CN103364387A - 一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其包括如下步骤：备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，干燥，获得增强芯片；将待测样品提取液滴加到增强芯片上，晾干，获得待测样品样点；用激光拉曼光谱仪对待测样品样点进行拉曼光谱扫描，根据孔雀石绿的标准拉曼图谱对待测样品进行定性检测。该方法灵敏度高，是一种方便、快捷、实用的检测技术。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法。
背景技术
拉曼光谱(Raman spectra)，是一种散射光谱。拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼(Raman)在1928年所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。拉曼检测因其快速、准确、无损等优点被越来越广泛的应用于各个检测领域。
孔雀石绿又名中国绿，绿色有金属光泽的晶体，是有毒的三苯甲烷类化学物，可用作丝绸、皮革和纸张的染料，也可用作生物染色剂，其既是染料，也是杀菌剂，可致癌。
中国农业部于2002年5月已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，但仍有渔民在防治鱼类感染真菌是使用，也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间。
孔雀石绿的快速检测法可以为检测工作节省大量人力、财力，同时解决国家对孔雀石绿的检测难题。
申请号为200710068348.4的中国专利公开了一种孔雀石绿快速检测方法。将待测样品与提取剂混合后静置，取上清液加入层析柱中，观察层析柱中最下层吸附剂颜色变化，若形成绿色环带，可判断样品中含有孔雀石绿。此检测方法的缺点在于：1、孔雀石绿经鱼体代谢后变为无色，不会形成绿色环带；2、该法容易受其他有色的物质影响，不易准确的判断样品中是否真正为孔雀石绿。
申请号为200810025908.2的中国专利公开了一种检测动物源性食品中孔雀石绿残留的酶联免疫试剂盒，包括：包被孔雀石绿抗原的酶标板，酶标记孔雀石绿抗体工作液、孔雀石绿标准溶液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。本发明还公开了应用上述试剂盒检测孔雀石绿残留的方法，包括进行样品的前处理，利用试剂盒进行检测，结果的处理与分析等步骤。此方法检测需要严格保证酶的活性，酶活性一旦减弱或者失活，检测效果就会不明显甚至不能正常检测；此外，该检测过程过于复杂，不适合现场检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法。
本发明是这样实现的，一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其包括如下步骤：
制备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，干燥，获得增强芯片；
将待测样品提取液滴加到增强芯片上，晾干，获得待测样品样点；
用激光拉曼光谱仪对待测样品样点进行拉曼光谱扫描，根据孔雀石绿的标准拉曼图谱对待测样品进行定性检测。
本发明的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，是利用激光来照射被检物质时发生散射现象而产生与入射光频率不同的散射光谱所进行的分析方法。激光拉曼光谱仪根据接收到的散射光信息，通过特定的电脑软件进行分析后，在电脑显示器上呈现出直观的光谱曲线图。其通过对照孔雀石绿的标准图谱来确定被检物质是否为孔雀石绿，特别适用于食品安全现场的定性检测，方法简单、快捷、准确，从而保证食品安全，为广大企业、质量技术监督部门很好的开展工作，保证产品质量提供一种方便、快捷、实用的检测技术。
附图说明
图1是本发明实施例的孔雀石绿的激光拉曼检测方法的流程图；
图2是本发明实施例1中孔雀石绿标准溶液的激光拉曼谱图；
图3是本发明实施例1中孔雀石绿标准溶液的激光拉曼谱图；
图4是本发明实施例2中孔雀石绿水溶液的激光拉曼谱图；
图5是本发明实施例3鱼肉中孔雀石绿提取液的激光拉曼谱图；
图6是本发明实施例4虾肉中孔雀石绿提取液的激光拉曼谱图；
图7是本发明对比例1中孔雀石绿水溶液的激光拉曼谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，示出本发明实施例的一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其包括如下步骤：
S01：制备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，干燥，获得增强芯片；
S02：将待测样品提取液滴加到增强芯片上，晾干，获得待测样品样点；
S03：用激光拉曼光谱仪对待测样品样点进行拉曼光谱扫描，根据孔雀石绿的标准拉曼图谱对待测样品进行定性检测。
步骤S01中，优选地，纳米银胶体的浓度为2.5～3.5mg/mL。纳米银胶体的制备方法优选为：
分别配制摩尔浓度为8×10-4～1.5×10-3mol/L的硝酸银溶液和摩尔浓度为3.2×10-2～3.4×10-2mol/L的柠檬酸钠水溶液；
搅拌或震荡所述硝酸银溶液，并对其进行微波加热，待溶液沸腾后，滴入柠檬酸钠，微波加热至沸腾，获得所述拉曼增强银胶，其中，滴加的柠檬酸钠的总物质的量为硝酸银的1.5～1.7倍。
其中，硝酸银的浓度和柠檬酸钠的浓度对最后获得的拉曼增强银胶的大小和形貌均有影响，硝酸银浓度过浓，得到的纳米银胶往往会团聚，大小不均匀。硝酸银浓度过低，获得的纳米胶体会影响拉曼增强的效果。优选地，硝酸银的浓度为9×10-4～1.1×10-3mol/L。柠檬酸钠可以起到稳定剂的作用，不需要额外再添加表面活性剂，通过调整后续参数即可以获得均匀的拉曼增强银胶。
搅拌或震荡所述硝酸银溶液优选为20～40min，并对其进行微波加热，待溶液沸腾1～3min后，滴入柠檬酸钠溶液，迅速搅拌，使其保持均匀，再加热至沸腾后，滴入柠檬酸钠溶液，重复3～5次。滴加的柠檬酸钠的总物质的量为硝酸银的1.5～1.7倍。更优选地，将获得的拉曼增强银胶用离心的方法进行提纯。具体地，该提纯方法为：在10000～15000转/分钟的速度下，离心5～10min，去除上清液，即颗粒较小的以及不成形的银微粒，沉淀加水后再超声分散，如此重复2～4次，可以得到纯度较高的拉曼增强银胶。
将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，圆点的直径为2～4mm，约20μL，将其在35℃～50℃下烘干，更优选地，烘干后放置12h后，备用。纳米银胶干燥后在室温下放置24h后再进行测定，能够提高检测的灵敏度。
步骤S02中，待测样品的提取可以选用本领域中常用的方法。滴加待测样品时确保待测样覆盖银胶中心位置，因为银胶点大小的限制，滴加量控制在完全覆盖银胶点且不逸散到银胶点之外，点样量多少对检测结果无影响。优选地，滴入量在8～10μL。
步骤S03具体为，孔雀石绿的标准拉曼图谱可以通过常规方法获得，也可以通过下述方法获得：
配制5×10-4～1.5×10-3mol/L的孔雀石绿标准水溶液；
制备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，干燥，获得增强芯片；
将孔雀石绿标准水溶液滴加到增强芯片上，晾干，获得孔雀石绿标准样点；
用激光拉曼光谱仪对孔雀石绿标准样点进行拉曼光谱扫描，获得所述孔雀石绿的标准拉曼图谱。
其中，所述增强芯片的获得方法与上述待测样品激光拉曼检测中所用到的增强芯片的制备方法相同。孔雀石绿的标准溶液可以选用常规的标准溶液配制方法。
该孔雀石绿的激光拉曼检测方法对于标准品中孔雀石绿的检测限为2.16×10-7mol/L，对于水产品中的孔雀石绿的检测限为0.2mg/kg。该方法在一定范围内能够对孔雀石绿进行定量检测，但由于孔雀石绿为国家禁止在食品中添加非法添加物质，只要检出即为非法操作，即为不合格产品，因此定量检出即可。
本发明提供的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，能够定性检测孔雀石绿，适用于现场快速检测，检测方法方便、快捷、实用。此外，由于不同物质有不同的拉曼波数，因此，对于海产品体内其他物质的拉曼峰也不会影响到孔雀石绿的测定。
以下通过具体的实施例来说明上述孔雀石绿的激光拉曼检测方法。
实施例1：
配制100μg/mL的孔雀石绿标准水溶液；制备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后银胶直径为3mm，干燥，获得增强芯片；将10μL孔雀石绿标准水溶液滴加到增强芯片上，晾干，获得孔雀石绿标准样点；用美国海洋光学RAM-PRO-785E便携式激光拉曼光谱仪对孔雀石绿标准样点检测，获得孔雀石绿的标准拉曼图谱，主要特征峰波数为：1176cm-1、1397.7cm-1、和1618.6cm-1(请参见图2)。用美国海洋光学RAM-PINPNTR-785手持式激光拉曼光谱仪对孔雀石绿标准样点(进行拉曼光谱扫描，获得孔雀石绿的特征峰图谱，主要特征峰波数为：1176cm-1、1397.7cm-1、和1618.6cm-1(请参见图3)。
实施例2：
配制0.2μg/mL的孔雀石绿水溶液；取10μL点在银胶增强芯片上，晾干，用美国海洋光学RAM-PRO-785E便携式激光拉曼光谱仪对孔雀石绿标准样点检测，获得孔雀石绿激光拉曼谱图(请参见图4)。
实施例3：
鱼肉中孔雀石绿的检测。
含有孔雀石绿的鱼肉的制备：在50mL离心管中加入5g粉碎的鱼肉，再向离心管中加入0.5mL，2ppm的孔雀石绿水溶液，玻璃棒搅拌15分钟使鱼肉充分吸收混合孔雀石绿。
提取：在上述50毫升离心管中加入10mL乙腈，10000r/min匀浆30S。加入5g酸性氧化铝震荡2分钟，4000r/min离心10min，上清液转移至125mL的分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，震荡2min。
取50mL离心管加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液倒入前一离心管，用玻璃棒搅散离心管的沉淀并搅匀，旋涡混合器上震荡1min，静置20min。4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。
在50mL离心管中继续加入1.5mL，20％的盐酸羟胺溶液、2.5mL，0.05mol/L的对-甲苯磺酸溶、5mL，0.125mol/L，pH为4.5的乙酸铵缓冲溶液，震荡2min，再加入10mL乙腈，继续震荡2min，4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，具塞，剧烈震荡2min，静置分层，取下层溶液10μL点在银胶点上检测。可获得孔雀石绿的拉曼特征峰(请参见图5)。
实施例5：
虾肉中孔雀石绿的检测。
含有孔雀石绿的虾肉的制备：在50mL离心管中加入5g粉碎的虾肉，再向离心管中加入0.5mL，2ppm的孔雀石绿水溶液，玻璃棒搅拌15分钟使虾肉充分吸收混合孔雀石绿。
提取：在上述50毫升离心管中加入10mL乙腈，10000r/min匀浆30S。加入5g酸性氧化铝震荡2分钟，4000r/min离心10min，上清液转移至125mL的分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，震荡2min。
取50mL离心管加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液倒入前一离心管，用玻璃棒搅散离心管的沉淀并搅匀，旋涡混合器上震荡1min，静置20min。4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。
在50mL离心管中继续加入1.5mL，20％的盐酸羟胺溶液、2.5mL，0.05mol/L的对-甲苯磺酸溶、5mL，0.125mol/L，pH为4.5的乙酸铵缓冲溶液，震荡2min，再加入10mL乙腈，继续震荡2min，4000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，具塞，剧烈震荡2min，静置分层，取下层溶液10μL点在银胶点上检测。可获得孔雀石绿的拉曼特征峰(请参见图6)。
对比例1：
配制0.2μg/mL的孔雀石绿水溶液；取10μL点在铝片上，晾干，用美国海洋光学RAM-PRO-785E便携式激光拉曼光谱仪对孔雀石绿标准样点检测，获得不经银胶增强的孔雀石绿激光拉曼谱图(请参见图7)，因拉曼散射光及其微弱，检测时不经增强得不到其特征峰。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，干燥，获得增强芯片；
将待测样品提取液滴加到增强芯片上，晾干，获得待测样品样点；
用激光拉曼光谱仪对待测样品样点进行拉曼光谱扫描，根据孔雀石绿的标准拉曼图谱的特征峰对待测样品进行定性检测。
2.如权利要求1所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述纳米银胶体的制备方法为：
分别配制摩尔浓度为8×10-4～1.5×10-3mol/L的硝酸银溶液和摩尔浓度为3.2×10-2～3.4×10-2mol/L的柠檬酸钠水溶液；
搅拌或震荡所述硝酸银溶液，并对其进行微波加热，待溶液沸腾后，滴入柠檬酸钠，微波加热至沸腾，获得所述拉曼增强银胶，其中，滴加的柠檬酸钠的总物质的量为硝酸银的1.5～1.7倍。
3.如权利要求2所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述纳米银胶体的制备方法还包括对所述拉曼增强银胶进行离心纯化的步骤，所述离心纯化是在10000～15000转/分钟的速度下，离心5～10min，去除上清液，沉淀加水后再超声分散。
4.如权利要求2所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述硝酸银溶液的溶度为9×10-4～1.1×10-3mol/L。
5.如权利要求2所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述搅拌或震荡的时间为20～40min，所述沸腾保持1～3min，所述柠檬酸钠的滴加分3～5次进行。
6.如权利要求1所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述孔雀石绿标准图谱是采用如下方法获得：
配制5×10-4～1.5×10-3mol/L的孔雀石绿标准水溶液；
制备增强芯片：将纳米银胶体水溶液滴加到铝箔上，滴加完毕后，干燥，获得增强芯片；
将孔雀石绿标准水溶液滴加到增强芯片上，晾干，获得孔雀石绿标准样点；
用激光拉曼光谱仪对孔雀石绿标准样点进行拉曼光谱扫描，获得所述孔雀石绿的标准拉曼图谱。
7.如权利要求1所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述待测样品提取液的滴入量为8～10μL。
8.如权利要求1所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述纳米银胶体水溶液的浓度为2.5～3.5mg/mL。
9.如权利要求1所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述纳米银胶体水溶液点在铝箔上形成的银胶点的直径为2～4mm。
10.如权利要求1所述的孔雀石绿的激光拉曼检测方法，其特征在于，所述纳米银胶体在铝箔上干燥后，室温放置24h后，再滴加待测样品。
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| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 518055 Guangdong, Nanshan District, Taoyuan street, Ping Shan Industrial Park, the east side of the 9 floor, building 5, East Patentee after: SHENZHEN YU CHI TESTING TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 518055 Guangdong, Nanshan District, Taoyuan street, Ping Shan Industrial Park, the east side of the 9 floor, building 5, East Patentee before: SHENZHEN YU CHI DETECTION TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160406 |