CN103364516A

CN103364516A - 棉花纤维中苯丙烷类结构单体的检测方法

Info

Publication number: CN103364516A
Application number: CN2013102785331A
Authority: CN
Inventors: 胡文冉; 范玲; 李晓东; 王玉晶; 周小云; 孙涛; 乔坤云
Original assignee: Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: CN103364516B

Abstract

棉花纤维中苯丙烷类结构单体的检测方法，先采用巯基乙酸法提取出棉花纤维中的苯丙烷类化合物，再利用还原降解反应(DFRC)法分析巯基乙酸法提取的棉花纤维苯丙烷类化合物。该方法解决了棉花纤维中苯丙烷类化合物由于含量低其结构单体无法直接检测的问题，而且所提出的检测方法步骤简洁、条件温和、选择性强、准确率高。可用于正确的评价棉花纤维中存在的苯丙烷类结构单体。对通过调控棉花纤维苯丙烷类化合物生物合成从而改良棉花纤维品质的应用研究具有积极意义。

Description

棉花纤维中苯丙烷类结构单体的检测方法

一、技术领域

本发明属于生化分析领域，涉及了一种棉花纤维成分分析方法，具体为一种用于棉花纤维中苯丙烷类结构单体的检测方法。

二、背景技术

苯丙烷类化合物是与碳循环有关的最主要的次生代谢产物之一。植物细胞壁的苯丙烷类化合物是细胞壁的组成成分，在细胞壁中起着相互交联作用(Wallace et al.，1994)。构成植物细胞壁的苯丙烷类化合物包括两大聚合类物质，一类是木质素，另一类是低分子量的羟基酸。其中木质素与纤维素和半纤维素构成植物骨架。苯丙烷类化合物在植物细胞壁中的淀积可降低细胞壁扩张的弹性和导致细胞壁停止生长。当植物细胞壁受到来自化学和生物的侵袭时，苯丙烷类化合物能够保护纤维素纤维，并能影响细胞壁的机械强度、生长、形态建成，可以抵御来自生物和非生物的破坏(Lewis et al.，1990；Wallace et al.，1994；Boerjan et al.，2003；Bhuiyan et al.，2009；Fan et al.，2006；Lemcoff et al.，2006)。

苯丙烷类化合物是由苯基丙烷类结构单元通过碳-碳键和醚键连接而成三维高分子化合物。苯丙烷类化合物有三种木质醇单体：松柏醇(conifery alcohol)、芥子醇(sinapyl alcohol)和对-香豆醇(coumary alcohol)以多种不同化学键连接构成。其中松柏醇脱氢聚合为愈创木基丙烷结构单元(guaiacyl units，G)，芥子醇则脱氢聚合为紫丁香基丙烷结构单元(syringyl units，S)，对-香豆醇可进一步脱氢聚合为对羟基苯基结构单元(p-hydroxyphenyl units，H)。这些木质醇是羟基化与甲基化程度不同的苯丙烷衍生物。其中H结构单元不含甲氧基；G结构单元在3羟基位置具有一个甲氧基基团，C-5位置可以与其他单体形成较为稳定的C-C连接；而S结构单元在3、5两个羟基上具有两个甲氧基基团(Zubieta et al.，2002)，无游离的C-5。木质醇的生物合成是以苯丙氨酸开始，经过羟基化、甲基化、连接和还原反应，最终生成三种木质醇。这些木质醇经过复杂的生物反应、生物化学反应和化学反应而生成苯丙烷类结构单体，最后苯丙烷类结构单体相互联接形成苯丙烷类化合物聚合物(Vanholme et al.，2008)。由此可见，苯丙烷类结构单体影响着植物细胞壁中的苯丙烷类化合物聚合物的性质。

棉花纤维是单细胞结构，具有典型的次生壁结构。Gou等(Gou et al.，2007)研究证明苯丙烷代谢是棉花纤维中除糖代谢外的第二大代谢途径。Fan等(Fan et al.，2009)通过大量的实验从不同角度证明棉花纤维中除了含有纤维素外，还含有苯丙烷类化合物(包括木质素)。棉花纤维生化结构组分是棉花纤维物理品质形成的基础。作为棉花纤维中的第二大代谢途径的产物-苯丙烷类化合物对棉花纤维的细胞壁的性质、棉花纤维细胞的生长发育有着重要的影响。因此非常有必要对棉花纤维中存在的苯丙烷类化合物进行进一步的深入研究。

传统的苯丙烷类结构单体的分析方法主要有非降解法和降解法两种(Nimz et al.，1981；Chen et al.，1992；Rolando et al.，1992；Lu et al.，1997；Capanema et al.，2004；曹双瑜等，2012)，其中非降解法包括紫外光吸收光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振法(NMR)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等；降解法包括碱基硝基苯氧化法、高锰酸钾氧化法、酸解法、衍生化后的还原讲解反应(DFRC)等。这些方法主要用于木本等苯丙烷类化合物含量较高的植物材料中结构单体的分析。棉花纤维中纤维素含量高达90％以上，苯丙烷类化合物含量较低，加上苯丙烷类化合物与棉花纤维中纤维素、半纤维素结合紧密而难以提取，所以不能直接将这些方法用于棉花纤维中苯丙烷类结构单体含量的检测分析。目前还没有棉花纤维中苯丙烷类结构单体提取与检测方法的报道。棉花纤维苯丙烷类结构单体的研究滞后，影响了人们对棉花纤维中苯丙烷类化合物实质结构的认识进程。只有通过对棉花纤维中苯丙烷类结构单体的了解，才能对棉花纤维细胞壁的性质有进一步的认识，才能通过基因工程技术有目的地调控棉花纤维中苯丙烷代谢中的酶类或调节苯丙烷类结构单体合成途径，改变棉花纤维中苯丙烷类结构单体的组成与比率，从而达到改良棉花纤维品质的目的。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种适用于棉花纤维中苯丙烷类结构单体的检测分析方法。

本发明根据棉花纤维中纤维素含量高，而苯丙烷类化合物含量低，并且纤维柔软、难以研磨等特点而开发设计。所提供的检测方法包括苯丙烷类化合物提取和苯丙烷类化合物降解两个步骤，即先采用巯基乙酸法将苯丙烷类化合物从棉花纤维中提取出来，再借助还原降解反应(Derivatization Followed by Reductive Cleavage，缩写为DFRC)进行苯丙烷类结构单体的分析。

巯基乙酸法的提取原理是：将植物细胞壁物质与巯基乙酸和稀盐酸混合液煮沸后获得细胞壁残渣，再用NaOH溶液抽提，得到的NaOH提取液用浓盐酸酸化，产生沉淀，离心后即得植物细胞壁材料中的苯丙烷类化合物。DFRC方法的原理是：在乙酰溴乙酸溶液中进行衍生化和植物细胞壁溶解，接着发生在常温下使醚键断裂的还原反应，产物用来进行GC(气相色谱法)分析。

本发明的检测方法具体步骤为：样品采集与前处理、采用巯基乙酸法提取棉花纤维中的苯丙烷类化合物、乙酰溴衍生和苯丙烷类化合物溶解、还原裂解反应、乙酰化、GC分析。

由于棉花纤维属于高纤维素含量的特殊细胞壁，苯丙烷类化合物含量较低，直接采用还原降解反应(DFRC)方法分析棉花纤维中苯丙烷类化合物结构单体时由于纤维素等物质的干扰而不能真实的反映棉花纤维中存在的苯丙烷类化合物的结构单体类型。本发明采用巯基乙酸法先提取棉花纤维中的苯丙烷类化合物，在提取过程中苯丙烷类化合物在巯基乙酸(含有盐酸)的加热反应中生成其衍生物，该衍生物通过用NaOH溶液抽提，得到的溶液用盐酸酸化，产生沉淀，即为棉花纤维苯丙烷类化合物。本方法得到的苯丙烷类化合物不发生缩聚，可能产生真实的苯丙烷类化合物(Hatfield et al.，2005)。然后再采用DFRC方法进行苯丙烷类化合物结构单体的测定分析，从而排除了棉花纤维中纤维素等其他物质的干扰，保证了分析的准确性。该方法解决了棉花纤维中苯丙烷类化合物结构单体无法直接检测的问题，而且所提出的检测方法步骤简洁、条件温和、选择性强、准确率高。

本发明为正确了解棉花纤维中存在的苯丙烷类化合物结构单体提供了一种全新的提取与检测方法，通过了解棉花纤维中苯丙烷类结构单体的组成，为进一步通过改变棉花纤维形成过程中酶的活性来实现对苯丙烷类化合物生物合成的调控，改变其单体的组成及化学结构，从而达到改良棉花纤维品质的目的奠定了基础。

四、附图说明

图1是本发明的检测方法工艺流程图。

图2是陆地棉TM-1纤维中苯丙烷类化合物结构单体GC图。

图3是新海21号纤维中苯丙烷类化合物结构单体GC图。

五、具体实施方式

仪器与试剂

DKZ系列电热恒温振荡水槽；EYELAN-1100旋转蒸发仪；气质联用仪GC-2000(ThermoFinnigan)。

巯基乙酸、乙酰溴、锌粉、吡啶均购自于Sigma公司。CH₂Cl₂为色谱级(天津市光复精细化工研究所)，其余试剂为分析纯，水为蒸馏水。

乙酰溴乙酸溶液：乙酰溴/乙酸(20/80，V/V)，配制好后稳定数周。

酸性还原介质：二氧六环/乙酸/蒸馏水(5/4/1，V/V/V)，配制好后稳定数月。

匀质缓冲液(50mM Tris-HCl，10g/L Triton X-100，1M NaCl；pHg.3)。

1.样品采集与前处理

采集自然成熟的棉花纤维样品，去除棉花纤维中混入的叶片和种壳等非棉纤维杂质；取2g棉样，用均一化缓冲液清洗两次，再用80％丙酮清洗两次，纯丙酮清洗一次，每次清洗都涡旋、反复挤压、并将棉花纤维放在金属夹蒜器中挤出残留的液体，清洗完成后的棉样45℃烘干备用。

2.采用巯基乙酸法提取棉花纤维中的苯丙烷类化合物

(1)称取1.0g干净的棉花纤维，置于30mL血清瓶内，加入20mL2N HCl后再加入3mL巯基乙酸，充分混匀后旋紧瓶盖，置于98℃水浴锅内轻缓震荡4h；反应完成后取出冰上冷却20min，将反应液转至50mL离心管，12,000rpm，室温下离心15min，弃上清，残渣用20mL蒸馏水清洗3次；

(2)向离心管中的残渣中加入10mL0.5M NaOH，混匀后室温下摇动(250rpm)10-12h；随后12,000rpm，室温下离心15min，存上清液；

(3)重复步骤(2)；

(4)残渣再加10mL2M NaOH，重复步骤(2)；

(5)将三次上清合并，加入6mL浓HCl，4℃下放置4h；

(6)12,000rpm，4℃，离心20min，弃上清；

(7)沉淀分别用5mL蒸馏水清洗2次，干燥后研磨成粉末备用。

3.苯丙烷类化合物衍生化后及还原降解反应(DFRC)

(1)乙酰溴衍生和苯丙烷类化合物溶解反应

将用巯基乙酸法提取的棉纤维苯丙烷类化合物分别置于30mL具Teflon内垫的血清瓶内，加5mL乙酰溴乙酸溶液，立即盖紧瓶盖，放置于水浴锅内，60℃下水浴3h，反应完成后将降解溶液转移至10mL称量瓶内，敞口放置在通风橱内将溶液快速吹干。

(2)还原裂解

吹干后的残余物分别溶解在3mL酸性还原介质中，加入约50mg锌粉，摇床上300rpm下轻缓晃动30min。混合物倒入含10mL饱和NH₄Cl和10mL CH₂Cl₂的分液漏斗中，混匀后用3％HCl调节pH至3，CH₂Cl₂萃取2次，萃取液混合后用无水MgSO₄干燥，过滤，减压蒸发至干。

(3)乙酰化

残余物中加1.5mL CH₂Cl₂、0.2mL吡啶、0.2mL乙酸酐，混匀密封后室温下乙酰化40min，减压蒸干，残余物用无水乙醇清洗至无吡啶味道，蒸干无水乙醇。

(4)标样的乙酰化

准确称取10mg松柏醇、15mg芥子醇分别加入0.5mL吡啶溶解后，分别加入0.5mL乙酸酐，充分混匀，密封后室温下放置12-16h，加入5mL无水乙醇，真空蒸干，反复用无水乙醇清洗至无吡啶的味道后将乙酰化产物做GC分析的标样。

(5)GC分析

残余物溶解在1mL CH₂Cl₂中，进行GC分析。

GC分析的条件：采用Thermo finnigan Trace Gc2000气相色谱仪，色谱柱为HP-5MS柱(30m*0.25mm，0.5μm)，火焰光度检测器(FID)。程序升温条件为160℃，以10℃/min升温速率升至280℃。载气为氮气，流量为1.0mL/min。进样口温度为250℃，基座温度为220℃，燃烧气为氢气，35mL/min，助燃气为空气，350mL/min，尾吹气为氮气，10mL/min。分流进样，流速10mL/min，分流比为5∶1。

图2为采用本方法检测的陆地棉TM-1纤维中苯丙烷类化合物结构单体GC图。图中在保留时间9.3min处出的峰代表G型即松柏醇脱氢聚合的愈创木基丙烷结构单元，10.8min处出的峰代表S型即芥子醇则脱氢聚合的紫丁香基丙烷结构单元。

图3是采用本方法检测的新海21号纤维中苯丙烷类化合物结构单体GC图。图中在保留时间9.3min处出的峰代表G型即松柏醇脱氢聚合的愈创木基丙烷结构单元，10.8min处出的峰代表S型即芥子醇则脱氢聚合的紫丁香基丙烷结构单元。

Claims

1.一种棉花纤维中苯丙烷类结构单体的检测方法，该方法包括：先采用巯基乙酸法将苯丙烷类化合物从棉花纤维中提取出来，再借助还原降解反应(DFRC)进行苯丙烷类结构单体的分析；其中巯基乙酸法是指将植物细胞壁物质与巯基乙酸和稀盐酸混合液煮沸后获得细胞壁残渣，再用NaOH溶液抽提，得到的NaOH提取液用浓盐酸酸化，产生沉淀，离心后即得棉花纤维中苯丙烷类化合物；DFRC方法是指在乙酰溴乙酸溶液中进行衍生化和苯丙烷类化合物溶解，接着发生在常温下使醚键断裂的还原反应，产物进行GC分析。

2.如权利要求1所述之的检测方法，其特征在于该方法各步骤为：

(1)巯基乙酸法提取棉花纤维中的苯丙烷类化合物

a.称取1.0g已清洗去可溶物质的棉花纤维，置于30mL血清瓶内，加入20mL2N HCl后再加入3mL巯基乙酸，充分混匀后旋紧瓶盖，置于98℃水浴锅内轻缓震荡4h；反应完成后取出血清瓶置于冰上冷却20min，将反应液转至50mL离心管，12,000rpm，室温下离心15min，弃上清，残渣用20mL蒸馏水清洗3次；

b.向离心管中的残渣中加入10mL0.5M NaOH，混匀后室温下摇动(250rpm)10-12h；随后12,000rpm，室温下离心15min，存上清液；

c.重复步骤b；

d.残渣再加10mL2M NaOH，重复步骤b；

e.将三次上清合并，加入6mL浓HCl，4℃下放置4h；

f.12,000rpm，4℃，离心20min，弃上清；

g.沉淀用10mL蒸馏水清洗2次，干燥后研磨成粉末备用；

(2)苯丙烷类化合物衍生化后的还原降解反应(DFRC)

a.乙酰溴衍生和苯丙烷类化合物溶解反应：将用巯基乙酸法提取的棉纤维苯丙烷类化合物置于30mL具Teflon内垫的血清瓶内，加5mL AcBr∶aceticacid(20∶80，V/V)溶液，立即盖紧瓶盖，放置于水浴锅内，60℃下水浴3h，反应完成后将降解溶液转移至10mL称量瓶内，敞口放置在通风橱内将溶液快速吹干；

b.还原裂解反应：吹干后的残余物溶解在3mL酸性还原介质中，加入约50mg锌粉，摇床上300rpm下轻缓晃动30min。混合物倒入含10mL饱和NH₄Cl和10mL CH₂Cl₂的分液漏斗中，混匀后用3％HCl调节pH至3，CH₂Cl₂萃取2次，萃取液混合后用无水MgSO₄干燥，过滤，减压蒸发至干；

c.乙酰化过程：残余物中加1.5mL CH₂Cl₂、0.2mL吡啶、0.2mL乙酸酐，混匀密封后室温下乙酰化40min，减压蒸干，残余物用无水乙醇清洗至无吡啶味道，蒸干无水乙醇；

d.标样的乙酰化：准确称取10mg松柏醇、15mg芥子醇分别加入0.5mL吡啶溶解后，再分别加入0.5mL乙酸酐，充分混匀，室温下放置12-16h，然后分别加入5mL无水乙醇，真空蒸干，反复用无水乙醇清洗至无吡啶的味道后将乙酰化产物做GC分析的标样；

e.GC分析：残余物溶解在1mL CH₂Cl₂中，进行GC分析。