CN103364518A - 一种测定香橼汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简便、准确的测定香橼(Citrus wilsonii Tanaka)汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物浓度的方法。取香橼汁样品5mL加入15mL顶空瓶，室温(25℃)下平衡1h后，取顶空气体进样。该方法采用气相色谱及氢火焰离子化检测器对挥发性成分进行分离检测，色谱条件为：5％苯基-甲基聚硅氧烷毛细管柱，进样口温度230℃，起始柱温为50℃，保留1min后10℃/min升温至140℃。载气为氮气，流速为1.5mL/min，检测器温度250℃。该方法可以在10min内完成八种单萜烯的测定，分离度及重现性良好。根据样品的保留时间计算保留指数、结合相同样品在配备相同填料色谱柱下质谱分析检索结果，对单萜烯类碳氢化合物进行定性分析，根据峰面积采用外标法进行定量分析。该方法选用顶空直接进样法，无溶剂、不需要特殊的富集设备。

Description

一种测定香橼汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物含量的方法

一、技术领域

本发明涉及一种香橼汁挥发性单萜烯类碳氢化合物的定量方法，具体的说，是一种通过直接顶空进样的气相色谱分析香橼汁挥发性单萜烯类碳氢化合物浓度的方法。

二、背景技术

香橼为芸香科柑橘属植物(Citrus wilsonii Tanaka)，其果实香气清灵纯净，愉悦身心。香橼果不宜鲜食，是传统中药。作为中药的香橼干制饮片，其挥发油组成已有报道。香橼精油中含量最高的为单萜烯类碳氢化合物，包括柠檬烯、γ-萜品烯、罗勒烯、β-蒎烯、α-蒎烯和β-月桂烯等。单萜烯类碳氢化合物是柑橘类果汁、果皮挥发性芳香物质的主要组成，如柠檬烯通常为柑橘类果皮挥发油中含量最高的物质，不同来源的柑橘精油中柠檬烯的相对含量多在百分之六十几到九十几，并因果实种类及成熟度等因素而存在一定差别。但目前研究中，由于柑橘类水果的挥发性成分往往多达几十甚至上百种，单萜烯类成分难以与其他挥发性成分分离，最常见的定量方法为百分含量法即将所有挥发性成分的峰面积作为100％，根据每一种物质峰面积与总峰面积的比例计算相对含量，这种百分含量法用于样品间的比较具有一定的价值，但对于浓度与嗅觉感官间关系研究则不能提供足够的信息。

另外，在食品风味的顶空分析中，为获得更多成分信息及灵敏度，往往采取一些吸附材料或冷阱等方法对风味成分进行富集，但这些方法往往需要特定的较为昂贵的设备，并且由于材料的吸附解析特性差异，其测定结果与真实顶空中各种风味成分组合配比会存在一定的差异。在柑橘类果汁等产品中，单萜烯类碳氢化合物的含量在挥发性成分中往往在60％以上，采用富集方法如固相微萃取(SPME)往往导致单萜烯类碳氢化合物在色谱柱上过载，峰形变宽、前延，分离度下降，无法准确定量等问题。另外，国外有通过先以液相色谱对柑橘精油中的单萜烯类分离，再进入气相色谱分析的方法，这同样对设备要求很高。

本发明采用直接顶空进样的方法，选用分析仪器为最常用的气相色谱(GC)及氢火焰离子化检测器(FID)，通过控制温度、时间等参数，针对目标成分进行样品预备及色谱分离条件优化，对香橼汁中几种单萜烯类碳氢化合物在色谱上的分离情况、稳定性及线性范围进行了测定，具有缩短检测时间、方便快捷、无溶剂、定量准确等特点。

三、发明内容

本发明的目的是提供香橼汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物的定量方法。该方法具有简便、准确的特点。

本发明包括下列步骤：

1.香橼汁样品的准备

取样品5mL置于15mL顶空瓶中，于室温25℃平衡1h后，采用顶空法直接进样，进样体积为0.2mL

2.气相色谱分析

选择5％苯基-甲基聚硅氧烷毛细管(30m*0.32mm*0.32μm)色谱柱，FID检测器，进样口温度230℃，50℃下保留1min，然后10℃/min升温至140℃；载气流速为1.5mL/min，检测器温度250℃。

3.单萜烯碳氢化合物的定性

依据正构烷烃在样品测定相同的色谱条件的保留时间，计算各色谱峰的保留指数，计算方法见公式(1)；将保留指数与文献中相同色谱柱下测定的单萜烯类碳氢化合物的保留指数比较定性；除此以外，还可结合相同色谱柱MS谱图库的检索结果进行定性。

$I=100\×[n+\frac{t_{r\left(\mathrm{unknown}\right)}-t_{r\left(n\right)}}{t_{r\left(N\right)}-t_{r\left(n\right)}}]---\left(1\right)$

其中I——保留指数

n——较小正构烷烃的碳原子数

N——较大正构烷烃的碳原子数

tr——保留时间

4.采用外标法定量

各单萜烯类碳氢化合物的定量方法为：配置1mg/mL的待测物质的甲醇溶液(HPLC纯)作为母液，测定前稀释适当倍数，直接进样0.1-1.2μL，以峰面积和标准物质的量(ng)绘制标准曲线，根据顶空进样体积计算香橼汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物的浓度。

有益效果

1.本发明针对香橼汁挥发性成分中单萜烯类碳氢化合物含量丰富的特点，未采用任何方式富集，直接顶空进样，方法简单便捷。

2.本发明通过梯度试验设计，优化了样品顶空平衡时间，同时根据5％苯基-甲基聚硅氧烷填料的毛细管柱对单萜烯类碳氢化合物的吸附和分离特点，优化了升温程序，实现了10min以内八种单萜烯类碳氢化合物的良好分离。

3.本发明依据正构烷烃在样品测定相同的色谱条件的保留时间，利用公式(1)计算得到的各色谱峰的保留指数，与美国佛罗里达柑桔研究中心风味数据库中相同填料色谱柱保留指数比较，确定了香橼汁中八种主要的挥发性单萜烯类碳氢化合物为α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯、α-萜烯、柠檬烯、γ-萜烯、异松油烯。

4.本发明的方法重现性良好，五次重复进样，八种物质峰面积的变异系数均小于15％，对于挥发性成分的定量，在可接受范围内。

四、附图说明

图1香橼汁顶空成分和C₈-C₁₁系列正构烷烃的的SPME-GC-MS总离子流图

图2不同初始柱温时GC-FID对各单萜烯碳氢化合物的分离情况

图3香橼汁在顶空瓶内平衡时间的确定

图4八种单萜烯碳氢化合物和C₈-C₁₁正构烷烃的GC-FID色谱图

五、具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述，但并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1

1.实验仪器与试剂

1)实验仪器

Agilent7890GC-8963MS联用仪(美国Agilent公司)

可加热磁力搅拌器(PC-420，北京康林科技有限公司)

CAR/PDMS/DVB萃取头(美国Supelco公司)

2)实验试剂

C₈-C₂₀系列正构烷烃标准品(美国Sigma公司)

3.实验方法

1)香橼汁的制取

将香橼鲜果切成3-5cm的碎块，由榨汁机(DK-508料理机，青岛东亚电子有限公司)压榨制得，果汁得率约为27％。将所得果汁在6000×g离心20min，取上清液并过滤除去肉眼可见悬浮物，备用。

2)香橼汁顶空成分的固相微萃取(SPME)萃取

取5mL香橼汁于15mL样品瓶，置于磁力搅拌器上，加入搅拌子搅拌(600r/min)，预热至50℃后插入CAR/PDMS萃取头进行顶空萃取30min，解析5min，气相色谱进样分析。

3)香橼汁单萜烯碳氢化合物的气相色谱质谱联机(GC-MS)分析

HP-5毛细管色谱柱(30m×ID0.25mm×0.25μm)，高纯氦气(99.99％)为载气，进样口温度230℃；电子轰击电离(EI)离子源，电子能70eV，发射电流250μA，电子倍增器电压350V，离子源温度200℃，质量扫描范围33-450m/z，扫描速率为5.27scan/s。升温程序：45℃保持1min，10℃/min升至90℃，5℃/min升至180℃，2℃/min升至250℃，保持5min。

香橼汁样品的离子流图如图1A所示。系列正构烷烃采用直接进样的方式，相同色谱条件下获得离子流图(图1B)。根据保留指数及NIST谱图库的检索结果，可定性鉴定出11种单萜烯类碳氢化合物，见表1。从离子流图(图1A)可以看出，含量最高的柠檬烯和含量次高的γ-萜烯峰形很差，呈现色谱柱过载状态，无法与其它成分同时进行准确定量。而如果采取进样口分流的方法，则会大幅增加载气消耗，并且削弱SPME对挥发性成分的富集作用。

表1香橼汁挥发性单萜烯类碳氢化合物的GC-MS定性结果

实施例2

1、实验仪器与试剂

1)实验仪器

Agilent7890GC色谱仪(美国Agilent公司)

1.0mL顶空进样针(美国Agilent公司)

2)实验试剂

烯萜类碳氢化合物分析标准品：柠檬烯、α-蒎烯、β-月桂烯(美国Sigma公司)

色谱纯甲醇(HPLC级，美国天地公司)

C₈-C₂₀系列正构烷烃标准品(美国Sigma公司)

3、实验方法

1)香橼汁的制取同实施例1

2)香橼汁挥发性成分GC-FID测定时初始柱温的确定

HP-5毛细管色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm，美国Agilent公司)，高纯氮气(99.99％)为载气，进样口温度230℃，检测器温度250℃，载气流速1.5mL/min。

为实现几种单萜烯碳氢化合物的有效分离并缩短检测时间，分别设定初始柱温为40℃、50℃、60℃和80℃，保持1min后，10℃/min升至140℃，250℃后运行1min。

图2A、B、C、D分别为40℃、50℃、60℃和80℃四个初始柱温时GC-FID对各单萜烯碳氢化合物的分离情况，随初始柱温的升高，样品出峰时间明显提前，但峰形变差，分离度降低，60℃时峰形变宽，而80℃时则无法实现八个峰的分离。鉴于初始温度40℃时仪器降温及程序运行时间较长，选择50℃为初始柱温。

3)香橼汁挥发性成分在萃取瓶中平衡时间的确定

将香橼汁摇匀，分装于15mL的顶空瓶，每瓶5mL，密封，室温(25℃)下静置。分别于密封后15min、30min、45min、60min、75min，用顶空针在距液面1.0cm处吸取0.2mL气体，气相色谱进样。五个平衡时间下测定的八个色谱峰的峰面积如图3所示。可以看到八个成分的峰面积均在15min时显著偏低，在45min出现拐点，45-75min变化平缓，说明在测定体系中待测成分需要一定的时间才能达到气液分配平衡。为降低平衡时间引起的误差，选择1h作为平衡时间。

4)香橼汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物的GC-FID定性分析

采用步骤2)及步骤3)优化后的条件，获得香橼汁样品的挥发性成分的色谱图，如图4A所示。其中系列正构烷烃的色谱图为在相同色谱条件下直接进样获得，根据保留时间计算各色谱峰的保留指数。香橼汁样品和正构烷烃C₈-C₁₁的色谱图如图4B所示。单萜烯碳氢化合物的定性结果见表3。

表3香橼汁挥发性单萜烯类碳氢化合物的GC-FID定性结果

5)方法精密度试验

取按步骤1)制取的香橼汁，按照步骤3)的方法水浴60min即1h后进行五次重复试验，八种成分峰面积变化的变异系数分别为13.11％、7.46％、5.89％、5.87％、7.88％、7.42％、10.16％、13.38％。

6)采取外标法进行定量。分别称取10.0mg的α-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯，用色谱纯甲醇溶解定容至10mL作为母液。柠檬烯母液稀释10倍，α-蒎烯和β-月桂烯母液稀释100倍后，分别进样0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2μL，即柠檬烯的质量为10-120ng，α-蒎烯和β-月桂烯为1-12ng，由色谱工作站Agilent Open LAB工作站C.01.04进行计算得到峰面积与单萜烯质量的关系，然后除以进样体积0.2mL，可以得到香橼汁几种风味成分在顶空瓶中的浓度。

表3α-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯的测定峰面积与浓度的关系

Claims (2)

1.一种香橼汁中挥发性单萜烯类碳氢化合物定量方法，其特征在于：

1)取香橼汁样品5mL置于15mL顶空瓶中，于室温25℃平衡1h后，采用顶空法直接进样，进样体积为0.2mL。采用气相色谱配备氢火焰离子化检测器对挥发性成分进行检测，色谱条件为：选择5％苯基-甲基聚硅氧烷毛细管柱，进样口温度230℃，起始柱温为50℃，保留1min，然后以10℃/min升温至140℃。载气流速为1.5mL/min，检测器温度250℃。

2)各单萜烯类碳氢化合物的定量方法为外标法定量，配置1mg/mL的单萜烯碳氢化合物甲醇溶液(HPLC纯)作为母液，稀释适当倍数后，直接进样0.1-1.2μL，以峰面积和单萜烯类碳氢化合物的质量绘制标准曲线，并确定线性范围。最后根据进样体积计算香橼汁中各单萜烯类碳氢化合物的浓度。

2.一种香橼汁中挥发性萜烯类碳氢化合物的定量方法，其特征在于：在上述气相色谱条件下，10min以内可实现八种单萜烯类碳氢化合物的良好分离，具有良好的准确性。

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