CN103361267A

CN103361267A - 基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法及应用

Info

Publication number: CN103361267A
Application number: CN2013102770961A
Authority: CN
Inventors: 梁汝萍; 王晓妮; 邱建丁
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: CN103361267B

Abstract

本发明公开了一种基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法及其在农药检测中的应用，属于微流控芯片技术领域。先采用一步原位合成法将Fe₃O₄磁性纳米粒子负载于氧化石墨烯表面，制备了兼具良好磁性和生物相容性的氧化石墨烯/Fe₃O₄纳米复合材料；通过π-π、氢键以及疏水等作用将乙酰胆碱酯酶固定于氧化石墨烯/Fe₃O₄表面，在外磁场作用下将氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物固定于PDMS微芯片通道内，制成可用于农药检测的微酶反应器。基于农药对乙酰胆碱酯酶的抑制原理，实现了乐果的快速定量检测。基于氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合材料制备的微酶反应器，反应快速、操作简单、重现性好，为农药的快速灵敏检测提供了有效手段。

Description

基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法及其在农药检测中的应用，属于微流控芯片技术领域。

背景技术

我国是传统的农业大国，农药使用量一直居世界首位。农药的广泛使用，不仅造成环境的严重污染，同时对人体健康造成危害，已引起社会的广泛关注。目前，许多分析方法已经被应用于农药残留检测，气相色谱和高效液相色谱对农药残留检测的准确性和灵敏性高，但是存在成本高、耗时长等弊端。因此，寻求快速、灵敏、便捷的农药残留检测方法迫在眉睫。

近年来，微酶反应器成为化学和生物学领域的有用分析工具。在微流控芯片通道内构建酶反应器，样品和试剂消耗少，成本低；反应动力学过程加快，反应时间大大缩短；降低酶的自行分解，提高反应效率。传统的酶固定化方法主要有物理吸附、溶胶-凝胶包埋、共价键合等，但是，这些方法不利于酶的高效负载。纳米粒子具有大的比表面积，将酶固定在纳米粒子的表面可有效提高酶的负载量，同时，一些具有亲水性和生物相容性的纳米粒子，还可为酶的固定化提供一个良好的微环境，有效防止酶的变性。磁性纳米粒子以其微纳米级的尺寸和独特的磁响应性能，在化学和生物学领域受到了越来越多的关注。与此同时，作为碳材料中的“明星材料”，石墨烯以其超高的比表面积、独特的亲水性和生物相容性，不仅可大大提高酶的负载量，还可以保持固定化分子的生物活性，为生物分子的高效固定提供了良好的反应平台。将Fe₃O₄磁性纳米粒子负载于氧化石墨烯（GO）表面制备的磁性纳米复合材料，兼具Fe₃O₄的良好磁性能和GO的大比表面积，在生化分析领域有着广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于GO/Fe₃O₄/AChE复合物的微酶反应器制备方法及其在农药检测中的应用。

本发明是这样实现的，采用一步原位合成法将Fe₃O₄ NPs负载于GO表面，制备GO/Fe₃O₄磁性纳米复合材料，通过π-π、氢键以及疏水等作用将乙酰胆碱酯酶（AChE）固定于GO/Fe₃O₄表面，在外磁场作用下，将GO/Fe₃O₄/AChE复合物固定于PDMS微芯片分离通道内，制备微酶反应器。基于农药对AChE的抑制原理，用于对乐果的快速定量检测。本发明制备的GO/Fe₃O₄复合材料，一方面具有Fe₃O₄的良好磁性能，可实现GO/Fe₃O₄/AChE复合物在PDMS微芯片分离通道内的简单和可控固定，不仅节约了操作时间，而且，通过对外加磁场有无的控制，还可实现微酶反应器的再生，大大提高了芯片的重复利用率；另一方面，GO的大比表面积，提高了AChE在PDMS微芯片分离通道内的负载量。采用GO/Fe₃O₄/AChE复合物制备的微酶反应器，成功实现了有机磷农药的高灵敏度检测。

本发明采用以下技术方案：

（1）采用Hummers方法制备氧化石墨烯：将0.5 g石墨粉和0.5 g的NaNO₃ 加入到23 mL浓度为18 mol·L^-1的H₂SO₄中，冰浴下缓慢加入3 g KMnO₄，充分搅拌混匀后，于35 °C水浴中反应1 h，形成灰褐色糊状物。加入40 mL水，室温下搅拌30 min，再加水稀释至140 mL。逐滴加入3 mL质量百分浓度为30%的H₂O₂，溶液从深棕色变成亮黄色。将产物趁热过滤，用超纯水离心清洗产物至上层清液为中性，在12000 r·min^-1转速下离心2 min，将离心产物分散于超纯水中，再在8000 r·min^-1转速下离心2 min，将离心产物分散于超纯水中，超声处理2 h，即得到GO溶液；

（2）Fe₃O₄ NPs功能化GO纳米材料的制备：将40 mg的GO溶解于20 mL超纯水中，超声30 min；待GO完全溶解后，加热至50 °C，通入N₂除去O₂后，加入216 mg的FeCl₃·6H₂O和80 mg的FeCl₂·4H₂O，继续超声20 min；搅拌条件下逐滴加入1 mL的NH₃·H₂O，剧烈搅拌40 min，冷却至室温后，用磁铁将GO/Fe₃O₄ NPs分离，并用超纯水清洗3次；

（3）GO/Fe₃O₄/AChE复合物的制备：将4 mg·mL^-1的GO/Fe₃O₄和0.2 mg·mL^-1的AChE加入到1 mL的PBS缓冲溶液中，室温下反应24 h；用磁铁将产物分离并用超纯水清洗3次，将GO/Fe₃O₄/AChE复合物分散于1 mL超纯水中，于4 °C储存备用；

（4）基于GO/Fe₃O₄/AChE复合物的微酶反应器的制备：将PDMS微芯片分离通道用超纯水冲洗10 min，在芯片分离通道的上、下两方各放置一块直径为6 mm的永久磁铁，用真空泵将4 mg·mL^-1的GO/Fe₃O₄/AChE复合物抽入分离通道中10 min，在外磁场作用下，GO/Fe₃O₄/AChE复合物被迅速可控地固定于芯片分离通道内，在冰箱中保存2 h后，用PBS缓冲溶液冲洗分离通道5 min，即制备成微酶反应器；

基于GO/Fe₃O₄/AChE复合材料制备的微酶反应器在农药检测中的应用：随着有机磷农药乐果浓度的增大，微酶反应器中AChE的活性受到抑制，酶对其底物硫代乙酰胆碱（ATCh）的催化能力降低，使得产生的电活性产物硫代胆碱（TCh）的量减少，从而电化学信号降低。乐果浓度在1-20 μg·L^-1范围内与其抑制率呈良好的线性关系，检出限为0.18 μg·L^-1，表明采用GO/Fe₃O₄/AChE复合物制备的微酶反应器可用于农药的高灵敏检测；

上述方法中，所述的Fe₃O₄ NPs的粒径为8 nm；所述的PBS缓冲溶液浓度为20 mM，pH为7.4；所述的在芯片分离通道的上、下两方各放置一块直径为6 mm的永久磁铁，两块永久磁铁相吸引的两极需彼此相对。

本发明的优点是：本发明提出了一种在PDMS微芯片分离通道内制备微酶反应器用于农药检测的方法。制备的GO/Fe₃O₄复合材料，一方面具有Fe₃O₄的良好磁性能，可实现GO/Fe₃O₄/AChE在PDMS微芯片分离通道内的简单和可控固定，不仅节约了操作时间，而且通过对外加磁场的控制，还可实现微酶反应器的再生，大大提高了芯片的重复利用率；另一方面，GO的大比表面积，提高了AChE在PDMS微芯片分离通道内的负载量。制备的微酶反应器可用于对有机磷农药的检测，具有方法简单快速、灵敏度高、重现性好等特点。

附图说明

图1是微酶反应器的制备过程和农药检测原理图。

图2是（A）GO和（B）GO/Fe₃O₄的扫描电镜图，（C）GO/Fe₃O₄在无（1）和有（2）外加磁场下的对比图。

图3是（a）Fe₃O₄、（b）GO、（c）GO/Fe₃O₄、（d）GO/Fe₃O₄/AChE和（e）AChE的紫外-可见吸收光谱图。

图4是（a）GO、（b）GO/Fe₃O₄、（c）GO/Fe₃O₄/AChE和（d）AChE 的红外光谱图。

图5是（a）PDMS芯片、（b）GO/Fe₃O₄和（c）GO/Fe₃O₄/AChE 修饰PDMS芯片的接触角表征。

图6（a）检测电位的优化（曲线a–i的检测电位为-0.5 V, -0.4 V, -0.3 V, -0.2 V, -0.1 V, 0 V, 0.1 V, 0.2 V和0.3 V）；（b）分离电压的优化（曲线a-h的分离电压为700 V, 800 V, 900 V, 1000 V, 1100 V, 1200 V, 1300 V和1400 V）；（c）底物ATCh浓度的优化（曲线a-f的ATCh浓度为1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM和20 mM）。实验条件：检测电位0.1 V；进样电压800 V；进样时间5 s；分离电压1200 V；ATCh浓度10.0 mM；PBS缓冲溶液浓度为20 mM，pH为7.4。

图7是（A）微酶反应器对乐果检测的电泳图，曲线a-h的乐果浓度为0, 1, 5, 10, 15, 20, 40和100 µg·L^-1。（B）乐果检测的标准曲线，内插图为乐果检测的线性曲线。其他条件同图6。

图8是AChE酶的活性分析：（a）AChE的初始活性，（b）经100 μg·L^-1乐果抑制后的AChE活性，（c）经5 mM解磷锭孵育10 min后AChE的活性，（d）活化后再经100 μg·L^-1乐果抑制后的AChE活性。其他条件同图6。

具体实施方案

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

实施例 1

PDMS芯片的制作：以SU-8阳模（博奥生物有限公司）为模板，制作典型的十字型PDMS微流控芯片通道，如图1所示。具体制作过程如下：取一定量的PDMS单体和固化剂按10:1（质量比）混合均匀、除气，倾注于SU-8模板上，在 70 ºC下固化2小时。待冷却后从模板上剥下含十字型通道的PDMS芯片，用刀片切割成所需形状，用打孔器在缓冲液池、样品池和样品废液池等三处打孔，形成直径为3 mm的孔。同时，以平滑玻璃板为模板，按照同样步骤制备不含微通道的PDMS芯片为盖片。将含十字通道的PDMS芯片和不含通道的PDMS盖片分别用二次水、甲醇、二次水超声清洗10 min，在红外灯下烘干，随即将两片PDMS封合，形成一块可逆的PDMS芯片。PDMS分离通道长46 mm（有效分离长度40 mm），进样通道长20 mm。所制得的PDMS微芯片分离通道宽50 μm，进样通道宽30 μm，深度均为18 μm。

实施例 2

（1）采用Hummers方法制备氧化石墨烯：将0.5 g石墨粉和0.5 g的NaNO₃ 加入到23 mL浓度为18 mol·L^-1的H₂SO₄中，冰浴下缓慢加入3 g KMnO₄，充分搅拌混匀后，于35 °C水浴中反应1 h，形成灰褐色糊状物。加入40 mL水，室温下搅拌30 min，再加水稀释至140 mL。逐滴加入3 mL质量百分浓度为30%的H₂O₂，溶液从深棕色变成亮黄色。将产物趁热过滤，用超纯水离心清洗产物至上层清液为中性，在12000 r·min^-1转速下离心2 min，将离心产物分散于超纯水中，再在8000 r·min^-1转速下离心2 min，将离心产物分散于超纯水中，超声处理2 h，即得到GO溶液。

（2）Fe₃O₄ NPs功能化GO纳米材料的制备：将40 mg的GO溶解于20 mL超纯水中，超声30 min；待GO完全溶解后，加热至50 °C，通入N₂除去O₂，加入216 mg的FeCl₃·6H₂O和80 mg的FeCl₂·4H₂O，继续超声20 min；搅拌条件下逐滴加入1 mL的NH₃·H₂O，剧烈搅拌40 min，冷却至室温后，用磁铁将GO/Fe₃O₄ NPs分离，并用超纯水清洗3次。

（3）GO/Fe₃O₄/AChE复合物的制备：将4 mg·mL^-1的GO/Fe₃O₄和0.2 mg·mL^-1的AChE加入到1 mL的PBS缓冲溶液中，室温下反应24 h；用磁铁将产物分离并用超纯水清洗3次，将GO/Fe₃O₄/AChE复合物分散于1 mL超纯水中，于4 °C储存备用。

（4）基于G/Fe₃O₄/AChE复合物的微酶反应器的制备：将PDMS微芯片分离通道用超纯水冲洗10 min，在芯片分离通道的上、下两方各放置一块直径为6 mm的永久磁铁，用真空泵将4 mg·mL^-1的GO/Fe₃O₄/AChE复合物抽入分离通道中10 min，在外磁场作用下，GO/Fe₃O₄/AChE复合物被迅速可控地固定于芯片分离通道内，在冰箱中保存2 h后，用PBS缓冲溶液冲洗分离通道5 min，即制备成微酶反应器。

采用扫描电镜对GO和GO/Fe₃O₄的形貌进行表征，结果如图2所示。与GO的扫描电镜形貌（图2A）相比，负载了Fe₃O₄ NPs后的GO/Fe₃O₄表面有大量粒径均匀的纳米粒子，平均粒径为8 nm，且未见明显的团聚现象（图2B）。由图2C可见，GO/Fe₃O₄悬浮液分散均匀且呈黑色（瓶1），当在该悬浮液附近施加一个外磁场时，GO/Fe₃O₄复合材料迅速朝向磁铁方向移动，在磁铁附近形成一个棕黑色的GO/Fe₃O₄斑点，而溶液则澄清透明（瓶2）。以上结果表明， GO/Fe₃O₄复合材料具有很好的水溶性，而且负载于GO表面的Fe₃O₄ NPs保持了良好的磁性能，使得仅在外磁场作用下，就可以很好地实现GO/Fe₃O₄复合材料在PDMS微芯片分离通道内的简单和可控固定化。

图3为GO/Fe₃O₄和GO/Fe₃O₄/AChE复合材料的紫外光谱表征。由图可见，Fe₃O₄没有明显的吸收峰（曲线a）；GO在230 nm处出现了特征吸收峰，表明GO的成功合成（曲线b）；当把Fe₃O₄ NPs沉积在GO表面后，230 nm处的吸收带变宽（曲线c）；当进一步将AChE固定在 GO/Fe₃O₄表面上时，在278 nm处出现了新的吸收峰（曲线d），对应于AChE的特征吸收峰（曲线e），表明AChE成功组装于GO/Fe₃O₄复合纳米材料表面。

图4为GO/Fe₃O₄/AChE复合材料的红外光谱表征。由图可见，GO在1622 cm^-1和3430 cm^-1处分别出现了C=C和−OH的伸缩振动峰，1738 cm^-1处出现了C=O的伸缩振动峰，1230 cm⁻ ¹和1060 cm⁻ ¹处分别出现了C−OH和C−O的伸缩振动峰（曲线a）。当把Fe₃O₄沉积在GO表面后，Fe₃O₄中570 cm^-1的Fe−O的伸缩振动峰红移到585 cm^-1处（曲线b），表明Fe₃O₄成功负载于GO表面。当将AChE负载于GO/Fe₃O₄表面后，GO/Fe₃O₄/AChE纳米复合材料在1646 cm^-1和1537 cm^-1处出现了新的吸收峰（曲线c），分别对应于AChE的酰胺一键和酰胺二键的特征吸收（曲线d），表明AChE成功负载于GO/Fe₃O₄纳米复合材料表面，且保持了良好的生物活性。

采用接触角对GO/Fe₃O₄/AChE修饰前后PDMS微芯片的亲水性进行表征。由图5可见，裸PDMS芯片的接触角高达112°（图5a）；经GO/Fe₃O₄复合物修饰后，其接触角减小为42°（图5b）；当GO/Fe₃O₄/AChE复合物修饰到PDMS芯片表面时，接触角大大减小为22°（图5c）。结果表明，经GO/Fe₃O₄/AChE复合材料修饰的PDMS芯片的亲水性得到了大大改善，可有效抑制分析物在PDMS微芯片分离通道内的非特异性吸附。

实施例 3

基于GO/Fe₃O₄/AChE制备的微酶反应器在农药检测中的应用：

（1）检测电位、分离电压、底物ATCh浓度对微酶反应器性能的影响

图6A为检测电位对微酶反应器性能的影响。当检测电位低于-0.3 V时， TCh的峰电流较小；随着检测电位的增加，峰电流随之增大。当检测电位高于+0.1 V时，峰电流增加缓慢；继续增大检测电位，背景电流也随之增加。此外，碳纤维工作电极承受过高电压时容易软化，为了延长工作电极的使用寿命以及综合考虑检测信号的稳定性、重现性和信噪比，本实验选择+0.1 V为检测电位。

图 6B为分离电压对微酶反应器性能的影响。从700 V到1200 V，随着分离电压的增大，TCh的峰电流逐渐增大，出峰时间逐渐缩短，峰型也变得尖锐且对称，但当分离电压超过1200 V后，基线噪音增大，而且过高的分离电压使碳纤维电极上产生气泡，影响检测。所以，本发明选择1200 V为分离电压。

图 6C为底物ATCh浓度对微酶反应器性能的影响。随着底物浓度的增大，AChE催化ATCh产生的TCh增多，TCh的电信号增强。当ATCh浓度从1 mM 到10 mM逐渐增大时，电流信号逐渐增大。当底物浓度超过10 mM时，电流信号的增大不明显。因此，本发明选用10 mM为底物浓度。

（2）微酶反应器的一个重要应用是进行分析物的检测，图7A为采用GO/Fe₃O₄/AChE复合材料制备的微酶反应器对乐果检测的电泳图。由图可见，随着乐果浓度的增大，电流信号逐渐减小。当乐果浓度大于20 μg·L^-1时，电流信号变化不明显，趋于稳定。图7B为乐果检测的标准曲线，乐果浓度在1-20 μg·L^-1范围内与其抑制率呈线性关系，线性方程为：y=8.71+3.85x，式中，y为抑制率，x为乐果浓度。线性相关系数为0.9961，检出限为0.18 μg·L^-1 (S/N=3)，灵敏度为16.8 nA·L·μg^-1。结果表明，本发明采用GO/Fe₃O₄/AChE复合物制备的微酶反应器可用于对农药的高灵敏检测。

（3）微酶反应器的再活化应用。图8为微酶反应器使用解磷锭（2-PAM）再活化被抑制AChE前和后对乐果检测的电泳图。AChE的初始活性最大，其对底物催化的电流响应信号最强（曲线a）；经100 μg·L^-1的乐果抑制后，AChE的活性降低，对底物的催化能力下降，峰电流大大减小（曲线b）；当抑制的酶经5 mM的2-PAM活化10 min后，酶的活性恢复到原来的97.2%，对底物的催化能力增强，响应电流几乎恢复至初始大小（曲线c）；当再次通入100 μg·L^-1 乐果对酶进行抑制时，酶的活性再次被抑制，使得响应电流再次减小（曲线d）。以上结果表明，2-PAM可对AChE进行有效活化，经过2-PAM活化的AChE恢复了良好的活性，可用于对农药的多次灵敏检测，不仅大大节省了酶的用量，而且提高了微酶反应器的重复利用率。

Claims

1.一种基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤：

（1）采用Hummers方法制备氧化石墨烯：将0.5 g石墨粉和0.5 g的NaNO₃ 加入到23 mL浓度为18 mol·L^-1的H₂SO₄中，冰浴下缓慢加入3 g KMnO₄，充分搅拌混匀后，于35 °C水浴中反应1 h，形成灰褐色糊状物；加入40 mL水，室温下搅拌30 min，再加水稀释至140 mL；逐滴加入3 mL质量百分浓度为30%的H₂O₂，溶液从深棕色变成亮黄色；将产物趁热过滤，用超纯水离心清洗产物至上层清液为中性，在12000 r·min^-1转速下离心2 min，将离心产物分散于超纯水中，再在8000 r·min^-1转速下离心2 min，将离心产物分散于超纯水中，超声处理2 h，即得到氧化石墨烯溶液；

（2）Fe₃O₄ NPs功能化氧化石墨烯纳米材料的制备：将40 mg氧化石墨烯溶解于20 mL超纯水中，超声30 min；待氧化石墨烯完全溶解后，加热至50 °C，通入N₂除去O₂后，加入216 mg的FeCl₃·6H₂O和80 mg的FeCl₂·4H₂O，继续超声20 min；搅拌条件下逐滴加入1 mL的NH₃·H₂O，剧烈搅拌40 min，冷却至室温后，用磁铁将氧化石墨烯/Fe₃O₄ NPs分离，并用超纯水清洗3次；

（3）氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物的制备：将4 mg·mL^-1的氧化石墨烯/Fe₃O₄和0.2 mg·mL^-1的乙酰胆碱酯酶加入到1 mL磷酸盐缓冲溶液中，室温下反应24 h；用磁铁将产物分离并用超纯水清洗3次，将氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物分散于1 mL超纯水中，于4 °C储存备用；

（4）基于氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物的微酶反应器的制备：将PDMS微芯片分离通道用超纯水冲洗10 min，在芯片分离通道的上、下两方各放置一块直径为6 mm的永久磁铁，用真空泵将4 mg·mL^-1氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物抽入分离通道中10 min，在外磁场作用下，氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物被迅速可控地固定于芯片分离通道内，在冰箱中保存2 h后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗分离通道5 min，即制备成微酶反应器。

2.根据权利要求1所述的一种基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法，其特征在于步骤（2）中，所述的Fe₃O₄ NPs的粒径为8 nm。

3.根据权利要求1所述的一种基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法，其特征在于步骤（3）和（4）中，所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为20 mM，pH为7.4。

4.根据权利要求1所述的一种基于磁性功能化氧化石墨烯的微酶反应器制备方法，其特征在于步骤（4）中，所述的在芯片分离通道的上、下两方各放置一块直径为6 mm的永久磁铁，两块永久磁铁相吸引的两极需彼此相对。

5.基于磁性功能化氧化石墨烯制备的微酶反应器的应用，即在农药检测中的应用，其特征在于基于氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物制备的微酶反应器在农药检测中的应用：随着有机磷农药乐果浓度的增大，微酶反应器中乙酰胆碱酯酶的活性受到抑制，酶对其底物硫代乙酰胆碱的催化能力降低，使得产生的电活性产物硫代胆碱的量减少，从而电化学信号降低；乐果浓度在1-20 μg·L^-1范围内与其抑制率呈良好的线性关系，检出限为0.18 μg·L^-1，表明采用氧化石墨烯/Fe₃O₄/乙酰胆碱酯酶复合物制备的微酶反应器可用于农药的高灵敏检测。