CN103351391A - 作为二肽基酶抑制剂的化合物及其组合物，以及它们的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一系列作为二肽基酶抑制剂的化合物及其药学上可接受的盐或前药，以及它们的组合物，以及它们用于治疗或预防与二肽基肽酶有关的疾病的用途，例如，糖尿病，特别是 II 型糖尿病，以及它们用于治疗、控制或预防高血糖症的药物的用途。本发明还提供了这些化合物从它们的立体化学异构体中的分离和提纯过程。本发明所公开的这些化合物显示出比现有的二肽基肽酶 -IV 抑制剂更优的药效，毒性低，提供了一种较好的现有二肽基肽酶 -IV 抑制剂的替代药物。

Description

作为二肽基酶抑制剂的化合物及其组合物,以及它们的用途

技术领域

本发明涉及药物领域，更特别涉及作为二肽基肽酶-IV酶(DPP-IV)抑制剂，用于治疗或预防与二肽基肽酶-IV酶有关的疾病的化合物，例如糖尿病，特别是II型糖尿病。本发明还涉及此类化合物的组合物，以及它们在预防或治疗与二肽基肽酶-IV酶有关的疾病中的用途。

背景技术

糖尿病是一种血液中的葡糖糖容易堆积过多的疾病，由遗传因素、免疫功能紊乱等多种致病因素引起，其表现在于，在禁食状态下或口服葡萄糖耐量试验期间服用葡萄糖后，血浆葡萄糖水平升高或高血糖症。

糖尿病大体分为I型糖尿病、II型糖尿病。I型糖尿病是一种自体免疫疾病，又称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，患者几乎不产生或完全不产生胰岛素(该激素调节葡萄糖的利用)，因此需要终身使用外来胰岛素治疗。II型糖尿病是成人发病型糖尿病，又称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，其具有更强的遗传性和环境因素，并呈显著的异质性，与非糖尿病患者相比，患者通常具有相同或更高的血浆胰岛素水平；然而，这些患者在主要的胰岛素敏感性组织中的胰岛素对葡萄糖和脂类代谢的刺激作用已形成抗性，并且虽然血浆胰岛素水平升高，但是仍不足以克服明显的胰岛素抗性。

胰岛素抗性主要不是由于胰岛素受体数目的减少，而是由于尚未知晓的后胰岛素受体结合缺陷。对胰岛素应答的这种抗性导致肌肉内对葡萄糖摄取、氧化和储存的胰岛素激活不足，以及对脂肪组织中脂解和对肝脏中葡萄糖产生和分泌的胰岛素抑制的不足。

现有的治疗II型糖尿病的方法存在着诸多局限性。通过给予磺酰脲类或氯茴苯酸来增加胰岛素的血浆水平，其刺激胰腺的β-细胞以分泌更多的胰岛素，和/或当磺酰脲类或氯茴苯酸变得无效时，通过注射胰岛素，可以导致胰岛素浓度足够高以刺激非常抗胰岛素的组织。然而，危险的低水平的血浆葡萄糖可以由给予胰岛素或胰岛素促泌剂引起，并且更高的血浆胰岛素水平可能导致高水平的胰岛素抗性。双胍类能增加胰岛素敏感性，从而使高血糖症在一定程度上得到缓和。然而，这两种双胍类药物，苯乙双胍和二甲双胍，都可能诱发乳酸酸中毒和恶心/腹泻。其中，二甲双胍比苯乙双胍副作用低，因此经常作为治疗II型糖尿病的处方药。

近来，公开了能有效地改善II型糖尿病多种症状的一类化合物-格列酮类。在II型糖尿病的几个动物模型中，这些药物显著提高了肌肉、肝脏和脂肪组织中的胰岛素敏感性，从而使高血浆葡萄糖水平得到部分或完全的修正而不出现低血糖。然而，一些格列酮类出现了严重的副作用。

作为药物的化合物，二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂也在研究之中，它们可以用于治疗糖尿病，特别是II型糖尿病。DPP-IV抑制剂在治疗II型糖尿病中的用途是基于体内DPP-IV很容易灭活胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胃抑制肽(GIP)的事实。GLP-1和GIP是肠降血糖素，它们在消耗食物时产生。肠降血糖素刺激胰岛素生成。DPP-IV的抑制导致肠降血糖素的灭活下降，这反过来导致肠降血糖素在刺激通过胰腺产生胰岛素的效果方面得到提高。

因此，DPP-IV的抑制导致血清胰岛素水平提高，另外，由于肠降血糖素只有当食物消耗时才产生，因此不期望在不适当的时间如两餐之间DPP-IV抑制提高胰岛素水平，其可能导致血糖过低，即低血糖。因此，期望DPP-IV的抑制能增加胰岛素而没有增加低血糖的风险，低血糖是与胰岛素促泌剂的使用有关的一种危险副作用。

一些二肽基肽酶-IV抑制剂已经成药进入市场，比如默克公司的西它列汀(Sitagliptin)。

发明内容

为克服现有技术中的上述问题，本发明提供了一种用于治疗或预防与二肽基肽酶IV酶有关疾病的化合物和包含这些化合物的药物组合物，以及这些化合物及组合物在预防或治疗这些与二肽基肽酶IV酶有关的疾病中的用途。

本发明采用的技术方案是：

本发明一方面提供了一种如下式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)及(VI)各化学式所表示的化合物及其药学上可接受的盐或前药，

本发明提供了前述具有化学式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)及(VI)的化合物或其各种盐或前药，以及这些化合物及它们的组合物用于抑制二肽基肽酶IV酶的用途。

本发明另一方面提供了一种药物组合物，包括任一前述化学式所表示的化合物和惰性载体。

本发明另外还提供了任一前述化学式所表示的化合物在制备用于抑制二肽基肽酶活性的药物中的用途。

本发明进一步提供了前述任一化学式所表示的化合物用作在哺乳动物中治疗、控制或预防非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)的药物的用途。

本发明还进一步提供了任一化学式所表示的化合物用作在哺乳动物中治疗、控制或预防高血糖症的药物的用途。

本发明进一步提供了任一前述化合物在制备用于在哺乳动物患者中治疗、控制或预防可以通过抑制DPP-IV进行治疗的病症中的用途，其中所述治疗包括给予患者治疗有效量的任一前述化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种选自以下群组的化合物：(a)其它二肽基肽酶IV抑制剂；(b)胰岛素敏化剂，选自(i)PPAR激动剂，(ii)双胍和(iii)蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B抑制剂；(c)胰岛素或胰岛素模拟物；(d)磺酰脲类或其它胰岛素促泌剂；(e)a-葡糖苷酶抑制剂；(f)胰高血糖素受体激动剂；(g)GLP-1，GLP-1模拟物和GLP-1受体激动剂；(h)GIP，GIP模拟物和GIP受体激动剂；(i)PACAP，PACAP模拟物和PACAP受体3激动剂；(j)降低胆固醇试剂，选自(i)HMG-CoA还原酶抑制剂，(ii)螯合剂，(iii)烟醇，烟酸或其盐，(iv)PPARoc激动剂，(v)PPARoc/γ二重激动剂，(vi)胆固醇吸收抑制剂，(vii)脂肪酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶抑制剂，和(viii)抗氧化剂；(k)PPARγ激动剂；(1)抗肥胖化合物；(m)回肠胆汁酸转运蛋白抑制剂；及(n)抗炎药。

本发明所提供的式(I)～式(VI)的化合物，即化合物(I)～(VI)，含有两个立体化学不对称中心，均是如结构所示有高光学活性和纯度的单一对映体。

本发明进一步提供除所示式(I)～式(VI)的化合物立体化学结构以外的立体化学异构体，包括消旋体和外消旋混合物、非对映体混合物和各非对映体的形式，然而，它们和所示式(I)～式(VI)的化合物相比，都不能有效抑制二肽基肽酶-IV或具有明显升高的毒副作用。

本发明进一步提供了一种从式(I)～式(VI)的化合物和它们相应的立体化学异构体，包括消旋体和外消旋混合物、非对映体混合物和各非对映体中分离和提纯式(I)～式(VI)的化合物的方法。

本发明也包括前述式(I)～式(VI)的化合物可能存在的如下物理化学形态：

(1)载体前药形式和活性代谢物。

载体前药是含有传导部分的药物化合物，如能改善摄取和(或)提高局部传递至活动网络。理想的载体前药，药物部分和传导部分是共价键键合，所述前药是不活跃的或比药物化合物不活跃，所述前药和任何释放的传导部分是无毒的。对于前药，传导部分的目的是改善吸收，通常传导部分的释放应迅速。在其他情况下，利用缓慢释放的传导部分也是可取的，例如，一些聚合物或其一部分，如环糊精(请参见Cheng等的美国专利，公开号为20040077595，申请号10/656,838)。这种载体前药往往在口服药物上有利的。载体前药能，例如，被用于改善一个或多个下列特性：提高亲油性；提高药物作用的持续性；提高位点特异性(site-specificity)；降低毒副作用；和(或)改善药物结构(如稳定性、水溶性、抑制不良感官或物理性质)。例如，通过用羧酸对羟基进行酯化，或用醇(如脂肪醇)对羧酸基进行酯化对来提高亲油性。(Wermuth、supra.)前药会在一步内由前药形态转成激活态，或会有一种或多种具有活性或不具活性的中间形式。

代谢产物(如活性代谢产物)与上述前药(如生物前药)重叠。因此，这种代谢产物是药理活性化合物或其进一步代谢产生药理活性化合物的化合物，是对象体内的代谢过程产生的衍生物。其中，活性代谢产物是药理活性的衍生化合物。对于前药，前药化合物通常是不活泼的或比代谢产物活性低。对于代谢产物，衍生化合物可能是一活性药物或一低活性前药。

前药和活性代谢产物可以通过本领域的常规技术来鉴定。请参见Bertolini等，1997，J Med Chem40：2011-2016；Shan等，JPharm Sd86：756-757；Bagshawe，1995，Drug Dev Res34：220-230；Wermuth、supra。

(2)药学上可接受的盐

化合物可以被配方为或是药学上可接受的盐的形式。药学上可接受的盐在其被许可的剂量和浓度内是没有毒性的。该种盐类的制备可以通过改变化合物的物理性质而不防止其发挥生物作用来促进化合物的药理学使用。物理特性的有效的改变包括降低熔点来简化转化粘液质管理，通过提高溶解度来简化药物的高浓度管理。

药学上可接受的盐包括酸加成盐，如硫酸盐、氯化物、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环已基氨基磺酸盐和奎尼酸盐(quinate)。药学上可接受的盐可以由酸获得，如盐酸、顺丁烯二酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙二酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。

当酸官能团(如羧酸或苯酚)存在时，药学上可接受的盐还包括碱加成盐(basic addition salts)，如那些含苯乍生(benzathine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱(choline)、二乙醇胺、乙醇胺、叔丁乙酸盐、氨茶碱、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的盐。例如，请参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，19*ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，Vol.2，p.1457，1995。这些盐可以由相应的碱制得。

药学上可接受的盐可以用标准技术制备。例如，一化合物的自由基可以被一合适的溶剂溶解，如含有适当的酸的水溶液(aqueous)或水-醇(aqueous-alcohol)溶液，然后蒸发溶液分离得到化合物。在另一例子中，通过自由基和酸在有机溶剂中反应得到盐。

这样，比如，如果所述化合物是碱，那预期的药学上可接受的盐可以通过任何本领域合适的方式制得，如用无机酸处理自由基，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或用有机酸处理自由基，所述有机酸如乙酸、马来酸、琥珀酸、苦杏仁酸、富马酸、丙二酸、乙酰甲酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)(如醛酸或半乳糖醛酸)、α-羟基酸(如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(如天门冬氨酸或谷氨酸)、芳香族酸(如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(如对甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)或甲磺酸)等。

类似地，如果化合物是酸，那预期的药学上可接受的盐可以通过任何合适的方式制得，比如，用无机碱或有机碱处理自由基，所述无机碱或有机碱如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等。合适盐的举例来说包括，来源于氨基酸的有机盐，所述氨基酸如L-甘氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸、氨水、伯胺、仲胺、叔胺和环胺(如羟乙基吡咯酮烷、哌啶、吗啉和哌嗪)，来源于钠、钙、钾，镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。进一步地，通式I化合物的药学上可接受的盐的包括但不限于，该化合物的单钠盐和二钾盐(bis-potassium salts)。不同化合物的药学上可接受的盐可以以络合物的形式存在。所述络合物的例子包括，8-氯茶碱络合物(类似于，如茶苯海明8-氯茶碱(1∶1)络合物；茶苯海明)和不同的含环糊精络合物。

除非有相反的规定，本文中化合物的说明包括该化合物的药学上可接受的盐。

(3)多晶体和无定形体

多晶体和无定形体没有可辨别的晶格因此无有序结构单元。许多药物和有生物活性的化合物存在多晶体和无定形体。本领域技术人员可以知道化合物和盐可以以不同的晶形或多晶型形态存在，所有这些形态的化合物均在本发明和具体配方的范围内。

除灵长目动物如人外，本发明的方法可用于治疗多种其它哺乳动物。例如，可以治疗的哺乳动物包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其它猫科、啮齿动物或鼠科物种。然而，该方法还可以用于其它物种如禽类物种(例如，小鸡)。

本文所使用的术语“组合物”是指包括含有特定数量的特定成分的产物，以及任何直接或间接来自特定数量的特定成分的组合的产物。术语“药物组合物”是指包括含活性成分、构成载体的惰性成份以及任何产品的产物，其直接或间接地由任何两种或多种成分混合、络合或聚集，或由一种或多种成分分解，或由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用得到。

因此，本发明的药物组合物包括通过本发明的化合物与药学上可接受的载体混合获得的任何组合物。术语“药学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相溶并且对受试者没有毒害。

术语“给予化合物”和/或“化合物的给药”应该理解为向需要治疗的个体提供本发明的化合物或本发明化合物的前药。

本发明化合物作为二肽基肽酶-IV酶活性抑制剂的实用性可以通过本领域已知的方法证明。抑制常数如下测定。使用带底物Gly-Pro-AMC的连续荧光测定法，其通过DPP-IV裂解而释放荧光AMC离去基团。描述此反应的动力参数如下所示：K_m＝50JAM；k_cat＝75s^-1；k_cat/K_m＝1.5×10⁶M^-1s^-1。在100L总反应体积中，典型反应包含约50pM酶、50μM Gly-Pro-AMC和缓冲液(100mM HEPES，pH7.5，0.1mg/ml BSA)。使用360nm的激发波长和460nm的发射波长，在96孔板荧光计中连续监测AMC的释放。在这些条件下，在25℃下，在30分钟内生成约0.8μM AMC。用于这些研究中的酶是在杆状病毒表达系统(Bac-To-Bac，Gibco BRL)中生成的可溶性(跨膜区和细胞质扩充除外)人蛋白。发现Gly-Pro-AMC和GLP-1的水解动力学常数与天然酶的文献值相符。为了测定化合物的解离常数，向含有酶和底物(最终DMSO浓度是1％)的反应中加入抑制剂在DMSO中的溶液。所有实验都是在室温下使用上述标准反应条件进行的。为了测定解离常数(K_i)，通过非线性回归将反应速率拟合至竞争性抑制的Michaelis-Menton方程式中。解离常数再现的误差典型地小于两倍。

特别地，本发明所提供的式(I)～式(VI)化合物在上述试验中具有抑制二肽基肽酶-IV酶的活性，IC₅₀小于约100nM。这种结果表明所述化合物用作二肽基肽酶-IV酶活性抑制剂的固有活性。

与现有技术相比，本发明具有下列优点：本发明提供了可用于治疗或预防与二肽基肽酶IV有关疾病的化合物及其组合物，以及这些化合物与组合物在治疗多种疾病中的用途。本发明所提供的化合物(I)～(VI)是如结构所示有高光学活性和纯度的单一对映体，除此以外的消旋体和外消旋混合物、非对映体混合物和各非对映体的形式和化合物(I)～(VI)相比，都不能有效抑制二肽基肽酶-IV或具有明显升高的毒副作用。本发明进一步提供了一种从化合物(I)(VI)和它们相应的消旋体和外消旋混合物、非对映体混合物和各非对映体中分离和提纯化合物(I)～(VI)的方法。本发明提供了作为二肽基肽酶抑制剂的一类化合物，且提供了这些化合物及其组合物用于治疗除糖尿病以外的疾病的药物的用途。本发明为糖尿病及潜在的其他疾病，提供了一种新型的改善的治疗途径。

附图说明

图1为化合物(I)、(III)的小鼠的口服糖耐量试验结果曲线图；

图2为化合物(II)、(IV)、(V)、(VI)的小鼠的口服糖耐量试验结果曲线图；

图3为化合物(I)的¹H NMR谱图；

图4为化合物(I)的LC-MS谱图；

图5为化合物(I)的手性HPLC谱图；

图6为化合物(II)的LC-MS谱图；

图7为化合物(III)的LC-MS谱图；

图8为化合物(IV)的LC-MS谱图；

图9为化合物(V)的LC-MS谱图；

图10为化合物(VI)的LC-MS谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

制备化合物(I)

化合物(I)的合成路线和具体步骤如下：

步骤1：合成化合物2

将11.8克(0.037摩尔)化合物1{DL N-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-2，4，5-三氟苯基-丙氨酸，DL N-[(1，1-dimethylethoxy)carbonyl]-2，4，5-trifluorophenyl-alanine，CAS：1367740-01-9，参考文献：合成化学，2011，19(4)，557-560}溶于40毫升THF中，再加入三乙胺5.8毫升(0.042摩尔)，反应冷却到0℃，加入氯甲酸乙酯4.0毫升(0.041摩尔)，在氮气保护下0℃反应1小时，过滤后将过滤液冷却到0℃，缓慢加入硼氢化钠(1.4克，0.057摩尔)在15毫升水中的混合液，搅拌过夜，加入1N HCl酸化，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，碳酸氢钠溶液洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到7.6克产物，即化合物2，收率67％。重复该步骤，制得更多的化合物2，以供后续步骤使用。

步骤2：合成化合物3

将8.2克(0.027摩尔)化合物2溶于40毫升二氯甲烷中，再加入三乙胺4.2毫升(0.030摩尔)，催化量4-二甲氨基吡啶，反应冷却到0℃，加入对甲苯磺酰氯(6.8克，0.035摩尔)，在氮气保护下0℃到室温反应2小时，加入1N HCl酸化，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，碳酸氢钠溶液洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物，即化合物3。重复该步骤，制得更多的化合物3，以供后续步骤使用。

步骤3：合成化合物4

将12.4克(0.027摩尔)化合物3溶于40毫升二甲基甲酰胺中，缓慢加入氰化钠(4.5克，0.092摩尔)在30毫升二甲基甲酰胺中的混合液，室温反应48小时，倒入100毫升冰水中，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析纯化，得到7.8克产物，即化合物4，收率92％。

步骤4：合成化合物5

将3.1克(0.010摩尔)化合物4溶于15毫升6N盐酸中，加热回流过夜，加入2N氢氧化钠溶液中和，冷却干燥。所得固体溶于30毫升THF中，加入20毫升0.5N氢氧化钠溶液，再加入二碳酸二叔丁酯(2.4克，0.011摩尔)，室温反应16小时，浓缩，加入10％硫酸氢钠溶液中和，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到3.3克产物，即，化合物5，收率99％。

步骤5：合成化合物7

化合物6{5，6，7，8-四氢-8-甲基-3-(三氟甲基)-咪唑并[1，5-a]吡嗪，5，6，7，8-tetrahydro-8-methyl-3-(trifluoromethyl)-imidazo[1，5-a]pyrazine，合成见CN103087067，2.1克，0.010摩尔}溶于8毫升二氯甲烷中，加入三乙胺1.2克(0.012摩尔)，化合物5(3.3克，0.010摩尔)，EDCI2.3克(0.012摩尔)，在氮气保护下室温反应24小时，倒入100毫升冰水中，对有机相进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物，溶于2N HCl/甲醇溶液(无水HCl气体溶于甲醇的溶液)100毫升中，室温反应4小时，旋干，冷却，倒入100毫升冰水中，调PH到9，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，并进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到2.8克产物，即化合物7，收率66％。

化合物7包括四个光学异构体，它们的分离和提纯的路线和具体步骤如下所示：

步骤6：制备化合物9A和9B

将2.8克(6.67毫摩尔)化合物7溶于50毫升乙腈中，加入三乙胺1.2克(8.0毫摩尔)，再加入化合物8(1.9克，6.67毫摩尔，参考文献：J.Org.Chem.1995，60(3)，730)，在氮气保护下加热回流过夜，浓缩，加入乙酸乙酯，1N氢氧化钠溶液洗，乙酸乙酯毫升萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩柱层析纯化，得到1.6克9A(43％)和1.4克9B(39％)产物(de＞98％)，结构分析初步确定9A是RR和SS对映体混合物，而9B是RS和SR对映体混合物。所得化合物9A和9B分别留作下一步骤使用。

步骤7：制备化合物10A和10B

将1.5克(2.64毫摩尔)化合物9A溶于50毫升二氯甲烷中，反应冷却到0℃，加入HBr溶液(2M，2.6毫升，5.2毫摩尔)，浓缩后溶于乙酸乙酯，碳酸氢钠溶液洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到产物，即化合物10A(RR和SS对映体混合物)，留作下一步骤使用。

依照同样反应原理、条件和步骤，以化合物9B为起始原料，得到化合物10B(RS和SR对映体混合物)，留作下一步骤使用。

步骤8：制备化合物11A，11B和11C，11D

将步骤7中所得到的化合物10A(1.1克)溶于20毫升乙醇中，加入D-酒石酸0.4克(2.64摩尔)，加热回流0.5小时，冷却，过滤，得到白色固体，再用十倍量乙醇重结晶2次后，得到白色固体，用饱和的碳酸氢钠水溶液游离，得到0.29克化合物11A，即化合物(I)，收率26％，测ee值＞95％。

化合物(I)的¹H NMR、LC-MS及手性HPLC谱图分别如图3、图4和图5所示。

对于图5所示的化合物(I)的手性HPLC谱图，其中：

依照同样反应条件和步骤，以化合物10A为起始物料，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，得到化合物11B。

依照同样反应条件和步骤，以化合物10B为起始物料，使用D-酒石酸，得到化合物11C。

依照同样反应条件和步骤，以化合物10B为起始物料，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，得到11D。

实施例2

制备化合物(II)

合成路线和具体步骤如下所示：

步骤1：合成化合物12

将化合物6(20.6g，0.10摩尔)溶于300毫升THF中，加入200毫升0.5N氢氧化钠溶液，再加入二碳酸二叔丁酯(25.0克，0.012摩尔)，室温反应16小时，浓缩，加入10％硫酸氢钠溶液中和，乙酸乙酯毫升萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到30.3克产物溶于1500毫升二氯甲烷中，加入NBS21.4克(0.012摩尔)，室温反应24小时，反应液倒入3000毫升冰水中，有机相水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到29.6克产物，即化合物12，收率77％。供后续步骤使用。

步骤2：合成化合物13

将7.6克(0.02摩尔)步骤1中所得到的化合物12溶于300毫升甲醇中，加入八羰基二钴20.4克(0.06摩尔)，碳酸钾8.4克(0.06摩尔)，草酰氯单甲酯3.6克(0.3摩尔)，氮气保护下50℃反应24小时，TLC检测没反应完全，继续反应24小时，依然没完全，反应液旋干后直接柱层析得到3.4克产物溶于15毫升二氯甲烷中，加入三氟乙酸2毫升，室温反应2小时，旋去溶剂，加饱和碳酸氢钠游离，乙酸乙酯萃取后旋干得到1.9克产物，即，化合物13，收率36％。供后续步骤使用。

步骤3：合成化合物14

将步骤2中得到的化合物13(1.9克，7.2毫摩尔)溶于8毫升二氯甲烷中，加入三乙胺1.2克(8.7毫摩尔)，化合物5(2.4克，7.2毫摩尔)，EDCI1.36克(7.2毫摩尔)，在氮气保护下室温反应24小时，倒入100毫升冰水中，对有机相进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物溶于2N HCl/甲醇溶液(无水HCl气体溶于甲醇的溶液)100毫升中，室温反应4小时，旋干，冷却，倒入100毫升冰水中，调PH到9，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，并进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到2.6克产物，即化合物14，收率76％。

化合物14含有四个光学异构体，它们的分离、提纯的路线和步骤如下：

步骤4：制备化合物15A和15B

将2.6克(5.4毫摩尔)化合物14溶于50毫升乙腈中，加入三乙胺0.81克(8.0毫摩尔)，再加入化合物8(1.6克，5.5毫摩尔)，在氮气保护下加热回流过夜，浓缩，加入乙酸乙酯，1N氢氧化钠溶液洗，乙酸乙酯毫升萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩柱层析纯化，得到1.5克化合物15A(44％)和1.4克化合物15B(40％)(de＞98％)，结构分析初步确定15A是RR和SS对映体混合物，而15B是RS和SR对映体混合物。

步骤5：制备化合物16A和16B

将上述步骤4制备的1.5克(2.4毫摩尔)化合物15A溶于50毫升二氯甲烷中，反应冷却到0℃，加入HBr溶液(2M，2.4毫升，4.8毫摩尔)，浓缩后溶于乙酸乙酯，碳酸氢钠溶液洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到产物16A(RR和SS对映体混合物，0.96克，82％)。

以化合物15B为原料，依照同样反应条件和步骤，制得化合物16B(RS和SR对映体混合物)。

步骤8：制备化合物17A，17B和17C，17D

将以上制备得到的化合物16A(0.96克)溶于20毫升乙醇中，加入D-酒石酸0.3克(2.00摩尔)，加热回流0.5小时，冷却，过滤，得到白色固体，再用十倍量乙醇重结晶2次后，得到白色固体，用饱和的碳酸氢钠水溶液游离，得到0.32克化合物17A，即化合物(II)，收率33％，测ee值＞95％。

化合物II的LC-MS谱图如图6所示。

依照同样实验条件和步骤，以化合物16A为起始物料，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，得到化合物17B。

依照同样实验条件和步骤，以化合物16B为起始物料，使用D-酒石酸，制备得到化合物17C。

依照同样实验条件和步骤，以化合物16B为起始物料，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，得到化合物17D。

实施例3

制备式(III)的化合物

合成路线和具体步骤如下：

步骤1：合成化合物18

将0.24克(0.5毫摩尔)上述制备的化合物(II)溶于5毫升THF中，加入4毫升0.5N氢氧化钠溶液，再加入二碳酸二叔丁酯(0.13克，0.6毫摩尔)，室温反应16小时，浓缩，加入10％硫酸氢钠溶液中和，乙酸乙酯毫升萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到0.28克产物溶于6毫升THF和3毫升水中，加入氢氧化锂溶液(1M，2.4毫升，2.4毫摩尔)室温反应24小时，旋干，冷却下加入1N的盐酸调PH到4，过滤，水洗，真空干燥得到0.23克产物，即化合物18，收率82％。重复该实验步骤，获得更多化合物18，供后续步骤使用。

步骤2：合成化合物(III)

将上述步骤1中制得的0.23克化合物18溶于5毫升二氯甲烷中，加入三氟乙酸1毫升，室温反应2小时，旋去溶剂，加饱和碳酸氢钠游离，乙酸乙酯萃取后旋干得到0.13克产物，即，化合物(III)，收率67％。

化合物(III)的LC-MS谱图如图7所示。

实施例4

制备化合物(IV)

化合物(IV)的合成路线和具体步骤如下：

具体步骤如下：

步骤1：合成化合物19

将0.28克(0.5毫摩尔)化合物18溶于30毫升二氯甲烷中，加入三乙胺152毫克(1.5毫摩尔)，氯化铵133毫克(2.5毫摩尔)，EDC.HCL191毫克(1.0毫摩尔)，氮气保护下室温反应24小时，反应液倒入10毫升冰水中，有机相水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩后过柱层析纯化得到0.14克产物，即化合物19，收率43％。供后续步骤使用。

步骤2：合成化合物(IV)

将步骤1中所得到的0.14克化合物19溶于3毫升二氯甲烷中，加入三氟乙酸1毫升，室温反应2小时，旋去溶剂，加饱和碳酸氢钠游离，乙酸乙酯萃取后旋干得到0.068克产物，即，式化合物(IV)，收率60％。

化合物IV的LC-MS谱图如图8所示。

实施例5

制备化合物(V)

化合物(V)的合成路线和具体步骤如下所示：

步骤1：合成化合物20

将11.5克(0.03摩尔)化合物12溶于300毫升乙二醇单甲醚中，加入八羰基二钴31克(0.09摩尔)，碳酸钾12.6克(0.09摩尔)，草酰氯单甲酯5.4克(0.45摩尔)，氮气保护下50度反应24小时，TLC检测没反应完全，继续反应24小时，依然没完全，反应液旋干后直接柱层析得到5.4克产物溶于20毫升二氯甲烷中，加入三氟乙酸4毫升，室温反应2小时，旋去溶剂，加饱和碳酸氢钠游离，乙酸乙酯萃取后旋干得到3.0克产物，即化合物20，收率33％。

步骤2：合成化合物21

将上述步骤1得到的化合物20(3.0克，9.8毫摩尔)溶于8毫升二氯甲烷中，加入三乙胺1.2克(12毫摩尔)，化合物5(3.3克，9.8毫摩尔)，EDC.HC12.1克(11毫摩尔)，在氮气保护下室温反应24小时，倒入100毫升冰水中，对有机相进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物溶于2NHCl/甲醇溶液(无水HCl气体溶于甲醇的溶液)100毫升中，室温反应4小时，旋干，冷却，倒入100毫升冰水中，调PH到9，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，并进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到4.2克产物，即化合物21，收率82％。

化合物21包括四种光学异构体，它们的分离和提纯过程如下：

步骤3：制备化合物22A和22B

将上述步骤2制备的4.2克(8.0毫摩尔)化合物21溶于75毫升乙腈中，加入三乙胺1.2克(12毫摩尔)，再加入化合物8(2.5克，8.8毫摩尔)，在氮气保护下加热回流过夜，浓缩，加入乙酸乙酯，1N氢氧化钠溶液洗，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩柱层析纯化，得到2.3克化合物22A(42％)和1.7克化合物22B(32％)产物(de＞98％)，结构分析初步确定化合物22A是RR和SS对映体混合物，而化合物22B是RS和SR对映体混合物。

步骤4：制备化合物23A和23B

将上述制备的2.3克(3.4毫摩尔)化合物22A溶于50毫升二氯甲烷中，反应冷却到0℃，加入HBr溶液(2M，3.4毫升，6.8毫摩尔)，浓缩后溶于乙酸乙酯，碳酸氢钠溶液洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到产物23A(RR和SS对映体混合物，1.3克，74％)。

依照同样反应条件和步骤，以化合物22B为起始原料，制备得到化合物23B(RS和SR对映体混合物)。

步骤5：制备化合物24A，24B和24C，24D

将上述制备的化合物23A(1.3克)溶于20毫升乙醇中，加入D-酒石酸0.39克(2.6毫摩尔)，加热回流0.5小时，冷却，过滤，得到白色固体，再用十倍量乙醇重结晶2次后，得到白色固体，用饱和的碳酸氢钠水溶液游离，得到0.50克化合物24A(即化合物V，收率37％)，测ee值＞95％。

化合物V的LC-MS谱图如图9所示。

依照同样条件和实验步骤，以化合物23A为起始物料，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，制备得到化合物24B。

依照同样条件和实验步骤，以化合物23B为起始物料，使用D-酒石酸，制备得到化合物24C。

依照同样条件和实验步骤，以化合物23B为起始物料，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，制备得到化合物24D。

实施例6

制备化合物(VI)

化合物(VI)的合成路线和步骤如下：

步骤1：合成化合物25

将11.5克(0.03摩尔)化合物12溶于300毫升乙二醇中，加入八羰基二钴31克(0.09摩尔)，碳酸钾12.6克(0.09摩尔)，草酰氯单甲酯5.4克(0.45摩尔)，氮气保护下50度反应24小时，TLC检测没反应完全，继续反应24小时，依然没完全，反应液旋干后直接柱层析得到3.8克产物溶于20毫升二氯甲烷中，加入三氟乙酸3毫升，室温反应2小时，旋去溶剂，加饱和碳酸氢钠游离，乙酸乙酯萃取后旋干得到2.2克产物，即，化合物25，收率25％。

步骤2：合成化合物26

化合物25(2.2克，7.5毫摩尔)溶于8毫升二氯甲烷中，加入三乙胺1.15克(11.3毫摩尔)，化合物5(2.5克，7.5毫摩尔)，EDC.HCl1.7克(9.0毫摩尔)，在氮气保护下室温反应24小时，倒入100毫升冰水中，对有机相进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物溶于2N HCl/甲醇溶液(无水HCl气体溶于甲醇的溶液)100毫升中，室温反应4小时，旋干，冷却，倒入100毫升冰水中，调PH到9，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，并进行水洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化得到3.2克产物，即化合物26，收率85％。

化合物26包括四种光学异构体，它们的分离和提纯过程如下：

步骤3：制备化合物27A和27B

将3.2克(6.3毫摩尔)化合物26溶于50毫升乙腈中，加入三乙胺0.75克(7.5毫摩尔)，再加入化合物8(1.8克，6.3毫摩尔)，在氮气保护下加热回流过夜，浓缩，加入乙酸乙酯，1N氢氧化钠溶液洗，乙酸乙酯毫升萃取三次，合并有机相，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩柱层析纯化，得到1.7克化合物27A(40％)和1.4克化合物27B(35％)，产物(de＞98％)，结构分析初步确定化合物27A是RR和SS对映体混合物，而化合物27B是RS和SR对映体混合物。

步骤4：制备化合物28A和28B

将1.7克(2.6毫摩尔)化合物27A溶于50毫升二氯甲烷中，反应冷却到0℃，加入HBr溶液(2M，2.6毫升，5.2毫摩尔)，浓缩后溶于乙酸乙酯，碳酸氢钠溶液洗，饱和盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到产物，即化合物28A(RR和SS对映体混合物，1.1克，78％)。

依照同样反应条件和步骤，以化合物27B为起始物料，制备得到化合物28B(RS和SR对映体混合物)。

步骤5：制备化合物29A，29B和29C，29D

将上述制备的化合物28A(1.1克)溶于20毫升乙醇中，加入D-酒石酸0.33克(2.2毫摩尔)，加热回流0.5小时，冷却，过滤，得到白色固体，再用十倍量乙醇重结晶2次后，得到白色固体，用饱和的碳酸氢钠水溶液游离，得到0.25克29A(即化合物VI，收率23％)，测ee值＞95％。

化合物IV的LC-MS谱图如图10所示。

以化合物28A为起始物料，依照同样实验条件和步骤，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，制备得到化合物29B。

以化合物28B为起始物料，依照同样实验条件和步骤，使用D-酒石酸，制备得到化合物29C。

以化合物28B为起始物料，依照同样实验条件和步骤，使用L-酒石酸代替D-酒石酸，得到化合物29D。

在以上的各实施例中，各步骤可根据实际需要进行多次重复，比如后续步骤还需要更多的该步骤中的产物作为起始物料，则多次重复该实验步骤以获得更多产物供后续步骤使用。

抑制二肽基肽酶-IV酶活性测定

本发明化合物作为二肽基肽酶-IV酶活性抑制剂的实用性可以通过本领域已知的方法证明。抑制常数按照如下方法测定。使用带底物Gly-Pro-AMC的连续荧光测定法，其通过DPP-IV裂解而释放荧光AMC离去基团。描述此反应的动力参数如下所示：K_m＝50JAM；k_cat＝75s^-1；k_cat/K_m＝1.5×106M^-1s^-1。在1001总反应体积中，典型反应包含约50pM酶、50μM Gly-Pro-AMC和缓冲液(100mM HEPES，pH7.5，0.1mg/ml BSA)。使用360nm的激发波长和460nm的发射波长，在96孔板荧光计中连续监测AMC的释放。在这些条件下，在25℃下，在30分钟内生成约0.8μM AMC。用于这些研究中的酶是在杆状病毒表达系统(Bac-To-Bac，Gibco BRL)中生成的可溶性(跨膜区和细胞质扩充除外)人蛋白。发现Gly-Pro-AMC和GLP-1的水解动力学常数与天然酶的文献值相符。为了测定化合物的解离常数，向含有酶和底物(最终DMSO浓度是1％)的反应中加入抑制剂在DMSO中的溶液。所有实验都是在室温下使用上述标准反应条件进行的。为了测定解离常数(K_i)，通过非线性回归将反应速率拟合至竞争性抑制的Michaelis-Menton方程式中。解离常数再现的误差典型地小于两倍。

化合物	DPP-IV IC50(nM)
		I(11A)	2.6
11B	＞10000
		11C	538
11D	＞10000
		II(17A)	6.8
17B	＞10000
		17C	720
17D	＞10000
		III	3.3
IV	30.9
		V(24A)	4.1
24B	＞10000
		24C	1300
24D	＞10000
		VI(29A)	4.3
29B	＞10000
		29C	1100
29D	＞10000
		西它列汀	18

和化合物I(11A)相比，立体化学异构体化合物11B和11D几乎没有抑制DDP-IV的作用，而立体化学异构体11C和I(11A)相比相差大体两百倍。化合物II，V和VI与它们各自相应的立体化学异构体显示出和化合物I类似的结果。

化合物(I)，(II)，(III)，(V)和(VI)的二肽基肽酶-IV半抑制浓度都远远优于西它列汀。

最大耐受剂量(MTD)测定

化合物按一定剂量单次口服给小鼠给药；给药前禁食过夜，给药后两个小时给食，观察5天，每天测量体重；

实验动物及分组：

1.2000mg/kg

2.1000mg/kg

X表示老鼠死亡。

化合物(I)，即化合物(11A)，在五天后小鼠体重没有降低，最大耐受剂量超过2000mg/kg，而化合物11B，11C和11D最大耐受剂量低于1000mg/kg，其中11C有明显毒性。

小鼠的口服糖耐量实验

从上述的DPP-IV酶活性抑制试验中，化合物(I)～(VI)具有优异的二肽基肽酶IV抑制活性，因此对其进一步进行了口服糖耐量研究。

试验药物：化合物(I)～(VI)。

实验动物为雄性昆明种小鼠，7-12周龄，体重为20-25g。

实验方法：将小鼠随机分为7组，每组10只，小鼠实验前禁食24小时，不禁水。试验前1小时，从小鼠的尾静脉取血，测定小鼠的基线血糖浓度。然后，经口给予2组小鼠载体物(0.25％的甲基纤维素，5mL/kg)，给予6组小鼠上述试验药物(I)～(VI)(3.0mg/kg，5mL/kg)。给药后1小时，测定血糖浓度。然后，经口给予小鼠葡萄糖(5g/kg，10mL/kg)，给予葡萄糖后20，40，60和120分钟时，从尾静脉采血测定血糖浓度。绘制从t＝0min到t＝120min的血糖浓度经时曲线。

化合物(I)，(III)试验结果，如图1所示。

化合物(II)，(IV)，(V)，(VI)试验结果，如图2所示。

如图所示，和空白对照相比，口服化合物I～VI都有降糖的效果。

化合物(I)的大鼠药代动力学实验

实验方法：采用有机溶剂沉淀蛋白进行血浆样品预处理，以LC-MS法测定大鼠血浆中的化合物(I)浓度。

1.动物给药和采血：SD大鼠禁食16小时。

口服给药：化合物(I)溶解于口服溶剂。大鼠以20mg/kg剂量(10ml/kg)灌胃，重复3只大鼠。注射给药：化合物(I)溶解于静脉注射溶剂。以5mg/kg剂量(1ml/kg)尾静脉注射，重复2只大鼠。给药后口服给药大鼠每隔0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24小时眼眶后静脉丛取血750μl，肝素钠管抗凝，静脉注射给药大鼠每隔0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24小时眼眶后静脉丛取血约750μl，血液3500r/min离心10min，取250μl上清，-20C保存。

2.血浆样品预处理：取血浆100μL，加入50μL内标，250μL甲醇，混匀，15500rpm离心，取上清150μL，与150μL混匀，取200μL于进样瓶。

3.标准曲线：用甲醇将标样贮备液稀释成5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL的标样，用甲醇将内标贮备液稀释成500ng/mL。

取动物血浆100μL，加入100μL标样，加入50μL内标，加入150μL甲醇，混匀，15500rpm离心，取上清150μL，与150μL混匀，取200μL于进样瓶。

4.QC：用甲醇将标样贮备液稀释成200、2000、20000ng/mL，分别吸取20μL于480μL空白血浆，混匀，相当于血浆含药分别为8、80、800μg/mL，按样品方法处理，制成低中高QC样品。

5.HPLC分析。

化合物(I)的药代结果如下：

根据默克公司报导，大鼠药代动力学实验显示西它列汀半衰期为1.7小时，生物利用度为65％，均低于化合物(I)。

以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属技术领域中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内进行多种多样的变更。

Claims (5)

1.一种如下式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）及（VI）中任一化学式所表示的化合物及其药学上可接受的盐或前药，

；

；

；

；

；

。

2. 一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1中任一化学式所表示的化合物和惰性载体。

3.权利要求1中任一化学式所表示的化合物作为制备用于抑制二肽基酶活性的药物的用途。

4.权利要求1中任一化学式所表示的化合物作为制备治疗、控制或预防哺乳动物中II型糖尿病药物的用途。

5.权利要求1中任一化学式所表示的化合物作为制备治疗、控制或预防哺乳动物中高血糖症药物的用途。

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