CN104138381A - 一种螺环生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有如结构式I所示的生物碱在制备用于预防和\或治疗肺纤维化药物中的用途。具有如结构式I所示的生物碱，能够显著减轻病变肺组织炎症程度，降低病变肺组织中促纤维化因子TGF-β1的含量，减少病变肺组织中胶原的过度沉积，对肺纤维化具有显著的预防和治疗作用。

Description

一种螺环生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及具有抗肺纤维化活性的一类生物碱，特别涉及如结构式I所示的生物碱在制备预防或治疗肺纤维化药物组合物中的应用。

背景技术

肺纤维化尤其是特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种原因不明的弥漫性肺疾病。主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化，最终导致肺脏结构和功能的严重破坏，其病理主要表现为早期弥漫性肺泡炎及后期大量间质细胞增生、基质胶原进行性聚集以致取代正常的肺组织结构，严重影响肺的通气和换气功能，最终导致呼吸功能衰竭而死亡。其发病机理尚未完全阐明，目前临床上缺乏有效的治疗手段，死亡率很高。

肺脏间质组织由胶原蛋白、弹性素及蛋白聚糖类构成，胶原蛋白是肺组织的主要细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白，肺脏中的胶原蛋白与其他类型ECM成分构成三维网状结构，成为肺组织结构的主要骨架，这些蛋白成分保持肺组织结构的完整性，并对维持肺上皮及内皮细胞分化起着十分重要的作用。当肺纤维母细胞受到化学性(如博来霉素、变态源)或物理性(如粉尘、放射线)伤害时，会分泌胶原蛋白进行肺间质组织的修补，进而造成肺脏纤维化。IPF的基本过程是：肺脏早期损伤之后有肺泡炎，肺泡内有浆液和细胞成分，肺间质内有大量单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、肺泡巨噬细胞等炎症免疫细胞浸润，多种细胞因子分泌，此时肺泡结构尚完整；随着炎症免疫反应的进展，促纤维化因子生成增多或抗纤维化因子产生相对不足，炎症和异常修复导致肺间质细胞增殖，导致肺纤维化过程的ECM代谢异常，产生大量的ECM蛋白；进入晚期，肺泡结构为坚实的胶原代替，肺泡壁、气道和血管最终纤维化，成纤维细胞、胶原等ECM分布在肺间质中，肺泡上皮化生为鳞状上皮，纤维化肺最终形成，临床表现为患者呼吸困难，呼吸衰竭而死亡。肺间质纤维化的形成中有炎症免疫反应参与，因此糖皮质激素(如泼尼松)和免疫抑制剂(如环磷酰胺)是传统治疗肺纤维化的药物，可以抑制炎症反应和免疫过程，减轻肺泡炎症，从而延缓肺纤维化的进程，但是由于其不良反应，不能长期使用。

咳嗽是呼吸系统疾病的常见症状，如同很多呼吸系统疾病一样，肺纤维化早期也会出现咳嗽症状。咳嗽和肺纤维化虽然有一定的联系，但它们完全不同。严格来说，咳嗽是诸多呼吸系统疾病的表现形式，但不是一种真正的疾病。尽管在肺纤维化的早期和发展过程中也会有咳嗽现象出现，通过止咳药可以缓解肺纤维化早期引起的咳嗽、气喘等症状，但病情发展严重时止咳药无效，则只能使用激素、抗生素来缓解症状。以上这些都是治标不治本，不能从根本上治疗或阻止肺纤维化，激素、抗生素的长期使用甚至还会加重、加速肺纤维化进程。

综上所述，肺纤维化目前尚缺乏有效的治疗手段，急需开发新的、疗效好的药物，用于减轻或治疗肺纤维化症状。

中药百部为百部科(Stemonaceae)百部属(Stemona)植物的干燥根，具有润肺下气止咳、杀虫等功效，用于新久咳嗽、肺痨咳嗽、百日咳。药理活性研究表明，百部生物碱是百部的主要活性成分，具有非常好的杀虫活性和祛痰止咳的功效。关于百部的研究主要集中于化学成分的分离和杀虫、止咳活性，其他活性研究很少。尽管肺纤维化的症状之一是咳嗽，但目前为止，没有任何关于止咳药可以改善或治疗肺纤维化的研究报道。

如结构式I所示的螺环生物碱，如stemospironine、croomine等，在百部属植物中分布较普遍，但迄今为止，除了croomine的止咳活性外，尚未有其他活性的研究报道，也尚未有文献报道该类化合物具有预防或治疗肺纤维化疾病的功效或其在治疗肺纤维化疾病药物中的应用。

发明内容

针对缺乏有效的预防或治疗肺纤维化药物的不足，本发明公开了如结构式I所示生物碱的新用途，该生物碱可以有效地预防或治疗肺纤维化疾病。

本发明的技术方案是：一种化合物在制备预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用，所述的化合物具有结构式I。

其中：

R₁选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

R₂选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

或R₁、R₂如下式：

其中：Y选自氧，硫；

R₃选自氢，α或β羟基，α或β烷基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₄选自氢，α或β烷基，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₅选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基；

R₆选自α或β氢，α或β羟基；

X选自α或β氧，α或β硫，α或βNH。

一种化合物在制备预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用，其特征在于所述的化合物具有结构式Ia。

其中：

R₁选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

R₂选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

或R₁、R₂如下式：

其中：Y选自氧，硫；

R₃选自氢，α或β羟基，α或β烷基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₄选自氢，α或β烷基，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₅选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基；

X选自α或β氧，α或β硫，α或βNH。

所述的应用，其特征在于，所述的化合物是结构式I所示的生物碱或其药用衍生物。

所述的应用，其特征在于，所述的化合物药用衍生物是结构式I所示生物碱的盐或酯。

所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物至少包括一种活性成分如结构式I所示的生物碱和一种药用载体。

所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括质量百分比为0.01％～99％的如结构式I所示的生物碱和质量百分比为0.01％～99％的药用载体。

本发明中所述的“肺纤维化”是指以特发性肺纤维化病理改变为特征的、由各种原因导致的人或动物的肺纤维化。

所述的“预防”是指在可能的导致肺纤维化的因素存在的情况下，使用后防止或降低肺纤维化的发生；所述的“治疗”是指减轻肺纤维化的程度，或者治愈肺纤维化使之正常，或者减缓肺纤维化的进程。

生物碱的盐或酯指的是药物学可接受的盐、酯等形式。

所述的药物组合物至少包括一种如结构式I所示生物碱的活性成分和一种药用载体。所谓“活性成分”是指具有预防或治疗肺纤维化的功能。在该组合物中，该生物碱可以单独或与其他化合物一起作为活性成分。所述的药用载体包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等。在该药物组合物中，结构如式1所示的生物碱的含量是0.01％～99％，药用载体的含量是0.01％～99％，百分比是质量百分比。

所述药物组合的剂型没有特别限制，可以是固体、半固体或液体形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，可以经口服给药、经静脉、肌肉、皮内或皮下给药，或经舌下、直肠、透皮吸收以及呼吸道雾化给药。该药物组合物的每日剂量约为0.01～1000mg，优选1～500mg。

在预防或治疗肺纤维化时，所述的如结构式I的生物碱的药物组合物可以单独使用或与其他药物联合使用。

本发明中所述的如结构式I的生物碱是从百部科植物中制备分得(纯度大于98％)，其余原料或试剂均市售可得。

有益效果

1.本发明提供了一种新的预防或治疗肺纤维化的化合物如结构式I所示的螺环生物碱，通过体外实验证明该类生物碱对于博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化具有显著的预防和治疗作用，明显减轻实验动物的肺纤维化程度，可用于制备治疗肺纤维疾病的药物。同时也说明普通止咳药物对肺纤维化没有作用。本发明第一次发现如结构式I所示的多种生物碱(I-IV)具有抗肺纤维化作用，之前并没有文献报道。

具体来说：

本发明结果表明，具有如结构式I所示的化合物，如化合物I～IV等4个生物碱，具有显著的预防和/或治疗肺纤维化的作用(实施例3)。化合物I的活性研究进一步说明了如结构式I所示的结构具有明显的抗肺纤维化作用。多指标的动物实验结果表明，该类化合物改善肺纤维化的效果优于或相当于新近在日本上市的阳性对照药吡菲尼酮，能显著地降低博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠死亡，显著降低模型小鼠的肺系数，改善模型小鼠的肺纤维化程度，明显降低肺组织中Hyp和促纤维化因子TGF-β1的含量，说明具有结构式I所示结构的生物碱能够减轻博莱霉素造模引起的小鼠肺部炎症，减少肺部胶原沉积。本发明结果为具有如结构式I所示结构的螺环生物碱在预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用提供了科学依据。

2.本发明涉及的实验材料来自多种百部药材，主要为对叶百部、直立百部和蔓生百部，价格低廉，材料易得。

附图说明

图1四个生物碱与咳必清对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠的影响。A：羟脯氨酸含量；B：HE染色病理切片；C：Masson染色病理切片。其中，1-假手术组，2-模型组，3-咳必清，4-吡菲尼酮，5-化合物I，6-化合物II，7-化合物III，8-化合物IV。与假手术组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图2化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺系数的影响。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图3化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织病理学改变的影响(HE染色)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。

图4化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织炎性评分的影响(HE染色)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图5化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织病理学改变的影响(Masson染色)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。

图6化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织胶原含量的影响(平均光密度值统计)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图7化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量的影响。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图8化合物I对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织TGFβ1含量的影响(ELISA)。其中，A：预防组，B：治疗组；1-假手术组，2-模型组，3-化合物I低剂量(30mg/kg)组，4-化合物I高剂量(60mg/kg)组，5-吡非尼酮(300mg/kg)组。与假手术组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

具体实施方式

实施例1 生物碱的制备和结构鉴定

1.药材与试剂

药材为对叶百部(Stemona tuberosa Lour.)的干燥根，购于安徽毫州药材市场。乙醇、二氯甲烷、甲醇等试剂均为分析纯。

2.提取分离

对叶百部药材95％乙醇回流提取3次，减压浓缩至无醇味，加5％稀盐酸酸化至pH 1-2，过滤，滤液用浓氨水碱化至pH 10，氯仿萃取，回收氯仿得总生物碱部位。总生物碱经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇梯度(100∶0～100∶10)洗脱，根据TLC结果合并相同流分，再经过反复硅胶柱层析，Sephadex LH-20柱色谱分离，从二氯甲烷-甲醇(100∶1)洗脱部分分离得到化合物I(Stemospironine，百部高碱)和化合物II(Croomine，金刚大碱)；从二氯甲烷-甲醇(100∶3)洗脱部分分离得到化合物III(10-Hydroxycroomine)；从二氯甲烷-甲醇(100∶6)洗脱部分分离得到化合物IV(Tuberostemospironine)；以上化合物经HPLC分析，纯度98％以上。

3.结构鉴定

化合物I(Stemospironine，百部高碱)：白色晶体(氯仿)，碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：352[M+H]⁺)。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：1.95(2H，m，H-1)，1.83(2H，m，H-2)，3.30(1H，m，H-3)，3.11(2H，m，H-5)，1.62(4H，m，H-6，H-7)，3.22(1H，d，J＝5.6Hz，H-8)，3.78(1H，m，H-9a)，2.47，1.62(2H，m，H-10)，2.70(1H，m，H-11)，1.26(3H，d，J＝7.1Hz，H-13)，4.36(1H，m，H-14)，2.38，1.62(2H，m，H-15)，2.61(1H，m，H-16)，1.31(3H，d，J＝7.3Hz，H-18)，3.40(3H，s，H-19)。¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)δ：27.0(C-1)，26.4(C-2)，67.7(C-3)，48.8(C-5)，25.7(C-6)，22.2(C-7)，85.2(C-8)，90.3(C-9)，63.0(C-9a)，34.6(C-10)，35.6(C-11)，179.2(C-12)，14.8(C-13)，79.9(C-14)，35.0(C-15)，34.9(C-16)，179.5(C-17)，17.5(C-18)，58.0(C-19)。

化合物II(Croomine，金刚大碱)：无色针晶(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：322[M+H]⁺)。¹H NMR(CDCl₃，500MHz)δ：1.42，1.60(2H，m，H-1)，1.39，1.60(2H，m，H-2)，3.25(1H，dd，J＝6.6，7.0Hz，H-3)，3.09(2H，m，H-5)，1.68(2H，m，H-6)，1.76，1.80(2H，m，H-7)，1.84，1.76(2H，m，H-8)，3.39(1H，t，J＝7.2Hz，H-9a)，2.33，1.50(2H，dd，J＝10.8，13.6Hz；dd，J＝13.8，7.8Hz，H-10)，2.77(1H，m，H-11)，1.24(3H，d，J＝7.5Hz，H-13)，4.22(1H，ddd，J＝5.0，6.6.10.0Hz，H-14)，1.33，2.14(2H，m，H-15)，2.62(1H，dq，J＝7.212.3Hz，H-16)，1.18(3H，d，J＝6.9Hz，H-18)。¹³C NMR(CDCl₃，125MHz)δ：27.8(C-1)，26.8(C-2)，69.5(C-3)，50.0(C-5)，22.5(C-6)，28.2(C-7)，41.4(C-8)，89.5(C-9)，67.3(C-9a)，37.8(C-10)，36.4(C-11)，179.6(C-12)，18.0(C-13)，81.2(C-14)，35.2(C-15)，35.5(C-16)，179.8(C-17)，15.3(C-18)。

化合物III(10-Hydroxycroomine)：黄色无定形粉末(甲醇)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：338[M+H]⁺)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：1.84，1.50(2H，m，H-1)，1.98，1.74(2H，m，H-2)，3.46(1H，dd，J＝7.5Hz，H-3)，3.30，3.11(2H，m，H-5)，1.78，1.64(2H，m，H-6)，1.80，1.56(2H，m，H-7)，2.02，1.74(2H，m，H-8)，3.60(1H，t，J＝7.8Hz，H-9a)，4.32(1H，d，J＝7.8Hz，H-10)，2.80(1H，m，H-11)，1.27(3H，d，J＝2.8Hz，H-13)，4.38(1H，m，H-14)，2.39，1.51(2H，m，H-15)，2.63(1H，m，H-16)，1.25(3H，d，J＝5.9Hz，H-18)。¹³C NMR(CDCL₃，100MHz)δ：26.8(C-1)，26.5(C-2)，68.0(C-3)，48.2(C-5)，22.1(C-6)，29.7(C-7)，27.9(C-8)，89.5(C-9)，68.7(C-9a)，72.4(C-10)，40.1(C-11)，171.7(C-12)，10.0(C-13)，79.9(C-14)，34.7(C-15)，34.9(C-16)，179.3(C-17)，14.8(C-18)。

化合物IV(Tuberostemospironine)：无色方晶(丙酮)，改良碘化铋钾反应呈阳性，ESI-MS(m/z：254[M+H]⁺)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：1.90，2.01(2H，m，H-1)，2.24，2.25(2H，m，H-2)，2.80(1H，ddd，J＝1.0，12.7，13.2Hz，H-5α)，3.83(1H，ddd，J＝2.9，3.6，13.2Hz，H-5β)，1.65，1.29(2H，m，H-6)，1.51，1.90(2H，m，H-7)，1.57(2H，m，H-8)，3.70(1H，dd，J＝6.4，9.8Hz，H-9a)，3.77(1H，d，J＝10.2Hz，H-10)，2.49(1H，dq，J＝7.0，10.2Hz，H-11)，1.15(3H，d，J＝7.0Hz，H-13)。¹³C NMR(CDClL₃，100MHz)δ：28.7(C-1)，29.9(C-2)，175.1(C-3)，41.2(C-5)，20.6(C-6)，21.5(C-7)，25.8(C-8)，87.5(C-9)，67.6(C-9a)，78.3(C-10)，40.4(C-11)，175.4(C-12)，11.9(C-13)。

实施例2 肺纤维化动物模型的制备

1.主要试剂及实验动物

实验所用博莱霉素购自日本化药株式会社，批号730342。

实验所用的SPF级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)，购自扬州大学比较医学中心。

2.模型制备

博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化是国际公认的筛选抗肺纤维化药物的动物模型。博莱霉素造模后造成急性肺损伤，初期主要表现为炎症，10天左右开始出现纤维化，大量胶原集中出现在肺部，这些病理改变与临床中特发性肺纤维化的病理改变极为相似。虽然特发性肺纤维化的发病原因和机制并不清楚，但博来霉素诱导的肺纤维化和特发性肺纤维化均为肺组织受损伤导致免疫和炎症反应，继而引发纤维化病理改变，因此博来霉素诱导的肺纤维化模型可代表特发性肺纤维化和一系列由不同致病因素造成的病理改变类似的肺纤维化疾病。

肺纤维化模型制备方法：雌性C57BL/6小鼠(8周龄)，适应环境7天后开始造模。小鼠隔夜禁食，3％水合氯醛(10ml/kg，i.p.)麻醉，固定小鼠，消毒小鼠颈部，以尽量小的创伤纵向切开颈部皮肤，用镊子纵向分开筋膜与肌肉，暴露气管，用微量注射器刺入气管注入约35μl(3.5mg/kg)博莱霉素，然后迅速直立并旋转小鼠3～5分钟，以便使博来霉素均匀地进入左右肺叶，观察小鼠呼吸情况，用75％酒精棉消毒颈部伤口，缝合，在缝合处滴1-2滴青霉素注射液，放回干燥洁净的鼠笼休息，待苏醒后正常饲养。手术操作在约60℃左右的手术台进行。假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水。

实施例3 四个生物碱与咳必清抗小鼠肺纤维化活性的鉴定

本实施例旨在对实施例1中分得的生物碱进行抗小鼠肺纤维化活性的研究，以鉴定其是否具有抗肺纤维化的作用。由于这些生物碱都是中药百部的止咳有效成分，为了了解止咳药是否可以抗肺纤维化，本实施例选择临床常用的止咳药——咳必清(pentoxyverine，枸橼酸喷托维林片，止咳药理实验中常用的阳性对照药)同步进行抗肺纤维化活性筛选。

1.主要试剂及实验动物

化合物I～IV按照实施例1分得，纯度＞98％。咳必清购自国药集团容生制药有限公司，批号13110221。实验所用博莱霉素购自日本化药株式会社，批号730342。吡菲尼酮(prifenidone，阳性药)购于大连美仑生物，纯度＞99％。吡菲尼酮是美国Marnac公司开发的治疗肺纤维化新药，并将日本、台湾、韩国的开发权授权给了日本盐野义公司，2008年10月17日该公司率先在日本上市。

实验用SPF级C57BL/6小鼠(雌性，8周龄)，购自扬州大学比较医学中心。

2.实验方法

实验小鼠随机分为8组，模型组与咳必清组各10只，其余各组均5只。第1组为假手术组，第2组为模型组，第3组为咳必清组，第4组为阳性药吡菲尼酮组，第5～8组分别为化合物I～IV给药组。第2～8组以博莱霉素造模，方法同实施例2。在造模后第1天开始，第3组每天灌胃给予30mg/kg的咳必清，第4组每天灌胃给予300mg/kg的吡菲尼酮，第5～8组每天分别灌胃给予30mg/kg的化合物I～IV，假手术组和模型组给予相同剂量溶剂，至第21天结束。末次给药后处死小鼠，取出肺组织，右小叶用于测定羟脯氨酸的含量，左小叶用于制作病理切片。

3.实验结果

由图1-A可见，与假手术组比，模型组小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量显著性增高，说明模型组小鼠肺组织中胶原蛋白明显增多，纤维化病变严重；4个螺环生物碱单体给药后均可显著降低小鼠造模引起的羟脯氨酸含量增高，其中化合物I、II的效果优于阳性对照吡菲尼酮，化合物III的效果与吡菲尼酮相当；但咳必清给药后Hyp含量与模型组无显著差异，与假手术组相比却显著升高。由图1-B、1-C可见，造模21天后，假手术组小鼠肺小叶结构止常，肺泡壁完整，未见炎症和纤维化病理改变；模型组小鼠肺脏出现明显的炎症损伤和组织团块，止常肺组织消失，肺泡闭塞，有明显的胶原沉积；4个螺环生物碱给药后均可显著减轻博来霉素引起的小鼠肺部炎症，明显改善肺损伤程度，化合物I、II可基本恢复模型小鼠肺部正常结构；而咳必清并不能改善模型小鼠的肺组织损伤和纤维化程度，其组织切片与模型组相似，炎症损伤严重，肺泡闭塞，胶原沉积明显。本实验结果说明了具有结构式I母核的生物碱具有显著抑制和改善博来霉素模型小鼠肺纤维化的作用，而止咳药并不能改善模型小鼠的肺纤维化。

实施例4 化合物I预防和治疗肺纤维化的作用

1.实验材料及方法

(1)主要试剂及实验动物

化合物I按照实施例1分得，纯度＞98％。吡菲尼酮(prifenidone，阳性药)购于购于大连美仑生物，纯度＞99％。吡菲尼酮是美国Marnac公司开发的治疗肺纤维化新药，并将日本、台湾、韩国的开发权授权给了日本盐野义公司，2008年10月17日该公司率先在日本上市。

实验动物为按实施例2制备的模型小鼠，造模当天为0天。

(2)实验方法

将模型动物按照预防、治疗分别分组给药。按照本模型国际通用给药方法，预防给药从造模第2天开始，到第14天结束，连续灌胃给药；治疗给药从造模后第8天开始，到第21天结束，连续灌胃给药。分组和给药情况如表1所示。

表1.肺纤维化小鼠造模后分组及给药方案

2.小鼠死亡率的测定

预防给药从造模当天即第0天开始到第14天，治疗给药从造模第8天开始到第21天，每天统计预防给药各组动物死亡情况，并计算各组动物的存活率，结果见表2。

由表2可见，与假手术组相比，博莱霉素造模小鼠14天的死亡率为20％，21天的死亡率为33％。与模型组相比，化合物I对模型小鼠具有明显的保护作用，低剂量组(30mg/kg)预防和治疗给药小鼠死亡率分别为10％和11％，高剂量组(60mg/kg)预防和治疗给药小鼠死亡率分别为20％和17％。本实验结果也显示，无论预防给药还是治疗给药，低剂量组对模型小鼠的保护作用均略优于高剂量组。总体而言，化合物I降低小鼠死亡率的作用明显强于阳性对照吡菲尼酮。

表2.预防和治疗给药各组小鼠死亡情况

3.小鼠肺系数的检测

末次给药后处死小鼠，剥离小鼠肺脏并称取湿重，将肺重(mg)除以小鼠体重(g)得到肺系数(图2)。

由图1可见，与假手术组相比，模型组的肺系数均显著升高。无论预防给药还是治疗给药，化合物I的2个剂量组(30、60mg/kg)均可显著降低模型小鼠的肺系数。总体来看，化合物I降低模型小鼠肺系数的作用略优于阳性对照吡菲尼酮。

4.HE染色病理评价与炎性评分

末次给药后麻醉处死小鼠，取出小鼠肺组织，左小叶肺浸入10％福尔马林固定后石蜡包埋，切片，HE染色观察其病理改变。由图3可见，假手术组小鼠肺小叶结构正常，肺泡壁完整，未见明显炎症和纤维化病理改变。模型组小鼠肺脏出现明显的炎症损伤和组织团块，正常肺组织消失，肺泡闭塞。无论是预防给药还是治疗给药，化合物I均可显著减轻博来霉素引起的肺部炎症，改善肺损伤，恢复肺部正常结构，低剂量组(30mg/kg)的效果尤其显著，肺部炎症基本消失，肺泡结构清晰。

对HE染色结果炎性分级，进行半定量统计分析。0级：正常组织或极小的炎症改变；1级(+)：轻微到中等的炎症改变，没有明显的肺组织破坏；2级(++)：中等到重度的炎症损伤，肺泡隔膜增厚，形成组织团块，或局限性肺炎区导致肺组织结构破坏；3级(+++)：严重的炎症损伤，局部区域肺组织结构严重破坏引起管腔闭合等。预防给药和治疗给药各组的炎性评分结果见图4。与假手术组相比，博来霉素造模小鼠肺部出现显著炎症；化合物I的2个剂量组(30、60mg/kg)均可显著地降低博来霉素引起的肺部炎症，低剂量的效果优于高剂量；总体来讲，略优于阳性对照吡菲尼酮。

5.Masson染色病理评价与影像学分析

Masson染色是针对纤维性胶原进行特异性染色的方法。末次给药后麻醉处死小鼠，取出小鼠肺组织，左小叶肺浸入10％福尔马林固定后石蜡包埋，切片，Masson染色观察胶原纤维沉积情况，预防给药和治疗给药各组的Masson染色结果分别见图5。使用Image-Pro Plus6.0进行半定量分析，测量每个视野Masson染色后胶原的积分光密度值(IOD)，每组分析5个标本，每个标本随机取5个视野，取均值作为每组胶原的相对含量进行统计学分析。预防和治疗给药各组的分析结果分别见图6。

由图5和图6可见，假手术组小鼠肺部未见明显Masson胶原沉积；给予博来霉素14天和21天后小鼠肺脏出现明显胶原堆积，大量纤维化组织形成，21天的较14天的更为严重。化合物I的2个剂量组(30、60mg/kg)均可显著减轻博来霉素引起的胶原沉积，肺纤维化改善效果极其明显。其中，预防给药低剂量组效果优于高剂量组，治疗给药高剂量组效果略优于低剂量组。总体而言，化合物I改善模型小鼠胶原沉积的效果均优于阳性对照吡菲尼酮。

6.羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中，弹性蛋白中含量极少，其他蛋白中不存在，因此通过测定羟脯氨酸的含量可以表明胶原蛋白含量的高低，从而评价肺纤维化的程度。羟脯氨酸的测定采用试剂盒(南京建成生物技术公司)方法，按照试剂盒说明书进行，结果见图7。

由图7可见，与假手术组相比，模型组小鼠肺组织中的羟脯氨酸含量显著性增高，说明模型组小鼠肺组织纤维化病变严重。无论是预防给药还是治疗给药，化合物I的高、低剂量组(30、60mg/kg)均可有效地降低模型小鼠羟脯氨酸的含量，其中低剂量组的效果优于高剂量组，说明化合物I能显著改善博莱霉素造模诱导的小鼠肺纤维化。

7.TGF-β1的Elisa含量测定

TGF-β1是公认的强力致纤维化因子，可以刺激细胞合成并分泌细胞外基质组分，还可改变基质降解酶成分的活性，直接加剧ECM的沉积。降低肺组织中TGF-β1含量可减缓肺纤维化进程。采用Elisa试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司)测定小鼠肺组织中TGF-β1的含量，按照试剂盒说明书进行，结果见图8。

由图8可见，与假手术组比，博来霉素给药小鼠肺组织的TGF-β1含量显著增高。与模型组相比，无论是预防给药还是治疗给药，化合物I的高、低剂量(30、60mg/kg)均可明显降低TGF-β1的水平，显著改善肺纤维化程度，其中低剂量(30mg/kg)的效果更为显著。

讨论

本发明结果表明，具有如结构式I所示母核的化合物，如化合物I～IV等4个螺环生物碱，具有显著的预防和/或治疗肺纤维化的作用(实施例3)。化合物I的活性研究进一步说明了如结构式I所示的结构具有明显的抗肺纤维化作用。多指标的动物实验结果表明，该类螺环生物碱改善肺纤维化的效果优于或相当于新近在日本上市的阳性对照药吡菲尼酮，能显著地降低博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠死亡，显著降低模型小鼠的肺系数，改善模型小鼠的肺纤维化程度，明显降低肺组织中Hyp和促纤维化因子TGF-β1的含量，说明具有结构式I所示结构的化合物能够减轻博莱霉素造模引起的小鼠肺部炎症，减少肺部胶原沉积。

本发明结果为具有如结构式I所示结构的螺环生物碱在预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用提供了科学依据。

Claims (6)

1.一种化合物在制备预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用，所述的化合物具有结构

其中：

R₁选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

R₂选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

或R₁、R₂如下式：

其中：Y选自氧，硫；

R₃选自氢，α或β羟基，α或β烷基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₄选自氢，α或β烷基，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₅选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基；

R₆选自α或β氢，α或β羟基；

X选自α或β氧，α或β硫，α或βNH。

2.如权利要求1中一种化合物在制备预防和/或治疗肺纤维化药物组合物中的应用，其特征在于所述的化合物具有结构式Ia

其中：

R₁选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

R₂选自α或β氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基，α或β的α-甲基-γ-丁内酯基；

或R₁、R₂如下式：

其中：Y选自氧，硫；

R₃选自氢，α或β羟基，α或β烷基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₄选自氢，α或β烷基，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基；

R₅选自氢，α或β羟基，α或β羧基，α或β卤代基，α或β烷氧基，α或β烷基；

X选自α或β氧，α或β硫，α或βNH。

3.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述的化合物是结构式I所示的生物碱或其药用衍生物。

4.如权利要求3中所述的应用，其特征在于，所述的化合物药用衍生物是结构式I所示生物碱的盐或酯。

5.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物至少包括一种活性成分如结构式I所示的生物碱和一种药用载体。

6.如权利要求5中所述的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括质量百分比为0.01％～99％的如结构式I所示的生物碱和质量百分比为0.01％～99％的药用载体。