CN103371102A - 一种碎米花组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种碎米花组织培养快速繁殖方法，该方法包括以下的步骤：1）外植体的选择；2）外植体灭菌；3）腋芽诱导培养；4）增殖培养；5）壮苗培养；6）瓶外生根。本发明以当年开花嫩茎段为外植体，以WPM或Anderson为基本培养基，利用ZT激素，成功建立了有效的碎米花组培快繁体系，10月份瓶外生根的组培苗并能实现在翌年春季开花。本发明一个增殖继代周期内（4-6周）增殖系数控制在4-5倍，一年内增殖系数为1万倍左右，极大提高了碎米花的繁殖系数，为该物种的保存和利用提供了实用科学的繁殖方法，为碎米花药用开发提供材料。

Description

一种碎米花组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及杜鹃花科杜鹃花属中碎米花的快速繁殖方法。

背景技术

碎米花（Rhododendron spiciferum Franch.），为杜鹃花科杜鹃花属糙叶杜鹃亚属糙叶杜鹃组，常绿小灌木，自然分布于四川西南、贵州西部、云南中部至东南部等，生于山坡灌丛、松林或次生林缘。碎米花幼枝有柔毛或糙硬毛，叶通常两面或至少上面被毛和鳞片。花序腋生于枝顶，花萼发育有明显裂片或浅杯状无裂片；花冠筒状或漏斗状，白色、粉红色至深红色。该野生种株小花密，易于引种驯化，适应性强，在园林绿化及盆栽中具有较大应用潜力。此外碎米花根还能作治疗风湿性关节炎和跌打损伤外用药。

对碎米花的繁殖方法鲜见有研究，一般采取种子繁殖或扦插的方法。张长芹对碎米花的种子繁殖进行过报道（云南植物研究，1992，14（1）：87-91），但种子繁殖方法生产的植株需要很多年才能开花，且前期生长速度慢。未见有扦插繁殖方面的报道，更未见通过组培方法快速繁殖碎米花的方法。

组培快繁技术是实现对碎米花大规模繁殖的重要途径，可以减少对野生资源的破坏，加快野生杜鹃的驯化进程及园林上的应用。本发明碎米花利用已开花的母株茎段为外植体，建立了高效的组培快繁体系，其培育的组培苗生长健壮，继代周期短，瓶外生根后能当年实现开花。国内未见有对碎米花组培成功的报道。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是建立一种有效的碎米花组织培养快速繁殖方法，并利用此方法进行快速低成本生产组培苗，为碎米花的组培苗工厂化生产提供技术支撑。本发明的另外一个目的是提供上述的碎米花组织培养快速繁殖培养基。

为了实现上述的第一个目的，本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种碎米花组织培养快速繁殖方法，该方法包括以下的步骤：

1）外植体的选择：春季从已开花碎米花母株上剪取带有潜伏芽的新发枝条；

2）外植体灭菌：剪去枝条叶片，先用自来水浸泡并冲洗10-20分钟，用洗洁精洗涤1-2次后吸干；然后，用无菌水冲洗3-5遍，再用0.1％氯化汞消毒8-12分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍后吸干；

3）腋芽诱导培养：将灭好菌的枝条切除茎尖，余下的枝条剪成2-3cm长的茎段，每段带有1-2个腋芽，斜插入诱导培养基中；于23-26℃，光16小时，黑8小时，培养3-5周后，茎段潜伏芽发育生长出新枝条至2-4cm长；所述的诱导培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基 + ZT 1.0-2.0 mg/L + NAA0.05-0.1 mg/L + 20 g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH4.8-5.2，高温灭菌；

4）增殖培养：剪取新长出的枝条，去顶芽后插入增殖培养基中，于23-26℃，光16小时，黑8小时，培养4-6周后，茎段长出丛生芽；此阶段可重复进行；所述的增殖培养基由以下组分构成： WPM或Anderson基本培养基 + ZT 0.5-1.0 mg/L + NAA 0.05-0.1mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2，高温灭菌；

5）壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切移入壮苗培养基中，于23-26℃，光16小时，黑8小时，培养2-4周，待长到3-5cm后移入基质中，进行瓶外生根；所述的壮苗培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基+ ZT 0.25-0.5 mg/L + NAA0.01-0.05 mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2，高温灭菌；

6）瓶外生根：在每年10至次年3月，将长到3-5 cm高的瓶苗在室外放置1周，洗去枝条上的琼脂后移入含有含泥炭：珍珠岩：蛭石体积比2：1：1的基质中，在保湿保温条件下生长，1-2个月后生根。

为了实现上述的第二个目的，本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种碎米花组织培养快速繁殖培养基，该培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基+ ZT 0.25-2.0 mg/L + NAA0.01-0.10 mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2。

作为优选，该培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基 + ZT 1.0-2.0 mg/L + NAA0.05-0.1 mg/L + 20 g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH4.8-5.2。

作为优选，该培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基 + ZT 0.5-1.0 mg/L + NAA 0.05-0.1mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2。

作为优选，该培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基+ ZT 0.25-0.5 mg/L + NAA0.01-0.05 mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2，高温灭菌。

本发明的有益效果是： 本发明以当年开花嫩茎段为外植体，以WPM或Anderson为基本培养基，利用ZT激素，成功建立了有效的碎米花组培快繁体系，10月份瓶外生根的组培苗并能实现在翌年春季开花。本发明一个增殖继代周期内（4-6周）增殖系数控制在4-5倍，一年内增殖系数为1万倍左右，极大提高了碎米花的繁殖系数，为该物种的保存和利用提供了实用科学的繁殖方法，为碎米花药用开发提供材料。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

碎米花组织培养快速繁殖方法该方法，按如下步骤进行： 

1、培养基的配制

（1）诱导培养基：WPM基本培养基 + ZT 1.0 mg/L + NAA0.05 mg/L + 20 g/L 蔗糖+ 8 g/L 琼脂，pH4.8，高温灭菌；

（2）增殖培养基：WPM基本培养基 + ZT 0.5mg/L + NAA 0.05mg/L + 20g/L 蔗糖+ 8 g/L 琼脂，pH 4.8，高温灭菌；

（3）壮苗培养基：WPM基本培养基+ ZT 0.25 mg/L + NAA0.01 mg/L + 20g/L 蔗糖+ 8 g/L 琼脂，pH 4.8，高温灭菌；

2、碎米花组织培养快速繁殖方法

（1）外植体的选择：春季从已开花碎米花母株上剪取带有潜伏芽的新发枝条；

（2）外植体灭菌：剪去枝条叶片，先用自来水浸泡并冲洗10分钟，用洗洁精洗涤2次后吸干；然后，用无菌水冲洗3遍，再用0.1％氯化汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗3遍后吸干；

（3）腋芽诱导培养：将灭好菌的枝条切除茎尖，余下的枝条剪成2 cm长的茎段（每段带有1-2个腋芽），斜插入诱导培养基中；于24℃光（16小时）/黑（8小时）培养5周后，茎段潜伏芽发育生长出新枝条至2-4cm长；

（4）增殖培养：剪取新长出的枝条，去顶芽后插入增殖培养基中，于24℃光（16小时）/黑（8小时）培养6周后，茎段长出丛生芽；此阶段可重复进行；

（5）壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切移入壮苗培养基中，于24℃光（16小时）/黑（8小时）培养3周，待长到3-5cm后移入基质中，进行瓶外生根；

（6）瓶外生根：在每年10月，将长到3-5 cm高的瓶苗在室外放置1周，洗去枝条上的琼脂后移入含有含泥炭：珍珠岩：蛭石体积比2：1：1的基质中，在保湿保温条件下生长，1个月后生根。

实施例2

碎米花组织培养快速繁殖方法，该方法按如下步骤进行： 

1、培养基的配制

（1）诱导培养基： Anderson基本培养基 + ZT 2.0 mg/L + NAA0.1 mg/L + 20 g/L白糖 + 10 g/L 琼脂，pH5.2，高温灭菌；

（2）增殖培养基：Anderson基本培养基 + ZT 1.0 mg/L + NAA0.1mg/L + 20g/L白糖 + 10 g/L 琼脂，pH 5.2，高温灭菌；

（3）壮苗培养基：Anderson基本培养基+ ZT 0.5 mg/L + NAA0.05 mg/L + 20g/L白糖 + 10 g/L 琼脂，pH 5.2，高温灭菌；

2、碎米花组织培养快速繁殖方法

（1）外植体的选择：春季从已开花碎米花母株上剪取带有潜伏芽的新发枝条；

（2）外植体灭菌：剪去枝条叶片，先用自来水浸泡并冲洗20分钟，用洗洁精洗涤1次后吸干；然后用无菌水冲洗5遍，再用0.1％氯化汞消毒8分钟，最后用无菌水冲洗5遍后吸干；

（3）腋芽诱导培养：将灭好菌的枝条切除茎尖，余下的枝条剪成3cm长的茎段（每段带有1-2个腋芽），斜插入诱导培养基中；于25℃光（16小时）/黑（8小时）培养3周后，茎段潜伏芽发育生长出新枝条至2-4cm长；

（4）增殖培养：剪取新长出的枝条，去顶芽后插入增殖培养基中，于25℃光（16小时）/黑（8小时）培养6周后，茎段长出丛生芽；此阶段可重复进行；

（5）壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切移入壮苗培养基中，于25℃光（16小时）/黑（8小时）培养2周，待长到3-5cm后移入基质中，进行瓶外生根；

（6）瓶外生根：在12月，将长到3-5 cm高的瓶苗在室外放置1周，洗去枝条上的琼脂后移入含有含泥炭：珍珠岩：蛭石体积比2：1：1的基质中，在保湿保温条件下生长，2个月后生根。

实施例3

本实施例中，所述诱导培养基为：WPM基本培养基 + ZT 2.0mg/L + NAA 0.1 mg/L + 20 g/L 白糖 + 6 g/L 琼脂，pH 5.0，高温灭菌；春季从碎米花母株上剪取幼嫩枝条，灭菌后剪除茎尖，余下的枝条切段后斜插入芽诱导培养基中，于26℃光（16小时）/黑（8小时）培养3周；将新长出的腋芽去顶后插入增殖培养基中：WPM基本培养基 + ZT 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 20g/L 白糖 + 6 g/L 琼脂，pH 5.0，高温灭菌，26℃光（16小时）/黑（8小时）培养4周；将长到1-2cm长的丛生芽剪切移入壮苗培养基中：WPM基本培养基 + ZT 0.5 mg/L + NAA 0.05 mg/L + 20g/L 白糖 + 6 g/L 琼脂，pH 5.0，高温灭菌，于26℃光（16小时）/黑（8小时）培养2周；在每年1-2月，将长到3-5 cm高的瓶苗在室外炼苗1周，在保湿保温条件下生长，1-2个月后生根；其余步骤工艺均同于实施例1。 

Claims (1)

1.一种碎米花组织培养快速繁殖方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）外植体的选择：春季从已开花碎米花母株上剪取带有潜伏芽的新发枝条；

2）外植体灭菌：剪去枝条叶片，先用自来水浸泡并冲洗10-20分钟，用洗洁精洗涤1-2次后吸干；然后，用无菌水冲洗3-5遍，再用0.1％氯化汞消毒8-12分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍后吸干；

3）腋芽诱导培养：将灭好菌的枝条切除茎尖，余下的枝条剪成2-3cm长的茎段，每段带有1-2个腋芽，斜插入诱导培养基中；于23-26℃，光16小时，黑8小时，培养3-5周后，茎段潜伏芽发育生长出新枝条至2-4cm长；所述的诱导培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基 + ZT 1.0-2.0 mg/L + NAA0.05-0.1 mg/L + 20 g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH4.8-5.2，高温灭菌；

4）增殖培养：剪取新长出的枝条，去顶芽后插入增殖培养基中，于23-26℃，光16小时，黑8小时，培养4-6周后，茎段长出丛生芽；此阶段可重复进行；所述的增殖培养基由以下组分构成： WPM或Anderson基本培养基 + ZT 0.5-1.0 mg/L + NAA 0.05-0.1mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2，高温灭菌；

5）壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切移入壮苗培养基中，于23-26℃，光16小时，黑8小时，培养2-4周，待长到3-5cm后移入基质中，进行瓶外生根；所述的壮苗培养基由以下组分构成：WPM或Anderson基本培养基+ ZT 0.25-0.5 mg/L + NAA0.01-0.05 mg/L + 20g/L 蔗糖或白糖 + 6-10 g/L 琼脂，pH 4.8-5.2，高温灭菌；

6）瓶外生根：在每年10至次年3月，将长到3-5 cm高的瓶苗在室外放置1周，洗去枝条上的琼脂后移入含有含泥炭：珍珠岩：蛭石体积比2：1：1的基质中，在保湿保温条件下生长，1-2个月后生根。