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１６），０．９６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１７），４．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．３８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．５，１５．５Ｈｚ，Ｈ−１９），２．６０（１Ｈ，ｄｄｑ，Ｊ＝７．０，５．５，１２．０Ｈｚ，Ｈ−２０），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：４１．６（Ｃ−１），３２．１（Ｃ−２），６５．０（Ｃ−３），４８．１（Ｃ−５），２８．１（Ｃ−６），２９．９（Ｃ−７），３０．４（Ｃ−８），４０．７（Ｃ−９），６３．６（Ｃ−９ａ），４５．０（Ｃ−１０），８０．３（Ｃ−１１），４７．３（Ｃ−１２），４０．９（Ｃ−１３），１７９．２（Ｃ−１４），１４．７（Ｃ−１５），２４．３（Ｃ−１６），１１．２（Ｃ−１７），８１．４（Ｃ−１８），３４．６（Ｃ−１９），３４．８（Ｃ−２０），１７９．４（Ｃ−２１），１４．９（Ｃ−２２）。

化合物ＩＩ（Ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ａ）：無色針状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）δ：１．８１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１），１．８４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），１．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．０９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），２．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．４４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），１．６５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），２．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，４．０Ｈｚ，Ｈ−９ａ），１．４２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０），４．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，３．５Ｈｚ，Ｈ−１１），２．０１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２），２．３３（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．５，７．５Ｈｚ，Ｈ−１３），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−１５），１．６４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１６），０．９１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１７），４．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．３７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．５，１５．５Ｈｚ，Ｈ−１９），２．６９（１Ｈ，ｄｄｑ，Ｊ＝７．０，５．５，１２．０Ｈｚ，Ｈ−２０），１．３０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：４１．４（Ｃ−１），３２．６（Ｃ−２），６５．１（Ｃ−３），５３．３（Ｃ−５），２６．０（Ｃ−６），２９．９（Ｃ−７），２９．９ （Ｃ−８），４０．６（Ｃ−９），６８．３（Ｃ−９ａ），４２．５（Ｃ−１０），８０．２（Ｃ−１１），４６．９（Ｃ−１２），４０．１（Ｃ−１３），１７９．２（Ｃ−１４），１５．２（Ｃ−１５），２２．４（Ｃ−１６），９．８（Ｃ−１７），８０．８（Ｃ−１８），３２．５（Ｃ−１９），３５．６（Ｃ−２０），１７９．４（Ｃ−２１），１５．２（Ｃ−２２）。

化合物ＩＩＩ（Ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｊ）：無色針状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）δ：１．４０〜２．１０（１５Ｈ，Ｈ−１，２，６〜１０，１２，１６，１９），３．０２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−９ａ），２．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．７４（２Ｈ，Ｈ−５，Ｈ−１３），４．４６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１１），１．１８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１５），０．９１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１７），４．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．２５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９），２．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２０），１．２２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：３８．４（Ｃ−１），３２．４（Ｃ−２），６４．６（Ｃ−３），５０．１（Ｃ−５），３３．３（Ｃ−６），２９．５（Ｃ−７），３０．６（Ｃ−８），３４．８（Ｃ−９），６６．３（Ｃ−９ａ），３４．５（Ｃ−１０），８０．３（Ｃ−１１），４１．１（Ｃ−１２），４５．８（Ｃ−１３），１７９．３（Ｃ−１４），１１．６（Ｃ−１５），２５．４（Ｃ−１６），１２．９（Ｃ−１７），８１．２（Ｃ−１８），３４．３（Ｃ−１９），４５．１（Ｃ−２０），１７９．２（Ｃ−２１），１４．８（Ｃ−２２）。

化合物ＩＶ（Ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｈ）：無色針状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）δ：１．３０〜２．００（１６Ｈ，Ｈ−１，２，６〜１０，１２，１６，１９），３．２０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），２．８４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．７８（１Ｈ，Ｈ−５），，４．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１１），２．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１３），１．１８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１５），１．００（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１７），４．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．３５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９），２．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２０），１．２２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：４１．９（Ｃ−１），３１．１（Ｃ−２），７８．０（Ｃ−３），５４．７（Ｃ−５），２７．３（Ｃ−６），２４．１（Ｃ−７），２７．１（Ｃ−８），４１．１（Ｃ−９），６７．５（Ｃ−９ａ），３５．３（Ｃ−１０），８０．７（Ｃ−１１），４４．１（Ｃ−１２），４７．２（Ｃ−１３），１７９．４（Ｃ−１４），１１．６（Ｃ−１５），２１．２（Ｃ−１６），１１．９（Ｃ−１７），７９．２（Ｃ−１８），３３．４（Ｃ−１９），４４．８（Ｃ−２０），１７９．１（Ｃ−２１），１５．０（Ｃ−２２）。

化合物Ｖ（Ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｎ）：無色針状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）δ：１．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１），２．２１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８，６．３，５．６Ｈｚ，Ｈ−２α），１．０９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２β），３．２１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．１，６．３Ｈｚ，Ｈ−５α），２．７９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５β），１．３３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），１．４９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），１．１９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７），１．７６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７），１．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．７７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），２．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−９），３．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．９，３．８Ｈｚ，Ｈ−９ａ），１．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−１０），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，１．８Ｈｚ，Ｈ−１１），２．２６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．２，７．３，４．３Ｈｚ，Ｈ−１２），２．８１（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝７．３，７．３Ｈｚ，Ｈ−１３），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−１５），１．４２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１６），１．００（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｈ−１７），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），１．５４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９α），２．３６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５，８．４，５．４Ｈｚ，Ｈ−１９β），２．６２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２０），１．２７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：３５．２（Ｃ−１），３３．７（Ｃ−２），６５．２（Ｃ−３），５０．７（Ｃ−５），２６．９（Ｃ−６），２９．８（Ｃ−７），３２．８（Ｃ−８），４０．１（Ｃ−９），６４．２（Ｃ−９ａ），４６．９（Ｃ−１０），８１．７（Ｃ−１１），４５．２（Ｃ−１２），４１．５（Ｃ−１３），１７８．７（Ｃ−１４），１１．９（Ｃ−１５），２５．９（Ｃ−１６），１３．１（Ｃ−１７），８３．４（Ｃ−１８），３４．２（Ｃ−１９），３５．２（Ｃ−２０），１７９．４（Ｃ−２１），１５．０（Ｃ−２２）。

化合物ＶＩ（Ｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ Ｋ）：無色針状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，３００ＭＨｚ）δ：１．７９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１），２．２５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２α），１．１０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２β），３．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，１２．１Ｈｚ，Ｈ−３），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３，１５．１Ｈｚ，Ｈ−５α），３．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．８，９．３Ｈｚ，Ｈ−５β），１．２８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６），１．５７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−７），１．０６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８α），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８β），１．８９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），３．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，１１．２Ｈｚ，Ｈ−９ａ），１．８９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０），４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ−１１），２．１７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２），２．８８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．８，７．４Ｈｚ，Ｈ−１３），１．３２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−１５），１．２〜１．４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１６），０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｈ−１７），４．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），１．４９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，Ｈ−１９α），２．２１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１９β），２．６４（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝４．０，６．８Ｈｚ，Ｈ−２０），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：３５．６（Ｃ−１），３３．６（Ｃ−２），６５．５（Ｃ−３），５０．４（Ｃ−５），２７．６（Ｃ−６），３０．１（Ｃ−７），３３．０（Ｃ−８），４７．３（Ｃ−９），６４．１（Ｃ−９ａ），４１．０（Ｃ−１０），８１．６（Ｃ−１１），４５．１（Ｃ−１２），４１．６（Ｃ−１３），１７８．９（Ｃ−１４），１２．１（Ｃ−１５），２６．１（Ｃ−１６），１３．１（Ｃ−１７），８３．６（Ｃ−１８），３４．２（Ｃ−１９），３５．３（Ｃ−２０），１７９．５（Ｃ−２１），１５．２（Ｃ−２２）。

化合物ＶＩＩ（Ｎｅｏｔｕｂｅｒｏｓｔｅｍｏｎｉｎｅ、ネオツベロステモニン）：無色針状結晶（メタノール）、ｍｐ：１６０．５−１６２℃、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：３７６［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ）δ：１．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１），１．６５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５，１４．０Ｈｚ，Ｈ−３），３．０８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５α），２．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５β），１．９４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．８４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），３．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．５，４．０Ｈｚ，Ｈ−９ａ），１．７２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０），４．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０，３．５Ｈｚ，Ｈ−１１），２．１０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２），２．８８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．５，７．５Ｈｚ，Ｈ−１３），１．２３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−１５），１．３７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１６），１．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１７），４．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１８），２．３９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．５，１３．５，１５．５Ｈｚ，Ｈ−１９），２．６１（１Ｈ，ｄｄｑ，Ｊ＝７．０，５．５，１２．０Ｈｚ，Ｈ−２０），１．２６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ−２２）。^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，１２５ＭＨｚ）δ：３７．３（Ｃ−１），３２．６（Ｃ−２），６７．７（Ｃ−３），５１．０（Ｃ−５），２９．１（Ｃ−６），２２．８（Ｃ−７），２８．６（Ｃ−８），３５．９（Ｃ−９），６７．２（Ｃ−９ａ），３４．８（Ｃ−１０），８０．４（Ｃ−１１），４１．５（Ｃ−１２），４２．６（Ｃ−１３），１７８．８（Ｃ−１４），１０．２（Ｃ−１５），２１．１（Ｃ−１６），１１．１（Ｃ−１７），７８．４（Ｃ−１８），３４．５（Ｃ−１９），３４．９（Ｃ−２０），１７８．６（Ｃ−２１），１４．８（Ｃ−２２）。

化合物ＶＩＩＩ（Ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉｎｅ Ｂ）：無色柱状結晶（メタノール）、氷酢酸を加入したヨウ化ビスマスカリウム（ＢＩＳＭＵＴＨ ＰＯＴＡＳＳＩＵＭ ＩＯＤＩＤＥ）の反応は陽性であり、ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ：２７８［Ｍ＋Ｈ］＋）。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，５００ＭＨｚ）δ：４．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−１１），３．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），２．９４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．８６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１３），２．５１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−９ａ，Ｈ−３），２．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．３０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２），２．０２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），１．９３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），１．５８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７），１．２１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１５−ＣＨ_３），０．９９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１７−ＣＨ_３）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，７５ＭＨｚ）δ：３７．３（Ｃ−１），２９．９（Ｃ−２），５５．９（Ｃ−３），５５．８（Ｃ−５），２８．１（Ｃ−６），２１．０（Ｃ−７），２８．０（Ｃ−８），３４．０（Ｃ−９），７１．１（Ｃ−９ａ），３７．２（Ｃ−１０），７９．２（Ｃ−１１），４２．５（Ｃ−１２），４２．４（Ｃ−１３），１７９．５（Ｃ−１４），１０．１（Ｃ−１５），２１．１（Ｃ−１６），１１．４（Ｃ−１７）。

実施例２ 肺線維症動物モデルの作成
１．主な試薬及び実験動物
実験に用いたブレオマイシンは日本化薬株式会社製から購入し、ロット番号は７３０３４２であた。
実験に用いたＳＰＦ級Ｃ５７ＢＬ／６系マウス（雌、８週齢）は揚州大学比較医学センターから購入した。

２．モデルの作成
ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルは、国際的に公認された抗線維化薬剤のスクリーニングに利用する動物モデルである。ブレオマイシン投与後に急性肺傷害を引き起こし、初期に主な症状は炎症で、１０日程で線維化が生じ、大量のコラーゲンが肺部に集中して生じるが、これらの病態生理学的変化と臨床における特発性肺線維症の病態生理学的変化は極めて類似している。特発性肺線維症の発病原因及びメカニズムは明らかではないが、ブレオマイシン誘発性肺線維症及び特発性肺線維症は、どちらも肺組織が損傷を受けることで免疫及び炎症反応を引き起こして、さらに線維化の病態生理学的変化を誘発することで、ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルは特発性肺線維症及び病態生理学的変化が類似する、様々な要因により生じる一連の肺線維症を代表することができる。

肺線維症モデルの作成方法：Ｃ５７ＢＬ／６系の雌マウス（８週齢）、環境に適応させた７日後にモデル作成開始。マウスを一晩絶食させた後、抱水クロラール３％（１０ｍｌ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、マウスを固定し、マウス頚部を消毒し、頚部皮膚をなるべく傷口を小さくするように縦に切開し、ピンセットで筋膜と筋肉を上下に分けて、気管を露出させ、マイクロインジェクターを用いて気管に約３５μｌ（３．５ｍｇ／ｋｇ）のブレオマイシンを注入し、ブレオマイシンを左右の肺葉に均等に浸透するように直ちにマウスを直立にして３〜５分間回転させ、マウスの呼吸状態を観察し、アルコール７５％の消毒コットンで頚部傷口を消毒し、縫合し、縫い目にペニシリウム注射液１〜２滴を滴下し、乾燥して清潔なマウスゲージに戻して休ませ、目が覚めたら通常飼育する。手術作業は約６０℃の手術台で行う。偽手術（Ｓｈａｍ）群の気管内に等量の注射用生理食塩水を注射する。

実施例３ ８つのアルカロイドとペントキシベリンの抗マウス線維化活性の検定
本実施例は、実施例１で得られたアルカロイドを用いてマウスにおいて抗線維化活性の研究を行い、それが抗線維化作用を有するかどうかを検定することを目的としている。これらのアルカロイドは漢方薬ビャクブの止咳有効成分であり、咳止め薬が抗線維化できるかどうかを調べるために、本実施例では臨床でよく用いられる鎮咳薬、咳清浄（ｐｅｎｔｏｘｙｖｅｒｉｎｅ、ペントキシベリンクエン酸塩錠、 鎮咳薬の薬理実験でよく用いられる陽性対照薬物）を選出し、同時に抗線維化活性のスクリーニングを行う。

１．主な試薬及び実験動物
化合物Ｉ〜ＶＩＩＩのそれぞれは実施例１に従い取得され、純度が９８％以上である。ペントキシベリンは国薬集団容生製薬有限公司から購入、ロット番号１３１１０２２１。実験に用いたブレオマイシンは日本化薬株式会社から購入、ロット番号７３０３４２。ピルフェニドン（ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ、陽性薬剤）は大連美侖生物技術有限公司から購入、純度が９９％以上である。ピルフェニドンは米国のＭａｍａｃ社が開発した肺線維症の治療新薬であり、日本、台湾、韓国での開発権は日本の塩野義製薬株式会社がライセンスを取得、２００８年１０月１７日に日本で先行販売されている。

実験にはＳＰＦ級Ｃ５７ＢＬ／６系マウス（雌、８週齢）を使用、揚州大学比較医学センターから購入した。

２．実験方法
実験マウスを無作為に１２群に分け、モデル群とペントキシベリン群は各１０匹、その他の群は全て各５匹とした。第１群は偽手術群、第２群はモデル群、第３群はペントキシベリン群、第４群は陽性薬ピルフェニドン群、第５〜１２群はそれぞれ化合物Ｉ〜ＶＩＩＩ投与群とした。第２〜１２群は実施例２と同じ方法を用いて、ブレオマイシンでモデル作成した。モデル作成後１日目から、第３群に毎日３０ｍｇ／ｋｇのペントキシベリンを胃内投与し、第４群に毎日３００ｍｇ／ｋｇのピルフェニドンを胃内投与し、第５〜１２群には毎日３０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉ〜ＶＩＩＩをそれぞれに胃内投与し、偽手術群及びモデル群は等量の溶剤を投与し、２１日目に終了とした。最後の投与後にマウスを殺処分、肺組織を摘出し、右側肺小葉はヒドロキシプロリンの含量測定に用い、左側肺小葉は病理組織切片に用いた。

３．実験結果
図１−Ａから分かるように、偽手術群に比べ、モデル群の肺組織中のヒドロキシプロリン含量が有意に増加しており、モデル群マウスの肺組織中のコラーゲンが明らかに増加し、線維症が重症化したことを示している。８つのステモナアルカロイドモノマーを投与した後には、モデル作成することによって増加したマウスのヒドロキシプロリン含量を有意に減少させることができ、その効果は陽性対照であるピルフェニドンより優れていた。これに対して、ペントキシベリンを投与した後に、Ｈｙｐ含量にはモデル群との有意な差はなく、偽手術群に比べ、有意に増加していた。図１−Ｂ、１−Ｃから分かるように、モデル作成した２１日間後、偽手術群のマウスの肺小葉構造は正常であり、肺胞壁も異状なく、炎症及び線維化の病態生理学的変化は見られなかった。モデル群マウスの肺臓には炎症による損傷及び組織腫瘤が生じ、正常な肺組織が消失し、肺胞が閉塞し、コラーゲンが沈着したことが明らかに見られた。８つのステモナアルカロイドモノマーを投与した後には、ブレオマイシンが引き起こしたマウスの肺部炎症が著しく軽減され、肺損傷レベルが明らかに改善されており、化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩは基本的にモデルマウスの肺構造を正常に回復させることができた。しかし、ペントキシベリンはモデルマウスの肺組織損傷及び線維化レベルを改善できず、その組織切片はモデル群と同様、炎症による損傷が厳重で、肺胞が閉塞し、コラーゲンが沈着したことがはっきり見られた。本実験の結果は、構造式Ｉの母核を有するアルカロイドがブレオマイシンによるモデルマウスの肺線維症を著しく抑制及び改善する作用を有しており、咳止め薬ではモデルマウスの肺線維症を改善できないことを示している。

実施例４ 化合物Ｉ、化合物ＶＩＩ及び化合物ＶＩＩＩの肺線維症の予防及び治療作用
１．実験材料及び方法
（１）主な試薬及び実験動物
実施例１に従い、化合物Ｉ、化合物ＶＩＩ及び化合物ＶＩＩＩがそれぞれ取得され、純度が９８％以上である。ピルフェニドン（ｐｒｉｆｅｎｉｄｏｎｅ、陽性薬剤）は大連美侖生物技術有限公司から購入し、純度が９９％以上である。
実験動物は実施例２に従い作成したモデルマウスであり、モデル作成当日を０日とする。

（２）実験方法
モデル動物を予防群、治療群に分けて投与を行う。本モデルの国際的に汎用されている投与方法に従い、予防群は、モデルを作成してから２日目に投与を開始し、１４日目に終了させ、連続で胃内投与を行う。治療群は、モデルを作成してから８日目に投与を開始し、２１日目に終了させ、連続で胃内投与を行う。組分け及び投与状況は表１に示す通りである。

２．マウスの死亡率の測定
予防群は、モデル作成当日、即ち０日目から１４日目まで、治療群は、モデル作成後８日目から２１日目まで、毎日予防群と治療群の各群の動物死亡状況を統計し、各群の動物の生存率を計算し、、結果は表２を参照する。

表２から分かるように、偽手術群と比べ、ブレオマイシン誘発モデルマウスの１４日間の死亡率は２０％、２１日間の死亡率は３３％であった。モデル群と比べ、、３つの化合物がモデルマウスに対する保護作用を有し、そのうち予防群は、化合物Ｉ、ＶＩＩの効果が化合物ＶＩＩＩよりも良好であり、低用量群（３０ｍｇ／ｋｇ）の効果がより優れていた。治療群は、３つの化合物がマウスの死亡率を低下させる作用は基本的に同等であり、低用量群が高用量群よりわずかに良好であった。本実験の結果では、予防群であれ治療群であれ、モデルマウスへの保護作用に関して低用量群が高用量群より優れていることが示された。全体的に見て、３つの化合物がマウスの死亡率を低下させる作用は陽性対照のピルフェニドンよりも明らかに優れていると言える。

３．マウスの肺湿乾重量比の検査
最後の投与後にマウスを殺処分し、マウスの肺臓を剥離して湿重量を量り、肺重量（ｍｇ）をマウスの体重（ｇ）で割って肺湿乾重量比を得る（図２）。図１から分かるように、偽手術群と比べ、、モデル群の肺湿乾重量比は有意に増加していた。予防群であれ治療群であれ、化合物Ｉ、ＶＩＩ及び化合物ＶＩＩＩの２つの用量群（３０、６０ｍｇ／ｋｇ）はどれもモデルマウスの肺湿乾重量比を著しく低下させており、そのうち予防群中の低用量の効果がより優れていた。全体的に見て、３つの化合物がモデルマウスの肺湿乾重量比を低下させる作用は陽性対照のピルフェニドンよりわずかに優れていた。

４．ＨＥ染色の病態生理学的評価と炎症性評価
最後の投与後にマウスを殺処分し、マウスの肺組織を摘出して、左側肺小葉をホルマリン１０％に浸し、固定した後にパラフィン包埋してスライスし、ＨＥ染色してその病態生理学的変化を観察した。図３から分かるように、偽手術群のマウスの肺小葉構造は正常であり、肺胞壁に異常はなく、はっきりとした炎症及び線維化の病態生理学的変化は見られなかった。モデル群のマウスの肺臓には、炎症による損傷及び組織腫瘤が生じ、正常な肺組織が消失し、肺胞が閉塞したことがはっきりと見られた。予防群であれ治療群であれ、化合物Ｉ、ＶＩＩ及び化合物ＶＩＩＩはどれもブレオマイシンが引き起こした肺部炎症を著しく軽減させ、肺損傷を改善し、正常な肺構造に回復させることができ、３つの化合物は、すべて低用量群（３０ｍｇ／ｋｇ）の効果が高用量群より明らかに優れており、肺部炎症が基本的に消失し、肺胞構造が明確であった。

ＨＥ染色結果を炎症レベルで分け、半定量分析で統計した。レベル０：正常組織又は炎症性変化が極めて小さい；レベル１（＋）：軽度から中度の炎症性変化、肺組織に明らかな損傷はない；レベル２（＋＋）：中度から重度の炎症による損傷、肺胞隔膜の肥厚、組織腫瘤の形成、又は肺炎領域に肺組織構造の損傷を引き起こしている；レベル３（＋＋＋）：重度の炎症による損傷、局所領域の肺組織構造が重度の損傷を受けて管腔閉塞を引き起こしているなど。予防群及び治療群の各群の炎症性評価結果は図４を参照されたい。偽手術群と比べ、ブレオマイシンモデルマウスの肺部に著しい炎症が見られる。化合物Ｉ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩの２つの用量群（３０、６０ｍｇ／ｋｇ）はどれもブレオマイシンが引き起こした肺部炎症を著しく軽減させており、低用量群の効果は高用量群より優れていた。全体的に見て、３つの化合物が肺部炎症を改善させる効果は陽性対照のピルフェニドンより優れていると言える。

５．Ｍａｓｓｏｎ染色の病態生理学的評価と画像診断解析
Ｍａｓｓｏｎ染色は、線維性コラーゲンに対して特異的染色を行う方法である。最後の投与後、麻酔でマウスを殺処分し、マウスの肺組織を摘出して、左側肺小葉をホルマリン１０％に浸し、固定後にパラフィン包埋してスライスし、Ｍａｓｓｏｎ染色してそのコラーゲン線維の沈着状況を観察した。予防的投与及び治療的投与の各群それぞれのＭａｓｓｏｎ染色結果は図５を参照されたい。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ６．０を用いて半定量分析を行い、各視野のＭａｓｓｏｎ染色後のコラーゲンの集積光密度（ＩＯＤ）を測定し、各群で５つの標本を解析し、それぞれの標本から無作為５つの視野を選び、平均値を各群のコラーゲンの相対含量として統計解析を行った。予防的投与及び治療的投与の各群の解析結果は図６を参照されたい。

図５及び図６から分かるように、偽手術群のマウスの肺部にはっきりとしたＭａｓｓｏｎコラーゲン沈着は見られなかった。ブレオマイシンを投与してから１４日後及び２１日後のマウスの肺臓にははっきりとコラーゲンの堆積が生じ、大量の線維化組織が形成されており、２１日間のほうが１４日間より重度であった。化合物Ｉ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩの２つの用量群（３０、６０ｍｇ／ｋｇ）はどれも、ブレオマイシンが引き起こしたコラーゲン沈着を著しく減少させることができており、肺線維症の改善効果が非常にはっきりと見られた。その中で、３種の化合物の予防的投与では低用量群の効果が高用量群よりも優れており、治療的投与では、高用量群の効果が低用量群よりもわずかに優れていた。全体的に見て、モデルマウスのコラーゲン沈着を改善する効果は、化合物Ｉ、ＶＩＩが化合物ＶＩＩＩよりもわずかに優れており、３種の化合物はどれも陽性対照であるピルフェニドンより明らかに優れていると言える。

６．ヒドロキシプロリン含有量測定
ヒドロキシプロリンは主にコラーゲン中に存在し、エラスチン中の含有量は極めて少なく、他のタンパク質中には存在しないため、ヒドロキシプロリン含有量を測定することでコラーゲン含有量の多寡を表し、そして肺線維症レベルを評価することができる。ヒドロキシプロリンの測定は試薬キット（南京建成生物技術公司）を用い、試薬キットの説明書に従って測定したが、結果は図７を参照されたい。

図７から分かるように、偽手術群と比べ、、モデル群はマウスの肺組織中のヒドロキシプロリン含有量が有意に増加しており、モデルマウス肺線維症の病変が重度であることを示している。予防群であれ治療群であれ、化合物Ｉ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩの高・低用量群（３０、６０ｍｇ／ｋｇ）はどれもモデルマウスのヒドロキシプロリン含有量を効果的に低下させることができ、低用量群の効果が高用量群よりわずかに優れており、３つの化合物がブレオマイシンによる誘発したモデルマウスの肺線維症を著しく改善し、コラーゲン沈着を減少させられることが示された。

７．ＥｌｉｓａによるＴＧＦ−β１含有量測定
ＴＧＦ−β１は強力な線維化を促進する増殖因子として認知されており、細胞を刺激して、細胞外マトリックス成分を合成と分泌させ、マトリックス分解酵素成分の活性を変化させて，ＥＣＭの沈着を悪化させてしまう。肺組織中のＴＧＦ−β１含有量を減少させれば肺線維症の進行を遅らせることができる。Ｅｌｉｓａ試薬キット（上海依科賽生物製品有限公司）を用い、試薬キットの説明書に従ってマウスの肺組織中のＴＧＦ−β１含有量を測定したが、結果は図８を参照されたい。

図８から分かるように、偽手術群と比べ、ブレオマイシン投与されたマウスの肺組織中のＴＧＦ−β１含有量は有意に増加していた。モデル群と比べ、予防群であれ治療群であれ、化合物Ｉ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩの高・低用量群（３０、６０ｍｇ／ｋｇ）はどれもモデルマウス中のＴＧＦ−β１レベルを有意に低下させ、肺線維症レベルを著しく改善させることができており、その中で、低用量群の効果が高用量群よりも優れ、化合物Ｉ、ＶＩＩＩの効果が化合物ＶＩＩよりもわずかに優れていた。

結論
本発明の結果は、構造式Ｉに示される母核を有する化合物、例えば化合物Ｉ〜ＶＩＩＩなどの８つの化合物が肺線維症に対する著しい予防及び／又は治療作用を有することを示している（実施例３）。化合物Ｉ及びＶＩＩ（Ｒ１側鎖を有する））、ＶＩＩＩ（Ｒ１側鎖なし）など３つの化合物の活性研究では、構造式Ｉに示される構造が肺線維化を抑制する効果を有することが一層明らかになった。多重指標による動物実験結果では、該類化合物の肺線維症改善効果が近頃日本で発売された陽性対照のピルフェニドンより優れており、ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスの死亡を著しく減少させ、モデルマウスの肺湿乾重量比をも著しい減少させることが見られ、モデルマウスの肺線維症レベルを改善し、肺組織中のＨｙｐ及び線維化を促進する増殖因子ＴＧＦ−β１の含有量を著しく減少させており、構造式Ｉに示される構造を有する化合物がブレオマイシンによって誘発されたマウスの肺炎症を緩和し、肺のコラーゲン沈着を減少させることができることが示された。

本発明の結果は、肺線維症の予防及び／又は治療用医薬組成物における構造式Ｉに示される構造を有する化合物の応用についての科学的根拠を提供している。

Claims (6)

1. 肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用であって、該化合物
   は下記の構造式Ｉを有する：
   
   式中：Ｒ_１は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基、α又はβのメチル基−γ−ブチロラクトン基から選択される；
   Ｒ_２は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基から選択される；
   Ｒ_３は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基から選択される；
   或いはＲ_２、Ｒ_３は、下記の式のような環状のα又はβ構造である：
   
   式中：Ｒ_８は、α又はβアルキル基から選択される；
   Ｒ_４は、α又はβアルキル基から選択される；
   Ｒ_５は、α又はβ水素から選択される；
   Ｒ_６は、α又はβ水素、α又はβ−ヒドロキシ基から選択される；
   Ｒ_７は、α又はβ水素から選択される、
   肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用。
2. 前記肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用では、該化合物は下記の構造式Ｉａを有する：
   
   式中：Ｒ_１は、水素、α又はβヒドロキシ基、α又はβカルボキシル基、α又はβハロゲノ基、α又はβ−アルコキシ基、α又はβアルキル基、α又はβのメチル基−γ−ブチロラクトン基から選択される；
   Ｒ_２は、α又はβ水素から選択される；
   Ｒ_３は、α又はβ水素から選択される；
   Ｒ_４は、α又はβアルキル基から選択される；
   Ｒ_５は、α又はβ水素から選択される；
   Ｒ_６は、α又はβ水素、α又はβヒドロキシ基から選択される；
   Ｒ_７は、α又はβ水素から選択される；
   Ｒ_８は、α又はβアルキル基から選択されることを特徴とする、請求項１の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用。
3. 前記の応用では、前記化合物は構造式Ｉに示されるアルカロイド又はその医薬用誘導体であることを特徴とする、請求項１の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用。
4. 前記の応用では、前記化合物の医薬用誘導体は、構造式Ｉに示されるアルカロイドの塩又はエステルであることを特徴とする、請求項３の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用。
5. 前記の応用では、前記医薬組成物は、構造式Ｉに示されるアルカロイドの一種の活性成分及び一種の薬用担体が少なくとも含まれることを特徴とする、請求項１の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用。
6. 前記の応用では、前記医薬組成物は、質量パーセントが０．０１％〜９９％の構造式Ｉに示されるアルカロイド及び質量パーセントが０．０１％〜９９％の薬用担体が含まれることを特徴とする、請求項５の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の調製における化合物の応用。