CN103348240A - 分析牙斑的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在牙斑样品中测量氨和/或钙的方法，所述方法包括得到斑样品和使用毛细管电泳测量铵和钙离子，以及基于对斑的评价，诊断、治疗和筛分的方法。

Description

分析牙斑的方法

发明领域

本发明涉及使用毛细管电泳(capillary electrophoresis)在斑中检测氨、钙和酸的方法。

发明背景

在龋齿的初始发展中，口腔中的某些细菌代谢糖以制备有机酸作为产物。这些有机酸中的一些包括甲酸、琥珀酸、丁酸、丙酸、乙酸和乳酸。这种生酸的细菌(acidogenic bacteria)接近牙齿表面，并且酸与表面接触，最终引起牙釉质破坏或去矿化。这种产生的频率和与牙釉质接触得越长，最终发展成为龋齿损害的去矿化的程度越大。在斑暴露于蔗糖挑战之后，乳酸特别提高，并且已显示为使牙齿去矿化产生的更多有害的酸之一。

然而，不是口腔中的所有细菌都是生龋的或破坏性的。在口中生物群落(bioflora)的类型通常在发展洞和口腔健康中起到显著的作用。例如，已提出精氨酸和其它碱性氨基酸用于口腔护理，并且相信在抗击洞形成和牙齿灵敏度中具有显著的益处。已推测精氨酸的有益作用的显著因素在于精氨酸和其它碱性氨基酸可被某些类型的细菌，例如，血链球菌(S. sanguis)代谢，它们不生龋并且与生龋的细菌例如变形链球菌(S. mutans)竞争在牙齿上和在口腔中的位置。分解精氨酸的细菌(arginolytic bacteria)可使用精氨酸和其它碱性氨基酸来产生氨，从而提高它们的环境的pH，而生龋的细菌代谢糖以产生乳酸，其倾向于降低斑pH和使牙齿去矿化，最终导致洞。

在开发新的组合物和用于口腔护理的方法中，可期望集中于抑制、破坏或特别是阻碍引起破坏的那些细菌，而不是简单地使用杀灭所有细菌的方法，和/或集中于中和或分散具有破坏性的酸的方法。

毛细管电泳(例如毛细管区域电泳)通过电荷、摩擦力和流体动力学半径分离各离子种类。在传统的电泳中，在电场的影响下，带电荷的分析物在传导性液体介质中移动。在填充电解质的小的毛细管的内部，毛细管电泳基于它们的尺寸与电荷比率来分离离子。

毛细管电泳已用于测量斑中的酸。参见，例如，Damen J.J.M.等，Caries Research (2002) 36：53-57。WO 2009/100262 (通过引用结合到本文中)公开了监测斑中的酸和氨二者，但是由血浆诊断试剂盒改编的用于测量氨的方法耗时，耗时约一周来完成。该方法也不适合高处理量使用。

因此，在研究斑形成和牙齿腐烂中，和在开发用于口腔护理的新的组合物和方法中，有用的是具有一种简单、快速、容易使用的方法来测量氨产生和任选斑的酸化，其可允许人们评价在斑中有益的和任选还生龋的细菌的存在和活动，以及评价患者的疾病状态，和口腔护理组合物和方法的有效性。此外，具有更有效的方式来监测口中生物群落(bioflora)的类型，例如，以确定最优治疗和监测治疗的有效性将是有用的。

发明概述

本发明提供了一种用于测量斑样品中的氨和/或钙和任选的酸的简单的、容易使用的方法。在开发改进的口腔护理产品和方法以及诊断和治疗方法中，所述方法可用于高处理量使用。所述方法包括得到斑样品和使用毛细管电泳测量氨和/或钙和任选的酸。例如，在一个实施方案中，所述方法(方法1)包括以下步骤：

a. 得到斑样品；

b. 用水稀释样品；

c. 加热样品至例如足以杀灭细菌和释放离子进入溶液中；

d. 分离样品的液体部分，例如使用离心和/或过滤；

e. 将液体部分与以下试剂合并：

　　i. 允许镁离子与钙离子电泳分离的试剂，例如羟基异丁酸，

　　ii. 允许钾离子与铵离子电泳分离的试剂，例如18冠6醚，

　　iii. 包含碱性试剂(例如，咪唑)和酸性试剂的缓冲剂，其可任选与络合剂i或ii中的一个(例如，羟基异丁酸)相同，例如，缓冲液体至约pH 4-5，例如约pH 4.3；

f. 使步骤e的产物通过毛细管，其中在毛细管的一端和另一端之间存在电位，所述电位足以诱导离子通过管的电泳流动；

g. 在已通过至少一部分毛细管的液体中检测铵离子和/或钙离子，例如，使用紫外或紫外-可见吸光度、质谱、表面增强的拉曼光谱学或其它检测手段。

因此，方法1包括以下方法：

1.1. 方法1，其中在步骤a中，斑得自人患者；

1.2. 方法1或1.1，其中在步骤b中，将斑稀释至约0.01-0.1 mg斑/mL水的浓度，例如，约0.03-0.04 mg斑/ml水；

1.3. 前述方法中的任一种，其中在步骤c中，将样品加热至60-95℃，例如约80℃，随后冷却至低于10℃，例如约4℃；

1.4. 前述方法中的任一种，其中在步骤d中，通过离心样品，移出这样得到的上清液，和过滤上清液，分离液体部分；

1.5. 前述方法中的任一种，其中在步骤e中，允许镁离子与钙离子电泳分离的试剂选自羟基异丁酸、乳酸、丙二酸和酒石酸；

1.6. 前述方法，其中在步骤e中，允许镁离子与钙离子电泳分离的试剂为羟基异丁酸；

1.7. 前述方法中的任一种，其中在步骤e中，允许钾离子与铵离子电泳分离的试剂选自中性冠醚和环果聚糖(cyclofructans)；

1.8. 前述方法，其中在步骤e中，允许钾离子与铵离子电泳分离的试剂为18冠6醚；

1.9. 前述方法中的任一种，其中在步骤e中，缓冲剂包含有机碱；

1.10. 前述方法中的任一种，其中在步骤e中，缓冲剂包含咪唑；

1.11. 前述方法中的任一种，其中在步骤e中，将液体部分与咪唑(例如约5-7 mM，例如约6mM)、羟基异丁酸(例如，约1-2 mM，例如约2.5 mM)和18冠6醚(例如约2-3 mM，例如，约2.5 mM)合并；

1.12. 前述方法中的任一种，其中在步骤e的产物中，pH为约4-5，例如约pH 4.3；

1.13. 前述方法中的任一种，其中在步骤f中，电位为约5-30 kV；

1.14. 前述方法中的任一种，其中在步骤g中，检测手段为UV-Vis吸收。

方法1还可任选提供测量斑样品中的酸，例如，方法1包括使用毛细管电泳来测量斑样品中的酸的另外的步骤；例如，方法1包括以下另外的步骤：

h. 将通过步骤d得到的液体部分分离成为第一部分和第二部分,

i. 对第一部分进行步骤e、f和g。

j. 使缓冲剂与第二部分合并，例如，2,6吡啶二甲酸和十六烷基三甲基溴化铵，例如，缓冲至约pH 5-6，例如，约pH 5.66,

k. 使前述步骤的产物通过毛细管，其中在毛细管的一端和另一端之间存在电位，所述电位足以诱导离子通过管的电泳流动；

l. 在已通过至少一部分毛细管的液体中，检测酸阴离子，例如，乳酸根、琥珀酸根、乙酸根和/或丙酸根阴离子，例如乳酸根离子，例如，使用紫外或紫外-可见吸光度、质谱、表面增强的拉曼光谱学或其它检测手段。

在另一实施方案中，本发明测量斑氨产生水平，以测定分解精氨酸的细菌的相对种群，和任选另外测量斑乳酸水平，以测定生龋的细菌的相对种群。

在另一实施方案中，本发明量化至少一种分解精氨酸的细菌(例如，血链球菌)和任选的至少一种生龋的细菌(例如，变形链球菌)的水平，并且例如，使用一种或多种以下技术，例如，在WO 2009/100262 (通过引用结合到本文中)中描述的：

a. 聚合酶链反应(PCR)，例如定量实时PCR，以表征口中(例如，在斑或唾液中)的生物群落(bioflora)；

b. 逆转录酶PCR (RT-PCR)，以表征口中(例如，在斑或唾液中)的生物群落；和/或

c. 抗体探针(例如，荧光抗体探针)用于表征口中(例如，在斑或唾液中)的生物群落。

在另一实施方案中，使用前述方法中的一种来评价来自患者的斑样品，并因此按照规定处理。例如，本发明的方法可特别用于检测斑生态学的潜在破坏性变化，和在对牙齿存在可测量的或显著的去矿化或破坏之前允许矫正性治疗。

因此，本发明提供增强口腔健康的方法，例如，降低斑聚集；治疗、减轻或降低口干；增白牙齿；增强全身健康，包括心血管健康，例如，通过降低经由口腔组织使全身感染的可能性；免疫牙齿以对抗生龋的细菌和它们的作用；清洁牙齿和口腔和/或降低牙齿的腐蚀，所述方法包括测量口腔的生物群落，例如，使用前述方法中的任一种，例如，方法1等，并且如果适宜，给予包含有效量的碱性氨基酸或其盐(例如，精氨酸)的口腔护理产品。

本发明还提供了游离的或盐形式的碱性氨基酸用于制备药物中的用途，所述药物用于增强受试者的口腔健康，如根据本发明的方法(例如，方法1等)所测量的，受试者的口腔生物群落包含升高水平的生龋的细菌和/或升高的乳酸根水平，和/或低水平的分解精氨酸的细菌和/或低水平的斑氨产生。

本发明还提供了一种从美容方面增强口腔(其中这样的美容增强可包括例如使牙齿更白和/或降低口臭)的方法，所述方法包括使用依据本发明的方法(例如，方法1等)测量口腔的生物群落，并且如果通过存在升高水平的生龋的细菌和/或升高的乳酸根水平，和/或存在低水平的分解精氨酸的细菌和/或低水平的斑氨产生所指示的，给予包含游离的或盐形式的碱性氨基酸的口腔护理产品。

本发明还提供了一种评价口腔护理组合物在促进分解精氨酸的细菌和任选抑制生龋的细菌的功效的方法，所述方法包括使用方法1等的方法来测量斑中的铵水平。

附图概述

图1为在糖挑战之后，对斑样品测量阳离子(例如铵和钙)的UV吸光度光谱。

图2为在糖挑战和对照之后，对斑样品测量酸阴离子的UV吸光度光谱。

发明详述

牙斑将精氨酸转化为氨的能力为分解精氨酸的(arginolytic)活性的标志。某些细菌具有将精氨酸转化为氨的能力，就好像某些细菌可将糖转化为酸一样。有益的是提高分解精氨酸的种类的相对浓度，因为这些细菌产生不利于生龋的细菌繁殖的条件，生龋的细菌的繁殖偏爱酸性条件并且提高龋齿风险。预期每天使用精氨酸以产生斑生态学转变，其采用类似的方式偏爱分解精氨酸的细菌，使得频繁消耗糖产生偏爱产生酸的细菌的条件。氨为能中和酸并且有助于保持中性斑pH的碱。中性pH条件对于非致病性细菌更有利。测量氨产生衡量能将精氨酸转化为氨的所有细菌的贡献。因此，在一些方面，该方法比用于评价斑生物群落的其它方法，例如实时PCR方法(以下进一步描述)优越，实时PCR方法测量所选的分解精氨酸的细菌的浓度并且不区分代谢活性(活的)与非活性(死的)细菌。

就像测量氨水平用作测量分解精氨酸的细菌的水平的代表指标，乳酸用作代表测量生龋的细菌的水平的代表指标。因此，由相同的样品测量铵和乳酸盐二者可能具有重要性。

用于毛细管电泳的主要分离模式包括毛细管区域电泳、胶束动电毛细管层析法、毛细管等速电泳法、毛细管凝胶电泳和毛细管等电位聚焦。在具体的实施方案中，本发明使用毛细管区域电泳。通常，在毛细管中的流动为从阳极到阴极，因此阳离子倾向于比电-渗透流动更快速地迁移通过毛细管，而阴离子被它们的电荷减慢，变得更缓慢地通过。具有类似的电荷和尺寸的分析物可使用较大的化合物分离，比起另一个离子，所述较大的化合物倾向于与一个离子更强地络合，从而允许分离。

例如，钾和铵在咪唑电解质系统中具有类似的电泳流动性。分离是可能的，然而，需要加入中性冠醚(例如18冠6醚)或环果聚糖。这样的化合物与钾形成络合物，提高其尺寸并且减慢其迁移时间。这导致对于铵和钾两种不同的迁移时间，允许用于峰值鉴定和定量铵。

钙和镁也共同迁移弱的螯合剂例如羟基异丁酸(HIBA)，允许分离这些离子。另外，HIBA改变钠和钙的迁移顺序。当不加入HIBA时，钠在钙之前迁移。当加入络合剂时，该顺序相反。这一点是有利的，因为当首先迁移钠并且为高浓度时，其可与钙峰重叠，留下钙峰不能检测到。参见图1的电泳图谱。因此，这也是有用的工具和方法来检测是否从口腔护理产品中递送钙，或者，相反，在去矿化中牙齿矿物质是否缺失钙。

在一个实施方案中，用于毛细管电泳分析铵和钙水平的缓冲剂系统包含咪唑、羟基异丁酸和18冠6醚。因此，该系统包括两种络合剂，以优化和分离峰迁移。

实施例1－斑中的铵和钙

采取未经早晨口腔卫生保健并且前一天晚上也没有吃或喝的受试者的斑。它们用10%蔗糖溶液漂洗2分钟。8分钟后，通过刮牙齿表面来收集斑。在事先称重的管中在冰上收集斑样品，和测定斑重量。使用超纯水使浓度归一化。将斑稀释至约0.03-0.04 mg斑/mL水的最终近似浓度，并且在4℃下在水中降速30秒。斑随后被涡流至溶液中，然后加热至80℃下保持5分钟，以杀灭细菌和向溶液中释放离子。随后将斑放置在冰/水浴中经另外5分钟。随后在4℃下，将斑溶液在13,000 rpm下离心15分钟。快速除去上清液，并且在4℃下，在12,000 rpm下通过0.2微米尼龙离心过滤器过滤3分钟。上清液随后通过毛细管电泳来分析或储存于-80℃。用于毛细管电泳分析的缓冲剂系统为10 mM咪唑、6.0 mM羟基异丁酸、2.5 mM 18冠6醚，pH 4.3。

图1为使用该方法在糖挑战后斑的毛细管电泳分析的一个实例。

实施例2－斑中的酸

斑样品如实施例1制备。所用的缓冲剂系统不同：20 mM 2,6吡啶二甲酸和0.5 mM十六烷基三甲基溴化铵，pH 5.66。图2为使用该方法，对照和在糖挑战后，斑的毛细管电泳分析的一个实例。

除了测量斑中的乳酸以外，该方法还测量斑中的琥珀酸、乙酸和丙酸。这些有机酸在龋齿过程和在随后的损害形成中也是重要的。由于有机酸具有很少的紫外(UV)吸光度或不具有紫外(UV)吸光度，使用2,6-吡啶二甲酸作为背景电解质(BGE)完成检测。在该间接检测方法中，BGE具有强UV吸收性质并且在UV检测器中产生高背景吸收。在不存在非吸收分析物下，背景信号恒定。当引入离子分析物时，基于电荷对电荷，它们代替UV吸收添加的离子，导致相对于高UV吸收基线的负峰。使用该分析，在0.5 psi下加压注射样品10秒。在-25 kV下实施分离，并且毛细管恒温在25℃。用于间接UV检测的波长选择为254 nm，并且具有负峰的信号反转，以得到更加熟悉的电泳图谱，以积分和处理。为了校正注射误差，结合1.5 mM硝酸钠内标测试每一个样品，并且使用乳酸钠标准物(Sigma，St. Louis，MO，USA)构建校准曲线。基于(乳酸盐/硝酸盐)峰面积的比率和初始斑重量，测定在斑样品中存在的乳酸盐的浓度。

还实施临床研究来测试该方法的有效性。研究的目的是通过将斑暴露于已知的酸还原剂(acid reducer)，氯己定来评价开发用于测量在斑样品中酸产生的方法。该研究为单一设计。6名满足包括/排除标准的受试者登记研究。登记后，受试者使用Colgate MaxFresh一周。清除期后，受试者用水漂洗30秒用于基线评价。在逝去30分钟的时间后，受试者用10%蔗糖溶液漂洗2分钟，接着8分钟后收集斑。48小时后，受试者进行另一次斑收集，并且用氯己定漱口水漂洗30秒。在逝去30分钟的时间后，受试者用10%蔗糖溶液漂洗2分钟，接着8分钟后收集斑。在24小时中重复该过程。结果显示在已暴露于氯己定漂洗的斑中产生显著较少的乳酸盐(对于处理1，p=0.002，而对于处理2，p=0.05)。结果验证用于测量乳酸盐产生并且将其用作酸产生的标记的方法。

Claims (13)

1. 一种在牙斑样品中测量氨和/或钙的方法，所述方法包括得到样品和使用毛细管电泳测量斑中的铵和钙离子。

2. 权利要求1的方法，所述方法包括以下步骤：

a. 得到斑样品；

b. 用水稀释样品；

c. 加热样品至足以杀灭细菌和释放离子进入溶液中；

d. 分离样品的液体部分；

e. 将液体部分与以下试剂合并：

　　i. 允许镁离子与钙离子电泳分离的试剂，

　　ii. 允许钾离子与铵离子电泳分离的试剂，和

　　iii. 包含碱性试剂和酸性试剂的缓冲剂，其可任选与允许离子分离的试剂i或ii中的一个相同；

f. 使步骤e的产物通过毛细管，其中在毛细管的一端和另一端之间存在电位，所述电位足以诱导离子通过管的电泳流动；

g. 在已通过至少一部分毛细管的合并的液体部分中检测铵离子和/或钙离子。

3. 权利要求2的方法，其中在步骤b中，将斑稀释至约0.01-0.1 mg斑/mL水的浓度。

4. 权利要求2-3中任一项的方法，其中在步骤c中，样品被加热至60-95℃。

5. 权利要求2-4中任一项的方法，其中在步骤e中，允许镁离子与钙离子分离的试剂选自羟基异丁酸、乳酸、丙二酸和酒石酸。

6. 权利要求5的方法，其中在步骤e中，允许镁离子与钙离子分离的试剂为羟基异丁酸。

7. 权利要求2-6中任一项的方法，其中在步骤e中，允许钾离子与铵离子分离的试剂选自中性冠醚和环果聚糖。

8. 权利要求2-7中任一项的方法，其中在步骤e中，允许钾离子与铵离子分离的试剂为18冠6醚。

9. 权利要求2-8中任一项的方法，其中在步骤e中，液体部分与咪唑、羟基异丁酸和18冠6醚合并。

10. 权利要求1的方法，所述方法还包括使用毛细管电泳测量斑样品中的酸。

11. 一种测量在斑中分解精氨酸的细菌的相对种群的方法，所述方法包括使用权利要求1的方法测量斑氨产生水平，和任选另外测量斑乳酸水平，以测定生龋的细菌的相对种群。

12. 一种增强口腔健康、降低斑聚集；治疗、减轻或降低口干；增白牙齿；增强全身健康，包括心血管健康；免疫牙齿对抗生龋的细菌和它们的作用；清洁牙齿和口腔和/或降低牙齿的腐蚀的方法，所述方法包括通过权利要求1的方法测量患者中的斑氨水平，和，如果适宜，给予患者包含有效量的碱性氨基酸或其盐的口腔护理产品。

13. 一种评价口腔护理组合物在促进分解精氨酸的细菌和任选抑制生龋的细菌的功效的方法，所述方法包括使用权利要求1的方法测量斑中的铵水平。

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